Molekylärbiologisk diagnostik av tarmparasiter Vad, När, Var och Hur? Jessica Ögren Länssjukhuset Ryhov Juni 2012
Molekylärbiologiska metoder De senaste två decennierna har molekylärbiologiska tekniker i allt högre omfattning kommit till användning i diagnostiska sammanhang på våra mikrobiologiska laboratorier.
PCR för påvisning av tarmparasiter Feces är ett material som innehåller väldigt mycket av många olika saker Bra metoder krävs för att minska antalet inhiberande faktorer.
Hur? PCR-processen består av flera steg som alla måste fungera för optimal utdelning. Rätt provmaterial som hanteras på ett optimalt sätt Extrahera DNA ur cellen Amplifiera önskad målsekvens
Lysering av celler När det gäller cystor krävs en kombination av flera lyseringssteg.
Renframställning av nukleinsyra När cellerna lyserats och nukleinsyra frigjorts, har samtidigt också ett antal oönskade komponenter frigjorts. Med hjälp av magnetisk laddning, salter och ph-förändringar kan DNA skiljas ut från resten
PCR Till det renade DNA:t sätts en mastermix som består av bland annat primrar, prober, och enzymer.
PCR
Multiplex i Jönköping Under 2011 sattes en metod upp för att påvisa: Entamöba histolytica samt E.dispar Cryptosporidium spp Dientamöba fragilis Giardia lamblia
Metoden baserad på följande publikationer: Visser et al 2006: Diagnostic methods for differentiation of Entamoeba histolytica and Entamoeba dispar in carriers: Performance and clinical implications in a non-endemic setting Verweij et al 2003: Simultaneous detection of Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, and Cryptosporidium parvum in fecal samples by using multiplex real-time PCR. Verweij et al 2007: Real-time PCR for the detection of Dientamoeba fragilis in fecal samples
Etablering av multiplex-pcr Utveckling och anpassning till vår befintliga utrustning av: isoleringsmetoder för obehandlad feces och SAF fixerad feces lyseringsmetod DNA isoleringsmetod möjlighet för kvantifiering (odling av parasiter) Modifikation av PCR protokoll (reagenser, tider och volym) Omsättning från tre duplex PCR till två triplex PCR reaktioner per prov Modifikation av primer och prober Resultat datablad
Förbehandling En liten del tas från originalröret. Proven centrifugeras och de som innehåller SAF-lösning tvättas i två steg med PBS.
Lysering Svårigheter med cystor (speciellt Entamöba spp.) då dessa är väldigt tåliga Tillsats av Proteinase K och buffert -70 C 56 C -70 C 56 C -70 C 98 C
Flöde M48 DNA isolering Lysis renad DNA Slamma feces prov i lyseringsbuffer och proteinasek, lysering vid olika temperaturer Sätting av mastermix, templat (renad DNA) och försluter plattan med folie Sätta PCR plattan i LC480 PCR cycler
Resultat Drygt 1000 prov PCR betydligt känsligare när det gäller Dientamöba fragilis (115/140) och Giardia lamblia (20/27) Likvärdigt med mikroskopi när det gäller Entamöba histolytica/dispar (17/18) och Cryptosporidium spp (10/10).
Vad? De vanligaste patogenerna? (Giardia, Cryptosporidium, Entamöba histolytica och Dientamöba fragilis) Ovanliga svårdiagnostiserade parasiter (Strongyloides, flundror etc) De vanligaste kan vara föränderliga!
När? Screening Verifiering Vid negativ mikroskopi men fortsatt klinisk misstanke? Olika förutsättningar på olika laboratorium
Var? Överallt På få ställen
PCR vs Mikroskopi PCR är känsligare Mikroskopi är bredare PCR är en snabb analys Mikroskopi är snabbare PCR är automatiserad Mikroskopi är personberoende
PCR vs Mikroskopi PCR artbestämmer Entamöba histolytica/dispar Mikroskopi är billigare (än så länge) Kan PCR vara för känsligt. Eh kliniskt relevant? Kontaminationsrisk? Avdödade mikroorganismer?
Kvalitetssäkring! UkNeqas (eller annat?) har inget program. Flerlabb/trelabbssutbyte?
Tack för visat intresse!
Parasit PCR innebär påvisninga av: Åtskillnad av Entamoeba histolytica från Entamoeba dispar Dientamoeba fragilis Cryptosporidium arter (parvum/hominis) Giardia lamblia och en DNA prep/pcr inhibitions kontroll
Vi anpassade och utvecklade metoder på laboratorium med befintlig utrustning: Lysering för att släppa ut DNA från parasiter DNA isoliering och bortrening av störande komponenter från feces (PCR inhibitorer) Modifikation av PCR protokoll (reagenser, tider och volym) Omsättning från tre duplex PCR till två triplex PCR reaktioner per prov Modifikation av primer och prober Resultat datablad
Fungera bra på LightCycler480II och Applied Biosystems 7500FAST Multiplex realtids PCR Två Triplex reaktioner (TaqMan) Reaktion 1 / påvisning av: målgen Reporter färg Entamoeba histolytica 18S rrna (FAM) Entamoeba dispar 18S rrna (VIC) Dientamoeba fragilis 18S rrna (LC670=Cy5) Reaktion 2 / påvisning av: Cryptosporidium ssp. DNAJ-like protein gene (FAM) Giardia lamblia 18S rrna (YAK) IPC (DNA prep kontroll och inhibitionskontroll) 1 gb gene (LC670)
Detektionsgräns Dientamoeba fragilis plasmid spädning 10.000/1.000/100/10/1 kopior Entamoeba histolytica plasmid spädning 10.000/1.000/100/10/1 kopior
Rutin PCR Entamoeba histolytica Entamoeba dispar
Rutin PCR Dientamoeba Cryptosporidium
Rutin PCR Giardia lamblia IPC
Förbättringspotential Problem: - tillräckligt bra lysering av cystor? - Minimera lysering av DNA från oönskat material - utsläpp av ämnen, som kan inhibera PCR reaktionen - Förbättra snabbhet, enkel, effektiv och billig upparbetning av faeces