LANDSKAPSARKITEKTUR TRÄDGÅRD VÄXTPRODUKTIONSVETENSKAP Rpportserie Alkylresorcinoler i rågkli kn nvänds mot lgringssjukdomr i ekologisk äppelodling Alkylresorcinols in rye rn cn e used ginst storge diseses in orgnic pple production Irhim Thir 1, Ester Szwjcer Dey 2 och Hilde Nyom 1 1 Sveriges lntruksuniversitet, Fkulteten för lndskpsrkitektur, trädgårds- och växtproduktionsvetenskp, Institutionen för växtförädling, 2 Lunds universitet, Kemisk institutionen Sveriges lntruksuniversitet Fkulteten för lndskpsrkitektur, trädgårds- och växtproduktionsvetenskp Rpport 2016:7 ISBN 978-91-576-8927-6 Alnrp 2016
LANDSKAPSARKITEKTUR TRÄDGÅRD VÄXTPRODUKTIONSVETENSKAP Rpportserie Alkylresorcinoler i rågkli kn nvänds mot lgringssjukdomr i ekologisk äppelodling Alkylresorcinols in rye rn cn e used ginst storge diseses in orgnic pple production Irhim Thir 1, Ester Szwjcer Dey 2 och Hilde Nyom 1 1 Sveriges lntruksuniversitet, Fkulteten för lndskpsrkitektur, trädgårds- och växtproduktionsvetenskp, Institutionen för växtförädling, 2 Lunds universitet, Kemisk institutionen Projektet hr finnsierts v SLU-EkoForsk Sveriges lntruksuniversitet Fkulteten för lndskpsrkitektur, trädgårds- och växtproduktionsvetenskp Rpport 2016:7 ISBN 978-91-576-8927-6 Alnrp 2016
Smmnfttning Svmpsjukdomr leder oft till en krftigt reducerd produktivitet i ekologisk äppelodling jämfört med konventionell eller IP-odling. Dett eror främst på tt det inte finns någr kemisk medel som är godkänd för kontroll v lgringssjukdomr innn eller efter skörd. Det ekonomisk ortfllet lir speciellt kännrt när redn skördd och lgrd frukt ngrips och förstörs. Hittills hr mn därför tvingts tt förkort lgringstiden för ekologiskt odld frukt vilket leder till lägre pris i producentledet smt otillräcklig tillgång för konsumenter som vill h inhemsk, ekologiskt odld frukt. Målsättningen för dett projekt hr vrit tt utveckl ett preprt med ioktiv ämnen som kn motverk svmpsjukdomrn. Rågkli, som estår v rågkornets ytterst skikt, är en hittills underutnyttjd iprodukt från svensk rågodling. Ur rågkli kn mn utvinn olik icke-toxisk fenollipider som exempelvis lkylresorcinoler (AR). Dess ämnen hr vist sig kunn inhier tillväxten v olik rödsvmpr. Under perioden 2011 2015 undersöktes om ngreppen v lgringssjukdomr lir mindre om äpplen ehndls med AR innn eller efter skörd. Dett gällde såväl spontn svmpngrepp hos lgrd frukt som skdor uppkomn efter inokulering v frukten med sporer v olik lgringssvmpr. Även inverkn v AR-esprutning v fruktträd i fält på svmpngrepp under kyllgring studerdes. I den först delen v projektet inokulerdes redn skördd frukt v olik svenskodlde äppelsorter med sporer v tre viktig svmpr (grönmögel Penicillium expnsum, lenticellröt eller 'gloeosporium-röt' Neofre spp. och itterröt Colletotrichum cuttum) och ehndldes med ett ntl olik ARlösningr. Behndld frukt visde generellt sett mindre skdor jämfört med oehndld frukt. Sorter som Gloster, med reltivt liten mottglighet, drog mest nytt v skyddet från AR-lösningrn. ARkoncentrtionen i lösningen (= 0,025 0,2%) vr korrelerd med dimetern på den uppkomn rötn (lesionen). I den ndr delen v projektet undersöktes effekten v AR-ehndling i en ekologisk odling, där träden (Röd Arom) sprutdes vid olik tillfällen under säsongen. Frukt som skördts från såväl ehndlde som oehndlde träd undersöktes därefter vseende vkstning, storlek, inre kvlitet och lgringsduglighet. En viss negtiv effekt, särskilt efter tidig ehndling (juni och juli) på vkstningen noterdes. AR-ehndling påverkde däremot inte fruktens kvlitet, vre sig vid skörd eller efter lgring. Mängden ngripen fllfrukt (främst fruktmögel M. fructigen) vr lägre under AR-ehndlde träd; räknt över ll försöksled och åd säsongern (2014 och 2015), vr det 43% mindre fllfrukt under AR-ehndlde träd jämfört med under träd som ehndlts med en kontrollösning utn AR. Jämfört med frukt från oehndlde träd, minskde AR-ehndling de totl svmpngreppen i lgrd frukt med 55 60% under 2014 och med 57 72% under 2015. Antlet ehndlingstillfällen hde ingen inverkn men tidpunkten för ehndlingen hde däremot en signifiknt effekt; senre ehndling (ugusti och septemer) minskde det totl svmpngreppet jämfört med tidigre ehndling (juni). Speciell uppmärksmhet ägndes åt fyr olik lgringssjukdomr. AR-ehndling hde stor effekt på fruktmögel under åd säsongern, med 70 90% färre skdor jämfört med kontrollehndlingen. AR hde även stor effekt på lenticellröt: skdorn minskde med 40 50% jämfört med kontrollehndling. AR hde positiv inverkn på itterröt enrt under 2015, då svmpngreppet lev 60% lägre än efter ehndling med kontrollösning. En komintion v AR-ehndling och ULO-lgring ledde även till minskde skdor v grönmögel. 4
Exkt hur AR påverkr svmprn är inte känt. Men odling v svmprn på grplttor visde tt AR hämmr myceltillväxt, virulens och livsduglighet. En positiv korreltion melln AR-koncentrtionen och inhieringseffekten noterdes också. Ytterligre fältförsök ör utförs för tt l.. optimer AR-koncentrtionen. Dessutom ör försöken omftt fler äppelsorter. 5
Astrct The incidence of posthrvest diseses cn ffect the qulity nd restrict the shelf life of vrious fruit crops. Apples show reltively high susceptiility to fungl dmge cused y ull's eye rot Neofre spp. (N. l nd N. perennns), itter rot Colletotrichum spp. (C. cuttum nd C. gloeosporioides), lue mould Penicillium expnsum, grey mould Botrytis cinere, nd rown rot Monilini spp. (M. lx nd M. fructigen). Appliction of synthetic fungicides is the most efficient wy to minimize fruit loss. Posthrvest fungicide pplictions re, however, completely nned in Sweden, nd ccess to chemicls for pre-hrvest ppliction is lso ecoming incresingly restricted. Since pre- nd post-hrvest ppliction of fungicides is totlly prohiited in the orgnic production, prolems with storge diseses ecome even more severe. Vrious other strtegies to comt posthrvest decy hve therefore een explored, such s iologicl pesticides, physicl stress nd nturl ioctive mterils. Phenolic lipids constitute highly diversified group of compounds derived from mono- nd dihydroxyphenols, i.e., phenol, ctechol, resorcinol, nd hydroquinone. Two resorcinols chrcterized in mngo, 5-(12-cis-heptdecenyl) resorcinol nd 5-npentdecylresorcinol, hve een shown to inhiit the growth of fungi. From rye rn, which consists of the outermost lyer of the rye grin, vrious non-toxic phenolic lipids such s lkylresorcinols cn e extrcted. These sustnces elong to group of very interesting ntioxidnts nd hve een shown to inhiit the growth of vrious red fungi. The ojectives of this study, which ws crried out during 2011 2015, were to ssess ntifungl ctivity of AR emulsions on the mycelil growth nd virulence of severl fungi s well s to study the inhiitory effect of pre- nd posthrvest pplictions of these emulsions. To study the posthrvest effect of AR, fruit of vrious Swedish-grown pple cultivrs were inoculted with spores of three importnt fungi nd treted with AR efore cold storge. AR tretment decresed the dmge compred to untreted fruit. Cultivrs with reltively high tolernce to fungl decy (such s Gloster) hd etter positive response to the protective effect of AR tretment. AR concentrtions from 0.025 to 0.2% were pplied, nd negtive correltion ws found etween AR concentrtion nd dimeter of the contrcted fungl dmge (lesion). Effectiveness of prehrvest ppliction of AR ws investigted in n orgnic orchrd where trees were spryed t vrious times during the seson. Yield, fruit weight, qulity nd storge potentil of the hrvested fruit ws investigted for (1) trees treted with n 0.025% AR emulsion, (2) trees treted with control emulsion without AR, nd (3) untreted trees. A negtive effect on fruit yield ws noted, especilly fter erly tretments (June nd July). AR tretment did not ffect fruit qulity, whether t hrvest or fter storge. The mount of fllen fruit, most of which ws infected y rown rot, ws 43% lower in the AR-treted trees thn in the untreted trees. In comprison with fruit from untreted trees, AR-tretment decresed the totl fungl decy during storge y 55 60% in 2014 nd y 57 72% in 2015. Numer of tretments (one or two) hd no effect wheres sprying trees with AR lter in the seson (August nd Septemer) improved the inhiitory effect compred to erly sprying (June). Oservtions were mde of four storge disese fungi in prticulr. AR tretment in the field decresed decy cused y M. fructigen during oth sesons y 70 90% compred to the untreted trees. AR hd significnt effects lso on ull's eye rot (Neofre spp.) with 40 50% less decy in comprison to fruit from untreted trees. For itter rot cused y Colletotrichum cuttum, AR tretment showed positive impct only in 2015, when there ws 60% less decy in fruit from treted trees. A comintion of AR tretment nd ULO storge resulted in reduced dmge cused y lue mold (P. expnsum). 6
The mechnisms ehind the inhiitory effect of AR tretment is not yet known. Tretment of fungi grown on gr pltes inhiited mycelil growth, virulence nd viility of the four studied fungi. A positive correltion ws noted etween AR concentrtion nd inhiitory effect. Bsed on the high level of fungl decy inhiition nd the sence of ny dverse effects like uncceptle odour or skin discolortion, use of AR s nturl fungicide should e further investigted. More orchrd trils re needed for, e.g., optimiztion of the AR concentrtion. In ddition, the promising effects of AR need to e screened on wider vriety of pple cultivrs in the field. Tck Speciellt tck till SLU-EkoForsk för finnsieringen v dett försök. Tck till Kiviks musteri för smretet. 7
Förord Äpple är åde gott och nyttigt! Det finns en lång trdition v tt odl och ät äpple i Sverige, och ktuell forskning visr nu tt äpple är en rik käll till ntioxidnter smtidigt som frukten hr ett lågt kloriinnehåll. Enligt studier v mtvnorn i Europ idrr konsumtionen v äpple med 7% v intget v flvonoider. I Sverige äter 78% v efolkningen äpple 2 5 gånger i veckn. Fruktens ursprung spelr roll; 83% v konsumentern vill vet vrifrån äpplen kommer innn de eslutr om eventuellt köp, medn 40% föredrr tt köp svenskodlde äpplen ovsett priset. Dessvärre är det inte lltid så lätt tt få tg i frisk och fin äpplen, och det lir ännu svårre om de även sk vr loklt och miljövänligt odlde. Lönsmheten för de svensk äppelodlrn är prolemtisk på grund v det jämförelsevis hård klimtet, de restriktiv reglern för nvändnde v växtskyddskemiklier smt den strk konkurrensen från utländsk frukt som odlts med ett etydligt lierlre regelverk. I ekologisk äppelodlingr får mn dessutom ett signifiknt större ortfll v försäljningsr frukt jämfört med i nnn typ v odling. Den främst nledningen är lgringssjukdomr orskde v olik svmprter. Även IP-odlingr kn drs v esvärnde lgringsskdor eroende lnd nnt på vilk äpplesorter mn odlr. En studie, utförd vid SLU, hr vist tt den ekonomiskt mest prolemtisk, så kllde 'gloeosporiumrötn' i odlingrn på Österlen, orsks v svmpr i släkten Neofre och Colletotrichum. Grönmögel (Penicillium expnsum) och gråmögel (Botrytis cinere) spelr också en viktig roll. Olik strtegier hr undersökts i olik länder för tt minsk förluster i ekologisk frukt under åde lgring och försäljning såsom ehndling med vrmt vtten, essentiell oljor och ozon. Tyvärr hr merprten v de hittills testde icke-kemisk skyddsåtgärdern ntingen hft otillräcklig effekt eller vrit för dyrr tt nvänd i yrkesproduktion. Rågkli, som estår v det yttre höljet kring rågkärnn, är en hittills underutnyttjd iprodukt v svensk rågodling. Ur rågkli kn mn utvinn olik icke-toxisk fenol-lipider som exempelvis lkylresorcinoler (AR). En tvärvetenskplig forskrgrupp med kompetens inom äppelförädling och genetik (Prof. Hilde Nyom, Blsgård, SLU), äppelodling och lgringssjukdomr (Dr Irhim Thir, Alnrp/Blsgård, SLU) smt tillämpd iokemi och industriell utveckling (Docent Ester Dey, Lunds universitet) ilddes 2011. Sedn nslöt sig även doktornden Msoud Ahmdi-Afzdi, som doktorerr på lgringssjukdomr hos äpple på SLU. Forskrgruppen erhöll medel från SLU EkoForsk för tt under 2011 2013 undersök om mn kn utveckl ett iologiskt växtskyddspreprt med lkylresorcinoler (AR) som en ktiv eståndsdel. Resultten visde tt ehndling v skördd frukt med AR-lösningr gv ett signifiknt skydd mot åtminstone två vnlig svmpr som orskr lgringsförluster: P. expnsum och N. perennns. Under två säsonger, 2014 och 2015, tog vi sedn metodiken ut i fält, och ehndlde någr äppleträd i en ekologisk odling med AR-lösning. Efter ehndlingen undersöktes effekter på vkstning och lgringsduglighet (kvlitet och svmpngrepp). Här redogör vi för erhålln resultt smt diskuterr hur mn kn gå vidre med dett projekt. Blsgård, Alnrp och Lund, septemer 2016 Projektgruppen 8
1. Inledning Skdor uppkomn under kyllgring v frukten är en v de viktigste orskern till tt svensk äppelproduktion rotts med stor ekonomisk prolem. Dess skdor kn dr 10% eller mer v den inlgrde frukten och är förödnde eftersom odlren redn ådrgit sig etydnde kostnder för växtskyddsehndling, gllring, skörd, sortering och lgring innn mn sedn tvings kst den förstörd frukten. Skdorn orsks främst v svmpsjukdomr som grönmögel Penicillium expnsum, itterröt Colletotrichum gloeosporioides (Glomerell cingult) och C. cuttum, ull s eye rot (på svensk ilnd klld gloeosporiumröt, Pezicul-röt eller lenticellröt) olik rter v Neofre (N. l och N. perennns) och gråmögel Botrytis cinere (Thir, 2014). Tidigre utförd odlings- och sortförsök i Sverige (främst Blsgård och Kivik) hr vist tt just lgringssjukdomr är en v de viktigste nledningrn till tt ekologisk äppelodlingr hr ett signifiknt större ortfll v försäljningsr frukt jämfört med nnn typ v odling (Thir & Nyom, 2008; Thir et l., 2008). För den populär sorten Arom erhöll mn ett 20 gånger större ortfll i ekologiskt odlde träd jämfört med IP-odlde träd på smm fält (Jönsson et l., 2010). I Europ hr lgersjukdomr ökt signifiknt under senre år, snnolikt eroende på klimtförändringen (Weer & Rolnd, 2009). Vi kn förvänt oss tt dess ngrepp lir ännu llvrligre llt eftersom klimtet i Sverige lir vrmre och troligen även fuktigre under vegettionsperioden. Inom växtförädlingen hr lgersjukdomr hittills inte uppmärksmmts trots tt det orde finns möjligheter tt förättr växtmterilet. Någr helt resistent äpplesorter finns visserligen inte dokumenterde, men mn hr notert stor vrition melln sorter i ders tolerns för lgringssjukdomrn (Ahmdi-Afzdi et l., 2013; Thir & Nyom, 2008; Thir et l., 2008; Thir et l., 2015). I flertlet stor äppelproducernde länder löser mn prolemet med ristnde resistens genom tt dopp frukten i en fungicid eller möjligen i ett iologiskt medel som BioSve vilket innehåller Pseudomons syringe. Kemisk efter-skörd ehndling är däremot inte tillåten i Sverige, vre sig för ekologiskt eller konventionellt odld frukt. Användningen v kemisk fungicider innn skörd hr också livit lltmer egränsd, speciellt för odlingr elägn på vttenskyddsområden. Dett gäller stor delr v Österlen dit merprten v den svensk äppelproduktionen är lokliserd. Inom ekologisk äppelodling finns det ing kemisk medel som är godkänd för tt ekämp lgringssjukdomr innn eller efter skörd. Av de icke-kemisk växtskyddsmetodern är ehndling v frukten med hett vtten gnsk effektivt (Neri et l., 2009; Spdro et l., 2004) men kostndskrävnde och mn kn få oönskde effekter som sklränn. Olik äppelsorter skiljer sig dessutom åt i känslighet för värmeehndlingen, som därför måste utforms individuellt för vrje sort. Mikroiologisk orgnismer som jästsvmpr och kterier hr vist sig h effekt mot viss lgringssjukdomr som grönmögel (Jnisiewicz et l., 2008; Nunes et l., 2007), men nvändningen v sådn preprt hr oftst sämre effekt på Neofre som är den vnligste sjukdomen i Sverige, och kn h ieffekter som tt exempelvis orsk korkrost på sklet. Även olik växtserde oljor hr vist sig h skyddnde effekt (Amiri et l., 2008). Rågkli, som estår v det ytterst skiktet v rågkornet, är en hittills underutnyttjd iprodukt v svensk rågodling. Ur rågkli kn mn utvinn olik icke-toxisk fenol-lipider som exempelvis lkylresorcinoler (AR; Lnderg et l., 2008; Fig. 1). Dess ämnen ingår i en grupp v mycket intressnt ntioxidnter som hr en påvisd positiv effekt mot cncer, fetm, hjärt- och kärlsjukdomr smt dietes typ 2 (Andersson et l., 2011; Hjer et l., 2008). AR från rågkli hr vist sig kunn inhier tillväxt v olik rödsvmpr in vitro (Reiss, 1989) smt minsk skdorn v olik växtptogen svmpr hos mngo (Hssn et l., 2007). 9
Målsättningen med det här projektet vr tt undersök om AR-ehndling kn motverk lgringssjukdomr hos äpple. I det först steget undersöktes effekten v ett ntl olik AR-lösningr på redn skördd frukt som inokulerts med svmpsporer (Dey et l., 2013; Thir et l., 2014). I näst steg undersöktes effektern v tt sprut träd på fält med en AR-lösning. Såväl spontn svmpngrepp hos lgrd frukt som skdor uppkomn efter inokulering v frukten med sporer v olik lgringssvmpr kvntifierdes. Dessutom utförde en del in vitro-försök för tt se hur olik funktioner hos svmprn påverks v AR. Fig. 1. Kemisk struktur för 5-(n)-lkylresorcinoler med olik lkylkedjor 2. Mteril och metoder 2.1. Frmställning v AR-lösningr Vi inledde det experimentell retet vårvintern 2011 med tt utvinn lkylresorcinoler. Utgångsmterilet vr rågkli (Nord Mills, Mlmö) med en prtikelstorlek på 0,5 1 mm. För tt få en så ren produkt som möjligt, nvändes superkritisk koldioxidextrktion i två steg (Dey och Mikhilopulo 2009). Denn metod ygger på tt mn pplicerr ett mycket högt tryck så tt fsgränsen melln vätsk och gs luckrs upp. Den resulternde superkritisk vätskn kn åde diffunder genom fst ämnen som en gs och lös upp ämnen som en vätsk, och är därför ett synnerligen effektivt extrktionsmedel. Koncentrtionen v AR kvntifierdes med spektrofotometri. Därefter nvändes preprtiv högtrycksvätskekromtogrfi (HPLC), fstfs extrktion (SPE) och tunnskiktskromtogrfi (HPTLC) för tt kontroller kvliteten och fstställ den exkt mängden ren AR. Sedn vr det dgs tt undersök vilk olik medel som kn nvänds i komintion med AR för tt få en god effekt v ppliktion på frukt med spryning/sprutning. Intorkde och noggrnt uppmätt mängder v AR-extrkt löstes upp i två olik lösningsmedel (Synperonic 91/6 eller polydimetylsiloxn). Därefter tillsttes olik emulgeringsmedel (PEG 400, NCl eller CCl 2,Triolet, oleyllkohol ochtween 20) och konsistensgivre (xnthn gum eller gum ric). Vrje lösning späddes sedn med destillert vtten, och kom därmed tt innehåll 0,025% respektive 0,05% AR (Dey et l., 2013). AR-lösningr med högre koncentrtioner (0,1% respektive 0,2%) förereddes senre. För Lösningrn homogeniserdes med en Ultr Turrx (13,500 vrv per minut i en minut), och fotogrferdes i mikroskop för tt dokumenter droppstorleken. De färdig lösningrn förvrdes sedn i +8 C tills tt de skulle nvänds. Innn nvändning värmdes AR-lösningen upp till 37 C i 30 min, skkdes krftigt 10
och fördes över till en spryflsk med vrs hjälp den sedn pplicerdes på frukten respektive träd. Till fältehndling v träden i 2015, slter (NCl eller CCl 2 ) vr inte tillsätt i emulgeringsmedel. 2.2. Föreredelse v inokulum Eftersom effekten v AR svårligen kn edöms enrt på spontnt förekommnde svmpngrepp, vlde vi tt ehndl frukt som först inokulerts med svmpsporer enligt tidigre eskrivn metoder (Thir et l., 2009; Nyom et l., 2012). Svmpsporer frmställdes ur frukt med typisk symptom på P. expnsum, fruktmögel Monilini fructigen (en svmp som orskr skdor främst under de sist veckorn innn skörd men även under lgring) och Neofre perennns i två olik pckerier (Äppelriket och Alnrp). Frukten steriliserdes med 70% etnol, vrefter tre ngripn itr från vrje frukt odldes på petriplttor med PDA (pottisdextrosgr) för Penicillium och Monilini, och på MEA (mltextrktgr) plttor för Neofre. Plttorn inkuerdes i 22 C under två veckor. Myceliet rtestämdes enligt Thir (2014) och flyttdes sedn till ny plttor (sukulturer) som ehndldes med UV-ljus i 24 timmr och därefter förvrdes i rumstempertur i mörker under 4 dgr. Från dess plttor skörddes sporer, som ldes i sterilisert vtten med Tween 0,05%. Sporern rtestämdes under mikroskop. Koncentrtionen v sporer justerdes med hjälp v hemcytometer till 1 105 per ml för P. expnsum och M. fructigen och till 1 103 för N. perennns. 2.3. Inokuleringsmetod All inokuleringrn utfördes på Blsgård. Frukten tvättdes med vtten för tt vlägsn spontnt förekommnde ytlig svmpinfektioner. Sedn injicerdes 20 mikroliter v sporlösningen med en pipett, som stcks in c 4 mm i frukten. Vrje frukt inokulerdes på två sidor, och förvrdes i rumstempertur tills tt sporlösningen torkt in. Frukten ehndldes sedn med olik AR-lösningr enligt försöksplnen. Dimetern på vrje svmpngrepp mättes med linjl i två vinkelrät riktningr och medelvärdet nvändes som ett mått på ngreppets storlek. 2.4. Förstudie Under sommren 2011 inokulerdes importerd frukt med grönmögelsporer för tt finslip tekniken. Vi nvände hel frukter, hlverde frukter smt fruktskivor. Nitton olik AR-lösningr med vriernde innehåll (koncentrtion v AR smt typ och hlt v lösningsmedel, emulgeringsmedel och konsistensgivre) sprydes på frukten 5 6 timmr efter inokuleringen. Mängden symptom vlästes efter 6 dgr i rumstempertur. Hösten 2011 skörddes frukt från en yrkesodling i Kivik: Ingrid Mrie (gnsk mottglig för grönmögel), Gloster (gnsk resistent) och Frid (gnsk resistent). Mogndsstdium fstställdes utifrån torrsustnsinnehåll (sockerhlt, refrktometer), fsthet (penetrometer), stärkelsens omvndling till socker (jod-test) smt produktionen v etylen (gskromtogrfi). Ingrid Mrie vr något mer mogen än övrig två men ll efnn sig fortfrnde i ett preklimkteriskt stdium lämpt för skörd v frukt som sk lgrs under en längre period. Hel frukter v de tre sortern inokulerdes med grönmögel. Eftersom smtlig hr åde gult (skuggsid) och rött (solsid) på frukten, lde vi ett inokuleringsställe på skuggsidn och ett på solsidn v vrje frukt. Fyr utvld AR-lösningr sprydes på den inokulerde frukten, smt även en kontrollösning (vtten). Dessutom ingick icke-spryde kontrollfrukter i försöket. I vrje försöksled (sort x AR-lösning eller kontroll) ingick 15 frukter. Frukten förvrdes under 6 veckor i kyl (90% reltiv luftfuktighet och +2 C ) smt fem dgr i rumstempertur innn symptomen vlästes. 11
2.5. Efterskördehndling med AR Bsert på resultten från förstudien, vldes de två mest lovnde AR-lösningrn ut för fortstt experiment. Båd innehåller 0.025% AR, 0.2% Tween 20, 1% triolete, 2% oleyllkohol och 2% PEG400. Dessutom innehåller den först lösningen (AR 1) även lösningsmedlet Synperonic 91/6 och 5% CCl2 medn den ndr lösningen (AR 11) innehåller polydimetylsiloxn och 5% NCl. Hösten 2011 respektive 2012, skörddes frukt v Arom, Ingrid Mrie, Frid och Gloster, i Kivik på smm sätt som eskrivits ovn, med eräkning v mogndsstdium (stärkelseindex och Streif index) (Tell 1). Dessutom mättes även färgen på sol- och skuggsid med hjälp v en kolorimeter (färgmätre). Tell 1. Fruktens mogndsstdium och färg vid skörd. Streif index = fsthet/ (torrsustnshlt x stärkelseindex). Färgindex räkns ut enligt en formel serd på mätvärden för röd färg, gul färg och ljushet (Thir et l., 2015). Säsong Sort Skörd Stärkelse- Streif index Färgindex index solsid skuggsid 2011 Arom Sept 10 4.1 0.17 4.4-4.0 Ingrid Mrie Sept 22 3.9 0.16 11.6 8.2 Frid Sept 26 4.1 0.17 9.3 6.8 Gloster Nov 11 4.7 0.17 8.9 5.0 2012 Arom Sept 18 4.4 0.16 17.8-3.1 Ingrid Mrie Okt 09 4.3 0.15 48.6-5.0 Frid Okt 18 4.2 0.16 25.2-1.1 Fyr x 15 frukter för vrje äpplesort nvändes i försök med grönmögel. För ll sorter utom Gloster upprepdes dess inokuleringr 2012, och då nvändes även fyr x 15 frukter i försök med Neofre. Ett försöksled (15 frukter) för vrje svmp förlev ospryt som kontroll medn ett nnt sprydes med vtten. Övrig två försöksled sprydes med AR 1 respektive AR 11. Frukten lgrdes sedn i +2 C under 12 veckor. Skdorn på grönmögelinokulerd frukt mättes direkt efter uttg från lgret medn Neofre-inokulerd frukt hölls i rumstempertur (+18 C och 80% reltiv luftfuktighet). Skdorn mättes sedn som ovn. Hösten 2014 respektive 2015 gjordes tre vritioner på AR 1 (AR 0,025%, AR 0,1% och ARc 0,2%) smt en kontroll utn AR. Fyrhundrfemtio frukter v Amoros skörddes i en ekologisk odling där även fältförsök utfördes (se nedn). Frukten trnsporterdes till Blsgård, tvättdes och deldes in i tre grupper. Den först gruppen inokulerdes med P. expnsum, den ndr med N. perennns och den tredje med M. fructigen. Frukten i vrje grupp/svmp deldes in i fem försöksled. I fyr v dess försöksled sprydes frukten med en v ovnnämnd lösningr (kontroll, AR, AR och ARc) medn det femte försöksledet förlev oehndlt. Symptom edömdes efter 10 veckor i kyllgring (2 C). 2.6. Behndling på fält Nittio träd v Amoros vldes ut i en ekologisk äppelodling i Kivik. Dess deldes upp i tre lock med 12
15 försöksled om vrder två träd i vrje lock. Träden esprutdes med ntingen 0,5 liter AR-lösning (0,025% AR) eller 0,5 liter kontrollösning (0,0% AR) per träd och tillfälle, enligt följnde schem: ett tillfälle (1: veckn i juni, försöksled 1 med AR och försöksled 8 med kontroll) ett tillfälle (1: veckn i juli, försöksled 2 med AR och försöksled 9 med kontroll) ett tillfälle (1: veckn i ugusti, försöksled 3 med AR och försöksled 10 med kontroll) ett tillfälle (1: veckn i septemer, försöksled 4 med AR och försöksled 11 med kontroll) två tillfällen (1: veckn i juni och 1: veckn i ugusti, försöksled 5 med AR och försöksled 12 med kontroll) två tillfällen (1: veckn i juni och 1: veckn i septemer, försöksled 6 med AR och försöksled 13 med kontroll) två tillfällen (1: veckn i ugusti och 1: veckn i septemer, försöksled 7 med AR och försöksled 14 med kontroll) respektive ingen ehndling lls (försökled 15) Optiml skördetidpunkt estämdes med Streif index genom edömning v 10 frukter från fem träd, plockde två gångr per veck från och med sist veckn i ugusti. Fsthet, löslig torrsustns och stärkelsenedrytning mättes. När Streif index nått 0,15 skörddes ll frukt på vrje träd för edömning v vkstning och kvlitet. Frukten vägdes och räkndes. Fruktens färg mättes med en färgmätre (Minolt) som visr mängden (+ = röd och = grön), och mängden (+ = gul och = lå) smt färgstyrkn (L), vrefter färgindex eräkns som ( x 1000)/( x L) (Cmelo & Gomez, 2004). Därefter deldes frukten in i två grupper, vrv den en förvrdes i kyllger (2 C och 85% fuktighet) och den ndr i ULO-lger (2 C, 2 kp syre och 2 kp koldioxid) under fem månder. Fruktkvlitet (fsthet, löslig torrsustns och färg) och spontnt uppkomn svmpngrepp edömdes efter vslutd lgring. 2.7. In vitro test, svmpmyceltillväxt och virulens I ett experiment 2012, utoklverdes Petriskålr med pottisdextros gr och sedn tillsttes AR 1 eller AR 11 respektive inget lls (kontroll). Efter tre timmr vid 4 C tillsttes mycel v grönmögel till vrje petriskål. I näst försöksled tillsttes istället först svmpmycelet och tre timmr senre sprydes ARlösningrn direkt på petriskålrn. På smm sätt tillsttes mycel v Neofre och de två ARlösningrn till petriskålr med mltextrkt gr. Av vrje försöksled tillverkdes minst tre petriskålr. Efteråt försegldes petriskålrn med prfilm och inkuerdes i 21 dgr vid +20 C. Efter de 21 dgrn gjordes en sujektiv uppskttning v mängden svmpmycel i vrje petriskål, och effekten v AR-lösningrn eräkndes som procent myceltillväxt i ehndlde petriskålr jämfört med myceltillväxten i kontrollskålrn. När vi hde utvärdert myceltillväxten, skrpde vi v konidiesporern från vrje petriskål och förde över dem i en vttenlösning. Denn filtrerdes och sedn eräkndes sporkoncentrtionen under mikroskop med hemcytometer. Lösningr med stndrdiserd sporkoncentrtion från vrje petriskål nvändes sedn till tt inokuler frukt v Arom på smm sätt som ovn. Till vrje sporlösning nvände vi fem äpplen. Dess frukter inkuerdes under en veck vid +20 C. Därefter mättes skdorns storlek som ovn. Slutligen eräknde vi AR-lösningrns effekt på skdeutvecklingen som procent v skdn på ospryd frukt. I en ny serie experiment 2015, flyttdes mycelpluggr (10 mm i dimeter) från 10 dgr gml kolonier v P. expnsum över till 75 ny PDA-plttor. Dess deldes in i fem försöksled (15 plttor/grupp). Tre timmr senre sprydes plttorn i fyr försöksled med 1 ml Ar (0,025%), AR (0,1%), ARc (0,2%) 13
eller kontroll (0,0%) medn plttorn i det femte försöksledet förlev oehndlde. På smm sätt hnterdes mycelpluggr v C. cuttum och N. perennns (MEA-plttor). All plttor inkuerdes i 22 C under 10 dgr vrefter den rdiell myceltillväxten mättes med ett skjutmått och uttrycktes som procentuell hämning v rdiell myceltillväxt. Försöket upprepdes tre gånger med fem lock och tre plttor per lock/svmprt. I ett nnt försök undersöktes koniders livsduglighet genom tt 0,5 ml sporlösning (1000 konidi per ml) v vrje svmp (P. expnsum, C. cuttum och N. perennns) fördes över i fem Eppendorf-rör (1,5 ml). Fyr v rören innehöll 0,5 ml AR, AR, ARc respektive kontroll-lösning medn det femte röret vr tomt. Rören inkuerdes i 22 C under en dg vrefter 100 µl pplicerdes på PDA- respektive MEA-plttor. Dess inkuerdes i 22 C under sju dgr vrefter ntlet kolonier (CFU) räkndes. Experimentet upprepdes tre gånger med fem rör/lock/svmprt. 2.8. Sttistisk nlyser En komplett rndomiserd design nvändes för ll experiment och resultten utvärderdes i ett ntl vrinsnlyser. För fältförsöken nvändes tvåvägs-vrinsnlyser med lösningr, sprutningstidpunkt (er) och ders interktioner som oeroende vriler (= fst fktorer), och vkstning, fruktvikt och fruktkvlitet vid skörd och efter lgring som eroende vriler. Förekomst v signifiknt skillnder melln olik försöksled undersöktes med Tukeys test (α = 0,05). Dt från försöken med inokulerd och ehndld frukt respektive in vitro-försöken nlyserdes med envägs-vrinsnlyser där lösningr nvändes som oeroende vriel och mängden erhålln symptom respektive hämning v myceltillväxt och ntl svmpkolonier som eroende vriler. Förekomst v signifiknt skillnder melln olik försöksled undersöktes med Lest Significnt Difference (LSD) test (α = 0,05). All eräkningr utfördes med hjälp v Minit 17.2.4.0 (Minit Ltd., Stte College, PA, USA). 3. Resultt 3.1. AR-lösningrn teknisk kvlitet Utyte och kvlitet v AR edömdes vr mycket tillfredsställnde. Men för tt verkligen h en hämmnde effekt på svmpens tillväxt, måste det färdig preprtet också fstn ordentligt på frukten, och stnn kvr tillräckligt länge. För tt uppnå dett, måste mn sätt till en del ämnen. Dess tillstser får dock inte hämm den ktiv sustnsens verkn, inte vr toxisk, och heller inte för dyr. För tt det färdig preprtet sk kunn li godkänt som ett växtstärknde medel inom ekologisk odling, måste ll ingående sustnser dessutom vr cceptl enligt regelverket. De olik lösningrn i vår experiment skiljde sig märkrt åt i droppstorlek och fysiklisk stilitet (Fig. 2), dvs. om de olik komponentern örjr seprer eller om lösningen förlir homogen, men dett tycktes inte påverk lösningrns effektivitet i någon högre utsträckning. 14
Fig. 2. Foto v två olik AR-lösningr i mikroskop, (A) AR 11 och (B) AR 131 som hr högre mängd konsistensgivre (xnthn gum och gum ric) (Dey et l., 2013). 3.2. Experimentell teknik Vi testde olik metoder tt utför inokuleringrn och de påföljnde AR-spryningrn, och nvände därför hel frukter, hlverde frukter respektive skivor v frukt. Dessvärre visde det svår tt tolk resultten från hlverde frukter och skivor v frukt på grund v lltför ojämn svmptillväxt. Vi eslöt därför tt nvänd den vnlig stndrdmetoden, dvs. inokulering v hel frukter (Fig. 3 och Fig. 4). Fig. 3. Grönmögelinokulerde frukter v Ingrid Mrie. AR1: frukt som spryts med AR 1, Vtten: frukt som spryts med vtten, Kontroll: frukt som inte spryts lls. Fig. 4. Grönmögelinokulerde frukter v Golden Delicious. 15
3.3. Efterskördehndling med AR 3.3.1. Effekt v två AR-lösningr på två svmpr hos fyr äpplesorter De fyr äpplesortern (Arom, Ingrid Mrie, Frid och Gloster) vr skördde i smm mogndsstdium men skiljde sig åt mrknt i mottglighet för de åd svmpsjukdomrn (grönmögel och Neofre). Det fnns ingen smstämmighet melln sorterns mottglighet för de två olik svmprn (Fig. 5). Ingrid Mrie 60 Frid A Arom Skdns dimeter (mm) 50 40 30 c A B Gloster 20 10 0 Penicillium expnsum Neofre perennns Fig. 5. Mottglighet för grönmögel, eräknt som genomsnittlig storlek på den resulternde skdn hos frukt som inokulerts med grönmögel respektive Neofre. Stplr med olik okstäver skiljer sig åt signifiknt (p 0.05). Arom vr sålund den sorten som vr mest mottglig för grönmögel men den vr ändå etydligt mindre mottglig för Neofre jämfört med Ingrid Mrie och Frid. De olik sortern skiljde sig också åt när det gäller grden v det skydd som AR-lösningrn kunde ge (Tell 2, Fig. 6). Jämfört med ospryd frukt, inhierdes skdorn v grönmögel med 17, 28, 39 respektive 52% för Arom, Ingrid Mrie, Frid och Gloster (Fig. 7). För Neofre, lev inhiitionen 77, 74 respektive 31% för Arom, Ingrid Mrie och Frid (Gloster vr inte med i denn delen v försöket) (Fig. 7). 16
Tell 2. Appliktion v 2 AR-lösningr smt storlek på skdorn (mm) för fyr äpplesorter och två svmpr (P.e. Penicillium expnsum, N.p. Neofre perennns). Genomsnittlig skdn på solsidn respektive skuggsidn viss också. En interktion melln olik prmetrr vr signifiknt: ehndling x sid för Arom inokulerd med Neofre. Behndling Ingrid Mrie Frid Arom Gloster P.e N.p P.e N.p P.e N.p P.e 10 ml ARs 1 20.0 c z 9.6 20.0 30.3 37.5 1.0 c 11.6 10 ml ARs 11 28.1 13.6 22.1 32.7 45.2 14.0 16.6 10 ml vrmt vtten 35.0 46.7 35.1 50.0 46.5 32.1 29.6 Kontroll 33.0 45.2 34.2 49.0 50.3 31.0 30.8 Solsid 29.0 39.0 26.5 39.0 44.2 17.5 21.4 Skuggsid 29.0 42.0 29.5 42.0 45.7 21.5 22.9 Behndling x sid Ns Ns Ns Ns Ns * Ns Behndling x säsong Ns Ns Ns Ns Ns Ns Ns Z Medelvärden som följs v olik okstäver, inom smm kolumn, skiljer sig åt signifiknt, p 0.05. Ns = inte signifiknt. Penicillium expnsum Neofre perennns 60 50 90 80 70 Inhiition % 40 30 20 c c Inhiition % 60 50 40 30 10 20 0 Arom Ingrid Mrie Frid Gloster 10 0 Arom Ingrid Mrie Frid Fig. 6. Genomsnittlig procentuell inhiition v svmpskdor efter ehndling med de två ARlösningrn. Stplr för smm svmp men med olik okstäver, skiljer sig åt signifiknt (p 0.05). 17
Generellt kn mn konstter tt sorter med reltivt liten mottglighet för en viss svmpsjukdom på kontrollfrukten också drog mest nytt v skyddet från AR-lösningrn (Tell 2). Omvänt kn mn också utryck det som tt sorter med störst ehov v skydd tyvärr vr svårst tt skydd. Skdorn vr genomgående något mindre på solsidn v fruktern, men skillnden vr signifiknt endst för skdorn v Neofre hos Arom (Tell 2). Tidigre studier hr vist tt solsidn på äpplen vnligen innehåller mer ntocyner och vx, och är mer motståndskrftig mot svmpsjukdomr (Thir et l., 2009). I ndr studier hr olik äpplesorter dock skiljt sig åt i reltiv känslighet för solsid och skuggsid, och det verkr svårt tt dr någr generell slutstser (Ahmdi-Afzdi et l., 2013). Fig. 7. Grönmögelinokulerde frukter v Ingrid Mrie respektive Neofre-inokulerde frukter v Arom. Kontroll: frukt som inte spryts lls, AR11: frukt som spryts med AR 11, AR1: frukt som spryts med AR 1. 18
3.3.2. AR-lösningrns effekt på frukt som inokulerts med tre svmpr På kontrollfrukt som ej ehndlts med AR, vr den genomsnittlig skdn (lesionen) orskd v inokulering med P. expnsum 49 mm medn skdn v Neofre perennns vr 25 mm och skdn v M. fructigen 27 mm (Tell 3). AR-ehndld frukt hde signifiknt mindre lesioner jämfört med oehndld frukt. Under 2014, när endst den lägre AR-koncentrtionen (0,025) nvändes, minskde storleken på lesioner orskde v P. expnsum med 27% medn minskningen för N. perennns lev 48% jämfört med oehndld inokulerd frukt (Tell 3). Tell 3. Genomsnittlig storlek på lesioner (i mm) uppkomn efter inokulering med tre svmpr (P.e. Penicillium expnsum, N.p. Neofre perennns och M.f. Monilini fructigen) i frukt som ehndlts med olik AR-koncentrtioner. AR koncentrtion 2014 2015 P.e. N.p. M.f. P.e. N.p. M.f. Kontroll-lösning 0,0% 53,8 22,7-38,7 25,5 26,6 AR 0,025 % 39,7 11,2-32,4 c 22,6 22,9 c AR 0,1 % - - - 24,8 d 20,4 c 19,8 cd ARc 0,2 % - - - 17,4 e 19,2 c 17,1 d Oehndld 54,5 21,6-44,3 27,5 28,4 Värden med olik okstäver skiljer sig åt signifiknt (p 0.05). År 2015 vr lesionern orskde v P. expnsum 27%, 44% respektive 61% mindre efter ehndling med 0,025%, 0,1% respektive 0,2% AR jämfört med oehndld frukt (Fig. 10A). AR-koncentrtionen och lesionens dimeter vr negtivt korrelerde (Tell 4). Behndling med kontroll-lösningen minskde lesionern med 12% jämfört med oehndld frukt (Fig. 8). Behndling med de tre ARkoncentrtionern hde signifiknt inverkn även på N. perennns; lesionens dimeter minskde med 19%, 30% respektive 40% jämfört med oehndld frukt (Fig. 10B, Fig. 9) och AR-koncentrtion och lesionens dimeter vr negtivt korrelerde (Tell 4). Behndling med kontroll-lösning påverkde inte lesionens dimeter. Fig. 8. Högre AR-koncentrtion leder till mindre ngrepp v P. expnsum. 19
Fig. 9. Högre AR-koncentrtion leder till mindre ngrepp v Neofre perennns. För M. fructigen minskde lesionens dimeter med 16%, 24% och 29% efter AR-ehndling (Fig. 10C), och AR-koncentrtion och lesionens dimeter vr återigen korrelerde (Tell 4). Behndling med kontrollösning hde ingen effekt på lesionens dimeter. Tell 4. Korreltion melln koncentrtionen v olik AR-lösningr och svmpngrepp orskdes v inokulering med tre olik svmpr (2015). Fktor Korreltion melln storleken på lesionerkorreltion melln AR-koncentrtion (Konc.) orskde v olik svmpr och lesioner orskde v olik svmpr P.e. & M.f. P.e. & N.p. M.f. & N.p. Konc. & P.e. Konc. & N.p. Konc. & M.f. r 0,56 0,56 0,39-0,78-0,50-0,53 P 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 Ekvtion 5,2+1,15x 11,0+0,89x 16,6+0,27x 39,4-119x 25,0-33,2x 26,1-49,1x R2 25,6% 31,1% 15,1% 61% 25% 28% P.e. Penicillium expnsum; M.f. Monilini fructigen; N.p. Neofre perennns. Lesion dimeter (mm) 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0 A. Penicillium expnsum Behndlingr 20
B. Neofre perennns 40,0 Lesion dimeter (mm) 30,0 20,0 10,0 0,0 Oehndlt Kontroll-lösning AR AR AR c Behndlingr C. Monilini fructigen 40,0 Lesion dimeter (mm) 30,0 20,0 10,0 0,0 Oehndlt Kontroll-lösning AR AR AR c Behndlingr Fig. 10. Inverkn v efterskördehndling med olik AR-koncentrtioner (AR 0,025%, AR 0,1% och ARc 0,2%) på dimetern hos lesioner efter inokulering med tre olik svmpr. 21
3.4. Fältehndling 3.4.1. Fältehndlingens inverkn på vkstning och fruktvikt Besprutning v träden minskde vkstningen jämfört med oesprutde träd. Räknt över ll försöksled och åd säsongern, hde AR-ehndlde träd 25% lägre vkstning än träd som ehndlts med kontrollösningen (Fig. 11). Antlet AR-ehndlingr hde ingen inverkn på denn minskning (Fig. 12). Senre ehndlingr (i ugusti och septemer) visde mindre negtiv effekter på vkstningen jämfört med tidigre ehndlingr (Fig. 13). 7 6 180 160 Skörd (kg per träd) 5 4 3 2 1 Fruktvikt (g) 140 120 100 80 60 40 20 0 AR 0,025% Kontroll-lösning 0 AR 0,025% kontroll-lösningen Fig. 11. Inverkn v AR-ehndling på vkstning och fruktvikt (medelvärden för 2014 och 2015). Stplr med olik okstäver skiljer sig åt signifiknt (p 0.05). 4,5 4 160 140 Skörd (kg per träd) 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 En gång per säsong Två gånger per säsong Fruktvikt (g) 120 100 80 60 40 20 0 En gång per säsong Två gånger per säsong Fig. 12. Inverkn v ntlet AR-ehndlingr på vkstning och fruktvikt (medelvärden för 2014 och 2015). Stplr med olik okstäver skiljer sig åt signifiknt (p 0.05). 22
Räknt över ll försöksled och åd säsongern, påverkdes fruktvikten inte v om träden ehndldes med AR eller med kontrollösningen (Fig. 4). Behndling v träden med AR vid två tillfällen ledde till c 15% lägre fruktvikt jämfört med r en ehndling under 2015 men skillnden vr inte signifiknt när mn räknde över åd säsongern (Fig. 5). Behndlingstidpunkt påverkde inte fruktvikten, vrken när AR-lösningen eller kontrollen nvändes (ej visde dt). Skörd (kg per träd) 10,0 9,0 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 Juni Juli Augusti Septemer Juni+ugusti + septemer Augusti + Septemer C B A Fig. 13. Inverkn v AR-ehndlingstidpunkt(er) på vkstningen (medelvärden för 2014 och 2015). Värden (punkter) med olik okstäver skiljer sig åt signifiknt (p 0.05). 3.4.2. Fältehndlingens inverkn på mängden fllfrukt Frukt som låg under försöksträden smldes upp innn skörd. All denn fllfrukt hde svmpngrepp, främst fruktmögel (Monilini fructigen). Det fnns mindre fllfrukt under ARehndlde träd jämfört med under oehndlde träd eller träd som ehndlts med kontrollösningen (Fig. 14). Antl ehndlingr och ehndlingstidpunkt hde ing övergripnde effekter. Räknt över ll försöksled och åd säsongern, vr ndelen fllfrukt 43% lägre under AR-ehndlde träd jämfört med träd som ehndlts med kontrollösningen. 5,0 % fllfrukt per träd 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 AR 0,05% Kontroll-lösning Fig. 14. Inverkn v AR-ehndling på mängden fllfrukt per träd (medelvärden för 2014 och 2015). Stplr med olik okstäver skiljer sig åt signifiknt (p 0.05). 23
3.4.3. Fältehndlingens inverkn på fruktens kvlitet vid skörd Behndling med såväl AR som kontrollösning minskde fruktens fsthet något jämfört med oehndld frukt under 2014 medn AR-ehndlingen istället hde viss positiv effekt under 2015 (Tell 5). Antl ehndlingr och ehndlingstidpunkt hde ing tydlig, övergripnde effekter. Behndlingrn visde ing signifiknt effekter på mängden löslig torrsustns. Fruktens färg påverkdes negtivt v ehndling med såväl AR som kontrollösning under 2014, medn ingen signifiknt effekt oserverdes under 2015. Det fnns ingen signifiknt interktion melln säsong, typ v lösning och ehndlingstillfällen för någon v kvlitetsvrilern. Tell 5. Inverkn v AR-ehndling på fruktens kvlitet (fsthet, löslig torrsustns =SSC och färgindex) vid skörd. Medel Behndlingstillfällen 2014 2015 Fsthet SSC Färgindex Fsthet SSC Färgindex AR Juni 5,9 cd 12,6 15,4 cd 8,3 13,3 c 22,9 0,025 % Juli - - - 8,2 c 13,7 c 28,5 Augusti 6,9 12,3 17,8 c 8,8 13,5 c 27,7 Septemer - - - 8,6 13,4 c 26,8 Juni+ugusti 5,3 d 12,6 26,3 8,2 c 13,3 c 23,0 Juni+sep. 6,2 c 12,9 16,6 cd 8,8 14,4 24,6 Aug.+sep. 6,6 c 13,1 25,1 c 7,9 cd 13,3 c 23,8 Kontroll- Juni 5,4 d 12,5 29,1 8,1 cd 12,6 c 28,6 lösning Juli - - - 7,3 cd 13,4 c 21,6 Augusti 5,9 cd 13,0 25,6 c 8,2 13,6 c 30,2 Septemer - - - 7,8 cd 13,0 c 25,7 Juni+ugusti 5,6 d 12,5 13,9 d 8,1 cd 14,0 27,7 Juni+sep. 5,4 d 12,8 17,6 cd 7,7 cd 13,5 c 25,4 Aug.+sep. 5,3 d 12,5 18,5 cd 7,2 d 13,3 c 20,5 Oehndld 7,5 12,8 38,1 7,8 cd 12,4 c 25,7 Fsthet (kg/cm2), SSC: Totl löslig torrsustns (%), färgindex=( x 1000)/( x L). Värden med olik okstäver inom smm kolumn skiljer sig åt signifiknt (p 0.05). Räknt över ll försöksled och åd säsongern, förättrde AR-ehndlingen fruktens fsthet något jämfört med ehndling med kontrollösningen. Ing effekter kunde noters för löslig torrsustns eller fruktens färg. 3.4.4. Fältehndlingens inverkn på fruktens lgringsduglighet Behndling v träden med AR respektive kontrollösning påverkde inte fruktens viktminskning, vrken under kyl- eller ULO-lgring. Interktionern melln säsong, typ v lösning och ehndlingstidpunkt(er) vr inte signifiknt. Räknt över ll försöksled gv ULO-lgring 50% lägre viktförlust jämfört med kyllgring under åd säsongern. 24
Behndling med AR respektive kontrollösning hde ingen effekt på förekomsten v fysiologisk sjukdomr som mjuk sklränn. ULO-lgring minskde dock förekomsten v denn sjukdom. Träd som hde ehndlts med AR tidigt under säsongen, visde en något högre frekvens mjuk sklränn jämfört med träd som ehndlts senre (dt viss ej). AR-ehndling reducerde den totl förlusten v frukt under lgringsperioden jämfört med hos oehndlde träd. Senre ehndlingr med AR minskde den totl förlusten v frukt under kyllgring jämfört med kontrollen (Tell 6). I ULO-lgrd frukt syntes en positiv effekt v ehndlingrn främst under 2015 (Tell 6). Tell 6. Totl förlust v frukt per träd efter lgring. Medel Behndlingstillfällen 2014 2015 Kyl ULO Kyl ULO AR Juni 36,7 c 23,3 c 21,7 cd 9,9 c 0,025 % Juli - - 24,5 cd 10,0 c Augusti 20,0 cd 15,6 c 15,0 d 8,4 c Septemer - - 14,7 d 8,2 c Juni+ugusti 17,8 cd 11,1 c 25,4 c 6,2 c Juni+sep. 22,2 cd 17,8 c 17,0 cd 5,1 c Aug.+sep. 13,3 d 11,1 c 20,8 cd 4,7 c Kontroll- Juni 33,3 c 17,8 c 20,4 cd 16,4 lösning Juli - - 28,2 17,4 Augusti 20,0 cd 28,9 c 30,3 13,5 c Septemer - - 27,8 11,4 c Juni+ugusti 37,8 37,8 25,7 c 12,1 c Juni+sep. 37,8 24,4 c 27,6 16,2 Aug.+sep. 33,3 c 26,7 c 23,5 cd 12,3 c Oehndlde 44,4 33,3 31,3 18,4 Värden med olik okstäver inom smm kolumn skiljer sig åt signifiknt (p 0.05). Lägst förlust erhölls för träd som hde ehndlts med AR vid ett tillfälle (i septemer) eller vid två tillfällen (i ugusti och septemer) (Fig. 15). Träd som hde ehndlts med kontroll-lösningen skiljde sig inte signifiknt från oehndlde träd. Lgringsförlustern vr lägre under 2014 jämfört med 2015. Räknt över försöksled minskde ehndling med AR de totl förlustern med 40% under 2014 och med 51% under 2015, jämfört med ehndling med kontrollösningen (Fig. 16). 25
100 90 80 70 60 50 40 AR 0,025% Kontroll-lösningen 30 20 10 0 Fig. 15. Inverkn v olik AR-ehndlingr på totl förlust v frukt efter lgring (medelvärden v 2014 och 2015). Stplr med olik okstäver skiljer sig åt signifiknt (p 0.05). 35 30 Totl förluster (%) 25 20 15 10 5 0 2014 2015 AR 0,025% Kontroll-lösning Fig. 16. Inverkn v AR-ehndling på den totl förlusten v frukt efter lgring. Stplr med olik okstäver skiljer sig åt signifiknt (p 0.05). Under 2014 hde ehndling vid två tillfällen ättre effekt än ehndling vid ett tillfälle; totl förlustern minskde då med 30% i kyllgrd frukt och med 32% i ULO-lgrd frukt (Fig. 17). Motsvrnde tydlig effekter förelåg inte för 2015. 26
Totl förluster (%) 40 35 30 25 20 15 10 5 0 2014 2015 Kyllgring ULO Kyllgring ULO En gång Två gånger Fig. 17. Inverkn v ntl AR-ehndlingr på totl förlusten v frukt efter lgring. 3.4.5. Fältehndlingens inverkn på svmpngrepp under lgring Frukt från oehndlde träd hde en större mängd spontnt utvecklde svmpngrepp 2014 jämfört med 2015, och likså mer ngrepp efter kyllgring jämfört med efter ULO-lgring. Jämfört med frukt från oehndlde träd, minskde AR-ehndling de totl svmpngreppen i lgrd frukt med 55 60% under 2014 och med 57 72% under 2015 (Tell 7). Tell 7. Inverkn v AR-ehndling på ntlet svmpngripn frukter efter kyl- och ULOlgring. Medel Behndlingstillfällen 2014 2015 Kyllgring ULO Kyllgring ULO AR Juni 31,7 c 23,3 c 14,2 cd 6,7 c 0,025% Juli - 11,7 cde 6,7 c Augusti 15,0 cde 13,5 c 8,3 de 5,6 c Septemer - 5,8 e 4,4 c Juni och ugusti 13,5 de 9,0 c 13,3 cd 3,3 c Juni och septemer 17,5 cde 15,0 c 11,7 cde 2,2 c Augusti och sept. 8,6 e 9,1 c 8,3 de 2,2 c Kontroll-lösning Juni 27,5 cd 15,2 c 15,8 c 13,3 Juli - 20,8 15,6 Augusti 14,4 cde 26,9 c 21,7 10,0 c Septemer - 14,2 cd 8,9 c Juni och ugusti 33,6 c 30,1 20,8 9,1 c Juni och septemer 34,4 21,3 c 20,8 13,3 Augusti och sept. 29,6 cd 24,8 c 17,5 c 10,0 c Kontroll 38,7 35,3 24,2 15,6 Värden med olik okstäver inom smm kolumn skiljer sig åt signifiknt (p 0.05). 27
Antlet svmpngripn frukter från AR-ehndlde träd vr 42% (2014) respektive 50% (2015) lägre jämfört med träd som ehndlts med kontrollösningen (Fig. 18 och 19). 35 30 25 Totlt svmpngrepp (%) 20 15 10 5 0 2014 2015 AR 0,025% Kontroll-lösning Fig. 18. Inverkn v lgringsmetod (A) och AR-ehndling (B) på totlt svmpngrepp i lgrd frukt. Stplr med olik okstäver skiljer sig åt signifiknt (p 0.05). Fig. 19. E: frukt från träd som ehndlts med AR i juni och septemer, F: i ugusti och septemer, (C) i septemer, Control: oehndlde träd, D: i juni och ugusti. 28
Antlet ehndlingstillfällen visde ingen signifiknt inverkn på det totl svmpngreppet i frukt från AR-ehndlde träd, vrken under 2014 eller 2015. Tidpunkten för ehndlingen hde däremot en signifiknt effekt; senre ehndling (ugusti och septemer) minskde det totl svmpngreppet jämfört med tidigre ehndling (juni) (Fig. 20). 30 25 Totlt svmpngrepp (%) 20 15 10 5 0 Juni Augusti Septemer Juni + ugusti Juni + Augusti + septemer septemer 2014 2015 Fig. 20. Inverkn v ehndlingstillfällen på totl svmpngreppet i lgrd frukt från AR-ehndlde träd. Värden (punkter) med olik okstäver skiljer sig åt signifiknt (p 0.05). 3.4.6. Fältehndlingens inverkn på ngrepp v olik svmprter När spontnt uppkomn svmpngrepp utvärderdes, ägndes speciell uppmärksmhet åt fyr olik lgringssjukdomr: lenticellröt (Neofre sp.), itterröt (Colletotrichum sp.), grönmögel (P. expnsum) och fruktmögel (M. fructigen). Lenticellröt orskde c 45% v det totl svmpngreppet under 2014 och vr den mest destruktiv skdegörren. Under 2015 orskde den däremot r 5,5% v det totl svmpngreppet. ULO-lgring minskde ngreppet med 22% jämfört med kyllgring (Fig. 21). Behndling med AR hde ännu större effekt; skdorn minskde med 40 50% jämfört med kontrollehndling. Antlet ehndlingstillfällen hde ingen inverkn men senrelgd ehndling (septemer eller ugusti) gv mer effekt än ehndling i juni (Fig. 22). Bitterröt orskde 33 34 % v det totl svmpngreppet åd åren, och ULO-lgring minskde återigen skdorn (Fig. 21). Behndling med AR hde positiv inverkn enrt under 2015, då svmpngreppet lev 60% lägre än efter ehndling med kontrollösning. Precis som ovn, hde ntlet ehndlingstillfällen ingen signifiknt inverkn medn senrelgd ehndling (septemer eller ugusti) vr effektivre än ehndling i juni (Fig. 22). Grönmögel gjorde liten skd 2014 men orskde i stället 52% v det totl svmpngreppet under 2015. En komintion v AR-ehndling och ULO-lgring ledde till minskde skdor (Fig. 21). Behndling i juni eller septemer visde ättre effekt än ehndling i ugusti (Tell 6 och Fig. 22). 29
Fruktmögel stod för en fjärdedel (2014) respektive en femtedel (2015) v det totl svmpngreppet. ULO-lgring minskde fruktmögelskdorn med 33% jämfört med kyllgring under 2015 (Fig. 21). AR-ehndling hde stor effekt under åde säsongern, med 70 90% färre skdor jämfört med kontrollehndlingen. Under 2015 hde senrelgd ehndling ättre effekt än tidigre ehndling (Fig. 22). 12 10 Totlt svmpngrepp (%) 8 6 4 2 0 N14 C14 P14 M14 N15 C15 P15 M15 AR 0,025%, kyllgring AR 0,025%, ULO Kontroll-lösning, kyllgring Kontroll-lösning, ULO Fig. 21. Inverkn v AR-ehndling och lgringsmetod på ngrepp v N: Neofre sp., C: Colletotrichum sp., P: P. expnsum, M: M. fructigen. 14 = 2014 och 15 = 2015. 10,0 8,0 Totl svmpngrepp (%) 6,0 4,0 2,0 0,0 N14 C14 P14 M14 N15 C15 P15 M15 Juni Augusti Septemer Fig. 22. Inverkn v ehndlingstidpunkt på mängden ngrepp v N: Neofre sp., C: Colletotrichum sp., P: P. expnsum, M: M. fructigen. 14 = 2014 och 15 = 2015. 30
3.5. In vitro tester 3.5.1. Effekt v två olik AR-lösningr på myceltillväxt och virulens Tillsts v AR-lösning till petriskålr tre timmr innn mycelet fördes över, gv en sämre myceltillväxt under de påföljnde tre veckorns inkution. Effekten vr dock sttistiskt signifiknt endst för AR 1- ehndlde petriskålr med Neofre. Betydligt krftigre inhiition erhölls när vi spryde ARlösningrn på petriskålrn tre timmr efter tt svmpmycelet tillstts. Särskilt AR 1 utmärkte sig, med 71 och 77% inhiition v myceltillväxten hos grönmögel respektive Neofre (Fig. 23, Tell 8). Fig. 23. Myceltillväxt hos grönmögel. Oehndlde: petriskålr som inte spryts, AR 11: petriskålr som spryts med AR 11 tre timmr efter tt mycelet tillstts, AR 1: petriskålr som spryts med AR 1 tre timmr efter tt mycelet tillstts. Tell 8. AR-lösningrns förmåg tt inhier (%) myceltillväxt in vitro v P. expnsum respektive N. perennns på petriskålr med pottisdextros gr (PDA) respektive mltextrkt gr (MEA). AR-lösning AR tillstt 3 tim. innn inokulering AR tillstt 3 tim. innn inokulering P. expnsum N. perennns P. expnsum N. perennns AR 1 24 z 46 71 77 AR 11 21 27 50 43 Z Medelvärden som följs v olik okstäver, inom smm kolumn och svmp, skiljer sig åt signifiknt, p 0.05 När vi därefter inokulerde Arom äpplen med inokulum som vi fått genom tt skrp v sporer från de AR-spryde petriskålrn, fick vi signifiknt mindre skdor än när vi nvände sporer från oehndlde kontroll-petriskålr (Fig. 24). AR-ehndlingrn hde lltså förmåg tt egräns svmprns virulens. För grönmögel visde AR 1 äst förmåg tt egräns virulensen. De två AR-lösningrnn skiljde sig däremot inte åt i sin förmåg tt egräns virulensen hos Neofre. När vi inokulerde Arom äpplen med sporer som vi istället fått från petriskålr där AR-lösningrn tillstts innn mycelet, fick vi ing signifiknt egräsningr v virulensen för någon v svmprn (Fig. 25). 31
60,0 50,0 Skdns dimeter (mm) 40,0 30,0 20,0 c A B B Kontroll ARs 1 ARs 11 10,0 0,0 Penicillium expnsum Neofre perennns Fig. 24. Effekt v AR 1 och AR 11 på virulensen hos grönmögel och Neofre, eräknd som storleken v skdor på frukter v Arom. Dess frukter hde inokulerts med sporer från petriskålr som spryts med AR-lösningr tre timmr efter tt de först försetts med svmpmycel. Stplr med olik okstäver (smm svmp), skiljer sig åt signifiknt (p 0.05). 50,0 Kontroll Skdns dimeter (mm) 40,0 30,0 20,0 A A ARs 1 ARs 11 A 10,0 0,0 Penicillium expnsum Neofre perennns Fig. 25. Effekt v AR 1 och AR 11 på virulensen hos grönmögel och Neofre, eräknd som storleken v skdor på frukter v Arom. Dess frukter hde inokulerts med sporer från petriskålr som hde ehndlts med AR-lösningr tre timmr innn de försetts med svmpmycel. Ing signifiknt skillnder kunde påviss. 32
3.5.2. Olik koncentrtioner v AR-lösning 3.5.2.1. Effekt på myceltillväxt In vitro test visde tt AR, AR och ARc (0,025%, 0,1% och 0,2%) minskde tillväxten v P. expnsum mycel med 51%, 83% respektive 86% jämfört med oehndlde svmpkolonier. Kontrollösningen hde också en något hämmnde effekt (c. 23%) (Fig 26, Fig 27A). Liknnde resultt erhölls för C. cuttum där tillväxten minskde med 58%, 73% respektive 80% (Fig. 27B, Fig 28). Kontrollösningen gv 15% minskd myceltillväxt. Myceltillväxten v N. perennns minskde med 74%, 85% och 90% medn kontrollösningen endst gv 12% minskd tillväxt (Fig. 27C, Fig. 29). AR-koncentrtionen hde en strk, negtiv korreltion med myceltillväxten (Tell 9) men det fnns ing signifiknt skillnder melln effekten v AR och ARc. Fig. 26. Effekten v olik AR-koncentrtioner på myceltillväxt hos P. expnsum. 100,0 A. P. expnsum Mycelium tillväxt (mm) 80,0 60,0 40,0 20,0 0,0 Oehndlt Kontroll-lösning AR AR AR c Behndlingr 33
B. C. cuttum 80,0 Mycelium tillväxt (mm) 60,0 40,0 20,0 0,0 Oehndlt Kontroll-lösning AR AR AR c Behndlingr C. N. perennns 100,0 Mycelium tillväxt (mm) 80,0 60,0 40,0 20,0 0,0 Oehndlt Kontroll-lösning AR AR AR c Behndlingr Fig. 27. Inverkn v olik AR-koncentrtioner (AR 0,025%, AR 0,1% och ARc 0,2%) på myceltillväxt hos in vitro kolonier v tre olik svmpr. Fig. 28. Effekten v olik AR-koncentrtioner på myceltillväxt hos C. cuttum. 34
Foto 29. Effekten v olik AR-koncentrtioner på myceltillväxt hos Neofre sp. 3.5.2.2. Effekt på konidiesporerns livsduglighet (viility). Livsdugligheten hos konidier v P. expnsum hämmdes med 46%, 72% respektive 79% efter ehndling med AR, AR respektive ARc (Fig. 18A). För C. cuttum noterdes en minskning med 38%, 60% respektive 74% (Fig. 18B). För N. perennns minskde livsdugligheten med 54%, 68% respektive 80% (Fig. 18C). Signifiknt korreltioner melln AR-koncentrtionen och konidierns livsduglighet noterdes för ll tre svmprn. Kontroll-lösningen hde däremot inte någon signifiknt effekt. Vnligtvis är färgen på kolonier v P. expnsum grön medn färgen på kolonier v Neofre är grå-gul. Kolonifärgen lev dock mer runktig hos åd ptogenern efter ehndling med AR. Koloniildnde enheter (CFU) 80,0 60,0 40,0 20,0 A. P. expnsum 0,0 Oehndlt Kontroll-lösning AR AR AR c Behndlingr 35