Verifiering av metod för analys av tumörmarkörerna CA 125, CA 15-3 och CA 19-9 på Roche Cobas e411

Fakulteten för hälso- och livsvetenskap Examensarbete Verifiering av metod för analys av tumörmarkörerna CA 125, CA 15-3 och CA 19-9 på Roche Cobas e411 Författare: Jelena Zulj Ämne:Biomedicinsk laboratorievetenskap Nivå:Grundnivå Nr:2014:BL9

Verifiering av metod för analys av tumörmarkörerna CA 125, CA 15-3 och CA 19-9 på Roche Cobas e411 Jelena Zulj Examensarbete i Biomedicinsk laboratorievetenskap 15 högskolepoäng Filosofie Kandidatexamen Handledare: Martin Carlsson, Doc. Leg. Läkare Susanne Widell, Dr Med Vet Examinator: Maria Mattson, Dr Med Vet Avdelningen för klinisk kemi och transfusionsmedicin, Länssjukhuset Kalmar SE-39185 Kalmar Institutionen för kemi och biomedicin, Linnéuniversitetet SE-39182 Kalmar Institutionen för kemi och biomedicin, Linnéuniversitetet SE-39182 Kalmar Examensarbetet ingår i Biomedicinska analytikerprogrammet 180 högskolepoäng SAMMANFATTNING Tumörmarkörer är substanser som frisätts i kroppsvätskor från cancerceller. Markörerna används inom sjukvården för att upptäcka och följa upp maligna tumörsjukdomar med analyser av markörerna i plasma/serum. Tre av dessa är cancerantigenerna CA 125, CA 15-3 och CA 19-9. Syftet med studien var att verifiera analysmetoden för tumörmarkörerna CA 125, CA 15-3 och CA 19-9 på två Roche Cobas e411 instrument (instrument 1 och 2) inför införandet av dessa vid avdelningen för klinisk kemi och transfusionsmedicin, Landstinget Kalmar län. De av företaget rekommenderade cut-off värdena på Roche Cobas e411 (Roche diagnostics) är för CA 125 < 35 ku/l, för CA 15-3 25 ku/l och för CA 19-9 <27 ku/l. Precision beräknades med hjälp av statistiska metoder genom analys av den mellanliggande precisionen (mätning av två kontrollnivåer under 5 dagar) och repeterbarheten (analys av två kontrollnivåer i en serie). En korrelationsstudie gjordes med patientprover som erhölls från Aleris Medilab (Abbot Architect i System). Den mellanliggande precisionen resulterade i högre variationskoefficientvärden (CV %) för samtliga tre markörer i förhållande till ett åsatt CV från Roche Diagnostics. CV värdet skilde även mellan de två Roche Cobas e411 instrumenten. Repeterbarheten bedömdes vara acceptabel för samtliga tre markörer. Korrelationsstudien visade en skillnad i de uppmätta värdena mellan Roche Cobas e411 och Abbot Architect för samtliga tre markörer. Då Roche Cobas e411 tenderade att ge högre uppmätta värden (ku/l) (54 av 85 gånger). Samstämmigheten mellan metoderna var bra då det endast var två prover vid analys av CA 15-3 och två prover vid analys av CA 19-9 som var på skilda sidor om cut off värdet. Sammanfattningsvis visade studien att den mellanliggande precisionen (CV värdet) för alla tre markörerna var högre än Roches Diagnostics angivna CV värde. Olika CV värden erhölls med Roche Cobas e411 jämfört med Abbot Architect. Olika CV värden erhölls också med instrument 1 jämfört med instrument 2. Precisionen anses vara tillräckligt god för införandet av metoderna i rutinbruk. i

Nyckelord Cancerantigen (CA), CA 125, CA 15-3, CA 19-9, tumörmarkörer, metodverifiering. ABSTRACT Tumor markers are substances that are released in body fluids during tumor diseases and are used in healthcare to detect tumor diseases using measurements of these in the blood. Three of these are cancer antigens CA 125, CA 15-3 and CA 19-9. The aim of this study was to verify the method for analysis of tumor markers CA 125, CA 15-3 and CA 19-9 on two Roche Cobas e411 instruments (instrument 1 and 2) for the introduction of these at the department of clinical chemistry and transfusion medicine, Country council of Kalmar. The recommended cut-off values for Roche Cobas e411 from the company Roche Diagnostics are for CA 125 <35 ku/l, for CA 15-3 25 ku/l and for CA 19-9 <27. The precision was calculated using statistical methods through the analysis of the intermediate precision (measurement of two control levels for 5 days) and repeatability (analysis of two control levels in a series). A correlation study was made by comparing patients samples obtained from Aleris Medilab (Abbot Architect i System). The intermediate precision resulted in higher variation coefficient values (CV %) for all three markers in relation to the recognized CV values from Roche Diagnostics. Differences were also seen between the two Roche Cobas e411 instruments (instrument 1 and 2). The repeatability was considered to be acceptable for all three markers. The correlation study indicated differences between Roche Cobas e411 and Abbot Architect. Higher values (ku/l) were mostly obtained with Roche Cobas e411 (54 of 85 times). The coherence between the methods was good when there were only two samples for analysis of CA 15-3 and two samples for analysis of CA 19-9 that were on different sides of the cut-off value. In summary the study showed that the intermediate precision (CV values) for all three markers were higher than the recognized CV values from Roche Diagnostics. Different CV values were obtained with Roche Cobas e411 compared with Abbot Architect. Different CV values were also obtained with instrument 1 compared with instrument 2. The precision was considered to be adequate for the methods to be introduced into routine use. Keywords Cancer antigen (CA), CA 125, CA 15-3, CA 19-9, tumor markers, method validation ii

INNEHÅLLSFÖRTECKNING 1 INTRODUKTION 1 1.1 Cancerantigen 125, (CA 125) 1 1.2 Cancerantigen 15-3, (CA 15-3) 2 1.3 Cancerantigen 19-9, (CA 19-9) 2 1.4 Provtagning 2 1.5 Analysinstrumentet Cobas e411 3 1.5.1 Analysprincip för CA 125, CA 15-3 och CA 19-9 3 1.6 Validering och verifiering av en ny metod 4 2 SYFTE 4 3 MATERIAL OCH METOD 4 3.1 Provmaterial 4 3.2 Analys på Roche Cobas e411 5 3.3 Reagens 5 3.4 Analysprincip 5 3.5 Kalibrering 5 3.6 Kontroller 6 3.7 Precisionsstudier 6 3.8 Korrelationsstudier 6 3.9 Statistik 6 3.10 Miljö 7 3.11 Etik 7 4 RESULTAT 7 4.1 Kalibrering 7 4.2 Mellanliggande precision 7 4.2.1 CA 125 7 4.2.2 CA 15-3 8 4.2.3 CA 19-9 9 4.3 Repeterbarhet 10 4.3.1 CA 125 10 4.3.2 CA 15-3 10 4.3.3 CA 19-9 11 4.4 Korrelationsstudier 12 4.4.1 CA 125 12 4.4.2 CA 15-3 13 4.4.2 CA 19-9 15 5 DISKUSSION 16 6 TACK 21 7 REFERENSER 22 8 BILAGOR Bilaga 1 Den mellanliggande precisionen Bilaga 2 Repeterbarhet Bilaga 3 Korrelationsstudier

1 INTRODUKTION Tumörmarkörer kallas substanser som frisätts i kroppsvätskor från cancerceller. Markörerna används inom sjukvården för att upptäcka och följa upp maligna tumörsjukdomar vilket sker genom analys av dessa markörer i serum/plasma. Markörerna produceras i onormal omfattning av tumörvävnad och ökar i koncentration i kroppsvätskor vid olika tumörsjukdomar (1). Friska celler utsöndrar inga eller mycket låg koncentration av dessa substanser, som kan vara enzymer, onkofetala antigen, cellyteantigen, sekretoriska antigen eller cellkärnereceptorer (1). Tumörmarkörer används oftast för att ta reda på tumörens ursprung, prognosbedömning och vid uppföljning av behandling vid konstaterad tumörsjukdom (1, 2). Den maligna tumörcellmassan, dess blodförsörjning samt frisättning och kroppens elimination av markören avgör koncentrationen av en tumörmarkör i serum/plasma (1). Cancermarkörerna är inte specifika för endast ett organ eftersom de kan öka vid olika cancersjukdomar och även vid benigna tillstånd. Ett undantag här är prostataspecifikt antigen (PSA) som är specifik för prostatan men även detta kan öka vid benigna tillstånd (3). 1.1 Cancerantigen 125, (CA 125) CA 125 är ett högmolekylärt mucin med molekylmassan 200 kda. Antigenet kodas av MUC16 genen och finns på ytan av icke-mucösa äggstockstumörer med epitelialt ursprung (4). Antigenet finns inte på epitelet på normala äggstockar. Koncentrationen av CA 125 är förhöjd hos 50-90 % av patienter med icke mucinös ovarialcancer (1). Vissa tillstånd som akut och kronisk pankreatit, gastrointestinala sjukdomar och njurinsufficiens kan medföra en lätt förhöjning över cut-off värdet. Även ascites och levercirros kan orsaka en frisättning av CA 125 och likaså menstruation och tidig graviditet (1, 5). Efter bukoperationer ses en ospecifik ökning av CA 125 varför man bör vänta i minst 6 veckor efter operation innan analys av analyten (1). Den rekommenderade beslutsgränsen/normalvärdet enligt Roche Diagnostics anges till <35 ku/l (6). Värden över denna nivå kan alltså tala för en cancerdiagnos och ge stöd för att påbörja en utredning eller en behandling (6). Efter operation av en malign tumör i äggstockarna ses ett samband mellan CA 125 nivån och den kvarvarande tumörmassan. Koncentrationen sjunker samtidigt med att tumörmassan minskar (1). På samma sätt ses ett samband mellan lyckad cytostatikabehandling och sjunkande CA 125 nivå. CA 125 är en bra markör för att följa en behandling eller för att upptäcka recidiv vid icke mucinös ovarialcancer (1). Vid misstanke om ovarialcancer ska patientens anamnes tas, klinisk status, gynekologisk undersökning och ultraljud göras och nivåerna av serum/plasma CA 125 analyseras (5). CA 125 kan också användas tillsammans med transvaginalt ultraljud för att upptäcka tidig ovarialcancer hos kvinnor med ärftlig form av ovarialcancer (7). 1

1.2 Cancerantigen 15-3, (CA 15-3) CA 15-3 är ett högmolekylärt mucin med molekylmassan 300 kda som kodas av MUC 1 genen (1). Bröstcancer är den vanligaste tumörformer bland kvinnor (8). Vid redan konstaterad bröstcancer används tumörmarkören CA 15-3 främst i samband med behandling för bröstcancer. CA 15-3 förekommer på ytan av epiteliala celler i organ som bröst, mage, tarmar och lungor (1). När markören frisätts i blodet har cancerceller bildats och förhöjda koncentrationer högre än cut-off värdet av CA 15-3 kan mätas i serum. I ett tidigt stadium är markören förhöjd hos 15-35 % av patienterna med bröstcancer och i ett sent stadium då metastasering skett har markören ökat till 75-90 % i serum/plasma (1). En ökning av CA 15-3 över cut-off värdet kan också ske vid andra cancersjukdomar som ovarial- och, pankreascancer, ventrikel-, cervix-, och lungtumörer. Därför bör inte markören användas för screening av bröstcancer utan för uppföljning av behandling och för att upptäcka återfall (1). Rekommenderad normal koncentration enligt Roche Diagnostics är 25 ku/l (9). 1.3 Cancerantigen 19-9, (CA 19-9) CA 19-9 är liksom CA 125 och CA 15-3 ett högmolekylärt mucin med molekylmassan över 1000 kda (1). CA 19-9 är ett tumörassocierat antigen som först isolerades från kolorektalcancer (10). CA 19-9 analyseras som markör för gastrointestinalcancer, kolorektal-, gallgångs-, och pankreascancer (10). Cancerceller i magtarmkanalens vävnader men även icke-maligna epiteliala celler från pankreas, ventrikel, lever, gallblåsa och gallgång uttrycker CA 19-9 (1). CA 19-9 kallas också för sialyl Lewis-a för att det är ett sialylerat Lewis a blodgruppsantigen, och personer med blodgruppen Le(a-b-) uttrycker inte CA 19-9 (1). CA 19-9 är inte organ- eller tumörspecifikt men är högre än cut-off värdet (>27 ku/l) hos ca 80-95 % av patienterna med pankreascancer. CA 19-9 är även förhöjt vid ventrikelcancer (hos 50-65 % av patienterna), vid kolorektalcancer (30-65 %) och vid levercellscancer (1). Vid gallgångscancer är CA 19-9 den bästa tumörmarkören då koncentrationen i blodet ofta är 100 ku/l hos ca 75 % av patienterna med denna sjukdom (1). En frisättning av CA 19-9 sker också vid andra sjukdomstillstånd som lungsjukdomar, cystisk fibros och pankreatit (1). Rekommenderad normal koncentration enligt Roche Diagnostics är 27 ku/l (95 %) (11). 1.4 Provtagning För att erhålla serum kan provtagning ske venöst i vakuumrör utan tillsats men med separationsgel. Analys kan också utföras på venöst taget blod i EDTA- eller heparinrör. Innan provtagning ska patienten ha suttit ner i 15 minuter för att undvika preanalytiska variationer (1). 2

1.5 Analysinstrumentet Cobas e411 Roche Diagnostics Cobas e411är ett analysinstrument som använder sig av elektrokemiluminiscensteknik (ECL). ECL används tillsammans med immunologiska metoder, (immunanalys ECLIA) för att detektera analyten i fråga med hjälp av specifika antikroppar. Instrumentet består av en analysenhet, dataenhet och strömkomponenter. I analysenheten ingår prov- och reagensområde, område för förbrukningsartiklar, mätområde och driftströmbrytare. Registrering av prover, kontroller och kalibratorer, ECL-detektering och överföring av resultat sker automatiskt. Instrumentet kan analysera 85 tester per timme och totalt finns det 100 positioner för prover, kontroller och kalibratorer (12). 1.5.1 Analysprincip för CA 125, CA 15-3 och CA 19-9 Biotinmärkta antikroppar och antikroppar märkta med tris(2,2.-bipyridyl)ruthenium(ii) komplex (Ru(bpy) 2+ 3) (riktade mot tumörmarkören) bildar ett komplex med analyten (om markören finns i provet) enligt sandwichprincipen. Streptavidintäckt paramagnetiska mikropartiklar tillsätts och dessa binder till komplexet genom bindning till biotin (figur 1) (13). Figur 1: Under första inkubation (9 min) binder monoklonala antikroppar märkta med rutenium (rutenium ak), biotinylerade monoklonala antikroppar (biotin ak) och antigenet i provet (blå) till varandra enligt sandwichprincipen. Efter ytterligare inkubation (9 min) binder en paramagnetisk streptavidintäckt mikropartikel (röd) till biotinet. Bilden är modifierad enligt referens (13). Vidare förs komplexet till mätkyvetten där separation av bundna substanser från obunda sker genom att paramagnetiska mikropartiklar dras till ytan på elektroden med hjälp av en magnet. De obundna substanserna sköljs bort med ProCell systembuffert innehållande triproprylamin (TPA). När spänning läggs på oxideras rutenium (Ru(bpy) 2+ 3) och blir Ru(bpy) 3+ 3. Samtidigt avger TPA en fri radikal som reagerar med rutenium och blir Ru(bpy) 2+ 3 (exciterad form). Genom att emittera en foton vid 620 nm återgår rutenium till sin ursprungliga form och på så vis avges kemiluminiscent emission som mäts med en fotomultiplikator (figur 2). Då rutenium återgått till sin ursprungliga form kan en ny reaktion ske. Intensiteten på signalen mäts i relative light units (RLU). Reagensetiketten innehåller en masterkurva med sex punkter som är specifika för reagenslotten. Signalens styrka är direkt proportionell mot koncentrationen av markören i provet. Analysinstrumentet räknar automatiskt ut analytkoncentrationen för varje prov i U/ml eller ku/l (13, 14). 3

Figur 2: Detektion med elektrokemiluminiscens. Komplexet binder till elektroden via paramagnetiska mikropartiklar och ProCell innehållande TPA tillsätts (bild A). TPA och rutenium oxideras när spänning läggs på (bild B). TPA avger en fri radikal som reagerar med rutenium som i sin tur exciteras. Rutenium emitterar en foton och kemiluminiscent emission uppstår (bild C). Signalen är proportionell mot koncentrationen av ämnet i provet. Bilden är modifierad från referens (13). 1.6 Validering och verifiering av en ny metod En metod som används i en ackrediterad verksamhet ska alltid vara validerad. Validering innebär att en metods avsedda användning uppfylls genom undersökningar och framläggande av bevis. Om valideringen redan är gjord kan en verifiering göras för att ta reda på om metodens krav uppfylls (15). Innan införande av en ny analysmetod ska laboratoriet genomföra en verifiering. Detta görs genom t.ex. bestämning av metodens repeterbarhet (analys av prover i en serie) och mellanliggande precision (analys av prover under flera dagar) (15). Precisionsdata används för att ta reda på om mätresultaten skiljer sig signifikant från varandra, om mätresultatet visar på en större spridning än förväntat. Precisionen kan skattas med statistiska metoder som standardavvikelse (SD), medelvärde (Mv) och variationskoefficient (CV %) (16). 2 SYFTE Syftet med studien var att verifiera analysmetoden för tumörmarkörerna CA 125, CA 15-3 och CA 19-9 på två Roche Cobas e411 instrument inför införandet av dessa vid avdelningen för klinisk kemi och transfusionsmedicin, Landstinget Kalmar län. 3 MATERIAL OCH METOD 3.1 Provmaterial Frysta serumprover (32 prover för analys av CA 125, 17 prover för analys av CA 15-3 och 19 prover för analys av CA 19-9), från patienter med okänd anamnes, ålder och kön erhölls från Aleris Medilab, Täby. Aleris Medilab använder sig av Abbots Architect i System metoden vars analysprincip är kemiluminiscent mikropartikel immunanalys (CMIA). Proverna förvarades frysta (-20 C) fram tills analys. 4

3.2 Analys på Roche Coabs e411 I studien användes två Roche Cobas e411 instrument (instrument 1 och 2) (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland). Kontroller, patientprover, kalibratorer och reagens rumstempererades (ca 20 C) innan analys. Patientproverna centrifugerades vid 2000 g i 10 minuter. Analystiden var 18 minuter per prov vid 37 C (13). Mätintervallet för CA 125 (6), CA 15-3 (9) och CA 19-9 (11) redovisas i tabell I. Tabell I: Mätintervall för CA 125, CA 15-3 och CA 19-9 på Roche Cobas e411. Mätintervall (U/ml) CA 125 0,600-5000 CA 15-3 1,0-300 CA 19-9 0,600-1000 3.3 Reagens Reagens som användes i studien (Roche Diagnostics) beskrivs nedan. Streptavidintäckta paramagnetiska mikropartiklar 0,72 mg/ml. Biotinylerade monoklonala anti-ca 125- antikroppar (M 11; mus) 1 mg/l. Monoklonala anti-ca 125-antikroppar (OC 125; mus) märkta med ruteniumkomplex 1 mg/l, ph 7,4 (6). Biotinylerade monoklonala anti-ca 15-3-antikroppar (115D8; mus) 1,75 mg/l ph 6,0. Monoklonala anti-ca 15-3 antikroppar (DF3; mus) märkta med ruteniumkomplex 10 mg/l ph 7,0 (9). Biotinylerade monoklonala anti-ca 19-9-antikroppar (mus) 3 mg/l. Monoklonala anti- CA 19-9-antikroppar (mus) märkta med ruteniumkomplex 4 mg/ml, ph 6,5 (11). (Lot nr för samtliga reagens 00172014). Diluent universal användes vid spädning av CA 15-3, 20 µl prov späds automatiskt 1:10. Lösningen användes också vid spädning av prover med koncentrationer över mätintervallet (9). 3.4 Analys av CA 125, CA 19-9 och CA 15-3 Instrumentet aspirerade 20 µl prov som under första inkubationen bildade ett komplex med monoklonala biotinylerade antikroppar (CA 125, 15-3 eller 19-9) och monoklonala antikroppar märkta med ruteniumkomplex (CA 125, CA 15-3 eller CA 19-9). Under andra inkubationen tillsattes streptavidintäckta paramagnetiska mikropartiklar som band till komplexet. Vidare i mätkyvetten tillsattes ProCell (Roche Diagnostics) innehållande tripropylamin. Obundna substanser tvättades därefter bort. Emissionen mättes med en fotomultiplikator. Mikropartiklarna avlägsnade genom tillsättning av Cleancell (Roche Diagnostics) (6, 13). 3.5 Kalibrering Kalibrering skedde på instrument 1 och 2 med CalSet (CA 125 II, CA 15-3 II och CA 19-9), innehållande humant serum matrix med tillsats av humant cancerantigen i två koncentrationsnivåer. CA 125 (35 och 500 U/ml), CA 15-3 (15 och 100 U/ml) eller CA 5

19-9 (20 och 250 U/ml). Kalibratorerna levererades bruksfärdiga. Vid kalibrering tillsattes 150 µl av varje kalibratornivå i varsin provkopp för analys. 3.6 Kontroller Kontroller (PreciControl Tumor Marker, Lot: 176079) i två koncentrationsnivåer, låg (TM1) och hög (TM2) från företaget Roche Diagnostics (tabell II). Kontrollerna innehållande humant serum gjordes i ordning genom att tillsätta 3,0 ml destillerat vatten till en kontrollflaska. Dessa fick stå och lösas upp i 30 minuter innan de blandades försiktigt för att undvika skumbildning (13). Mängden kontroll som användes anpassades efter hur många prover som skulle analyseras den dagen (150 µl-300 µl). Tabell II: Godkänt kontrollintervall och åsatt kontrollvärde för den låga (TM1) och höga (TM2) kontrollen för samtliga tre markörer från Roche Diagnostics. PreciControl TM 1 PreciControl TM 2 Åsatt värde ku/l Kontrollintervall ku/l Åsatt värde ku/l Kontrollintervall ku/l CA 125 36,4 28,8-44,0 108 85,5-131 CA 15-3 18,3 14,5-22,1 94,2 74,4-114 CA 19-9 21,9 16,0-27,8 105 83,0-127 3.7 Precisionsstudier Analys skedde på instrument 1 och instrument 2. Den mellanliggande precisionen beräknades genom analys av kontroller med två koncentrationsnivåer under 5 dagar med 6 replikat per dag på varje instrument. Repeterbarheten beräknades genom att analysera 20 replikat av varje kontrollnivå på varje instrument (17). 3.8 Korrelationsstudier Analys av patientproverna genomfördes på instrument 1 vid analys av CA 125 och CA 19-9. Analys av CA 15-3 skedde på instrument 1 och 2. Patientproverna rumstempererades (20 C) och centrifugerades i 10 minuter vid 2000 g innan analys. 3.9 Statistik Beräkningarna gjordes i Excel 2007 (17). Medelvärde (Mv) och standardavvikelse (SD) samt variationskoefficient (CV %) beräknades. CV uttrycks som standardavvikelse i procent av medelvärdet, enligt formel 100 (18). Till korrelationsstudien användes en mall i Excel (EP 9-A) från Clinical laboratory standards institut (CLSI) där differensen mellan instrumenten beräknades och redovisades i en kurva med linjärt samband. Graden av det linjära sambandet mättes med hjälp av Pearsons korrelationskoefficient (r) som beräknades genom att dra kvadratroten ur 6

determinationskoefficienten (r 2 ). Den linjära regressionen visades med ekvationen = + (17, 19). 3.10 Miljö Material som kalibratorer, kontroller, patientprover och andra tillbehör sorterades enligt lokala riktlinjer. Kontroller och kalibratorer innehåller humant material och ska hanteras som ett patientprov då handskar ska användas vid hantering. Alla produkter som innehåller humant blod testat för smitta men en potentiell risk för smitta kan förekomma och produkterna ska hanteras med samma varsamhet som ett patientprov (6). 3.11 Etik Patientproverna som erhölls från Aleris Medilab var avidentifierade. Som biomedicinsk analytiker är det viktigt att tänka på att det finns en patient bakom varje prov, tystnadsplikten och sekretesslagen ska följas (20). 4 RESULTAT 4.1 Kalibrering Kalibreringen blev godkänd på instrument 1 och instrument 2 med båda kalibratornivåerna för samtliga tre markörer. Kontrollerna som analyserades efter kalibrering blev godkända då de låg inom sina kontrollintervall för respektive markör (tabell II). 4.2 Mellanliggande precision 4.2.1 CA 125 Låg kontroll Den mellanliggande precisionen vid analys av CA 125 med den låga kontrollnivån gav ett CV på 4,8 % på instrument 1 och 4,4 % på instrument 2 (tabell III). Avvikande värden sågs dag 3 då instrument 2 erhöll högre medelvärde (40,2 ku/l) än resterande dagar. Högre spridning bland värdena sågs dag 3 på instrument 1 (SD 1,6 ku/l). Resterande dagar var precisionen lika då en SD under eller lika med 1 erhölls på båda instrumenten (bilaga, 1 tabell a). 7

Hög kontroll Den mellanliggande precisionen vid analys av CA 125 med den höga kontrollnivån gav ett CV på 4,6 % på instrument 1 och 4,7 % på instrument 2 (tabell III). Avvikande värden sågs dag 3, 4 och 5 då CV värdet var högre med instrument 2. Dag 3 erhölls också ett högt medelvärde (120,4 ku/l) på instrument 2 jämfört med instrument 1 (bilaga 1, tabell b). Samtliga dagar är det instrument 1 som har bäst precision med lägst CV. Medelvärdet är högre än det åsatta värdet (108 ku/l) med instrument 1 (116 ku/l) och instrument 2 (115 ku/l) (tabell III). Tabell III: Mellanliggande precision vid analys av CA 125 på instrument 1 och 2 med två kontrollnivåer. Det åsatta CV värdet är angivet från företaget Roche Diagnostics. Mv=medelvärde. SD=standardavvikelse. CV=variationskoefficient. 6 replikat/dag = 30 CA 125 ku/l Instr. Mv (ku/l) SD C V % Åsatt CV % Låg (36,4) 1 36,3 1,8 4,8 2,5 2 37,7 1,7 4,4 Hög (108) 1 116 5,3 4,6 2,7 2 115 5,3 4,7 4.2.2 CA 15-3 Låg kontroll Den mellanliggande precisionen vid analys av CA 15-3 med den låga kontrollnivån gav ett CV på 3,9 % på instrument 1 och 3,1 % på instrument 2. CV värdet på instrument 1 är högre än det åsatta CV värdet (3,6 %), medan CV värdet för instrument 2 (3,1 %) är under det åsatta CV värdet (tabell IV). Vid sammanställning av resultat för instrument 1 och 2 erhölls ett CV på 7,1 %. Högre CV, medelvärde och SD erhölls med instrument 2 jämfört med instrument 1 med avvikande värden dag 3 då instrument 1 erhöll högre CV och SD värden (bilaga1, tabell c). Hög kontroll Den mellanliggande precisionen vid analys av CA 15-3 med den låga kontrollnivån gav ett CV på 5,2 % på instrument 1 och 4,4 % på instrument 2. CV värdet för båda instrumenten är högre än det åsatta värdet (4,2 %) (tabell IV). Högre medelvärde erhölls på instrument 2 jämfört med instrument 1 samtliga dagar. Högre CV och SD erhölls med instrument 2 jämfört med instrument 1 alla dagar förutom dag 3 då instrument 1 erhöll högre värden (bilaga 1, tabell d). Vid sammanställning av resultat för instrument 1 och 2 erhölls ett CV på 7,6 % (bilaga 1, tabell d). 8

Tabell IV: Mellanliggande precision vid analys av CA 15-3 på instrument 1 och 2 med två kontrollnivåer. Det åsatta CV värdet är angivet från företaget Roche Diagnostics. 6 replikat/dag = 30. CA 15-3 ku/l Instr. Mv (ku/l) SD C V % Åsatt CV % Låg (18,3) 1 17,1 0,7 3,9 3,6 2 19,4 0,6 3,1 Hög (94,2) 1 89,3 4,6 5,2 4,2 2 101 4,4 4,4 4.2.3 CA 19-9 Låg kontroll Den mellanliggande precisionen vid analys av CA 19-9 med den låga kontrollnivån gav ett CV på 7,8 % på instrument 1 och 3,6 % på instrument 2. CV värdet på instrument 1 ligger över det åsatta CV värdet (4,8 %), CV värdet på instrument 2 är under det åsatta CV värdet (tabell V). Högre medelvärde erhölls på instrument 2 jämfört med instrument 1 samtliga dagar förutom dag 1 då högre medelvärde erhölls med instrument 1. Dag 1, 2 och 3 erhölls lägre SD och CV med instrument 2 jämfört med instrument 1. Dag 4 och 5 erhölls längre SD och CV värden med instrument 1 (bilaga 1, tabell e). Medelvärdet på instrument 1 (21,6 ku/l) och instrument 2 (23,6 ku/l) ligger nära det åsatta värdet (21,9) (tabell V). Hög kontroll Den mellanliggande precisionen vid analys av CA 19-9 med den höga kontrollnivån gav ett CV på 4,5 % på instrument 1 och 2,6 % på instrument 2. CV värdet på instrument 1 ligger över det åsatta CV värdet (3,8 %), CV värdet på instrument 2 ligger under det åsatta CV värdet (tabell V). Högre medelvärden erhölls på instrument 2 jämfört med instrument 1 samtliga dagar. Dag 2, 3 och 4 erhölls lägre CV och SD på instrument 2 jämfört med instrument 1. Dag 1 och 2 erhölls lägre resultat på instrument 1 (bilaga 1, tabell f). Medelvärdet på instrument 1 (108 ku/l) ligger nära det åsatta värdet (105 ku/l), på instrument 2 är det totala medelvärdet (118 ku/l) högre än det åsatta värdet (tabell V). Tabell V: Mellanliggande precision vid analys av CA 19-9 på instrument 1 och 2 med två kontrollnivåer. Det åsatta CV värdet är angivet från företaget Roche Diagnostics. 6 replikat/dag = 30. CA 19-9 ku/l Instr. Mv (ku/l) SD C V % Åsatt CV % Låg (21,9) 1 21,6 1,7 7,8 4,8 2 23,6 0,8 3,6 Hög (105) 1 108 4,9 4,5 3,8 2 118 3,0 2,6 9

4.3 Repeterbarhet 4.3.1 CA 125 Instrument 1 Analys av CA 125 med den låga kontrollnivån på instrument 1 gav ett CV på 1,7 %, ett värde som ligger under det åsatta CV värdet (1,9 %) (tabell VI). Det lägst uppmätta värdet blev 35,8 ku/l och det högsta 38,0 ku/l (bilaga 2, tabell a). Analys av CA 125 med den höga kontrollnivån på instrument 1 gav ett CV värdet på 1,9 %, ett värde som ligger över det åsatta CV värdet (1,4 %). Medelvärdet (119 ku/l) på instrument 1 är högre än det åsatta värdet (108 ku/l) (tabell V). Spridning mellan resultaten ses då det lägsta resultatet som erhölls var 114 ku/l och det högsta 122 ku/l (bilaga 2, tabell a). Instrument 2 Analys av CA 125 med den låga kontrollnivån på instrument 2 gav ett CV värde på 2,8 %, ett värde som ligger över det åsatta CV värdet (1,9 %) (tabell VI). Det lägst uppmätta värdet blev 35,6 ku/l och det högsta 38,9 ku/l (bilaga 2, tabell b). Analys av CA 125 med den höga kontrollnivån på instrument 2 gav ett CV värde på 4,3 %, ett värde som ligger över det åsatta CV värdet 1,4 %. Det lägst uppmätta värdet blev 108 ku/l och det högst 123 ku/l (bilaga 2, tabell b). Tabell VI: Repeterbarhet för CA 125 analyserad på 2 Roche Cobas e411 instrument med två kontrollnivåer. Analys skedde 20 gånger. Det åsatta CV-värdet är från företaget Roche Diagnostics. CA 125 ku/l Instr. Mv (ku/l) SD C V % Åsatt CV % Låg (36,4) 1 36,8 0,6 1,7 1,9 2 37,3 1,1 2,8 Hög (108) 1 119 2,3 1,9 1,4 2 114 4,8 4,3 4.3.2 CA 15-3 Instrument 1 Analys av CA 15-3 med den låga kontrollnivån på instrument 1 gav ett CV värde på 3,6 %, ett värde som ligger över det åsatta CV värdet (2,5 %) (tabell VII). Det lägst uppmätta värdet blev 16,3 ku/l och det högsta 18,2 ku/l (bilaga 2, tabell c). Analys av CA 15-3 med den höga kontrollnivån på instrument 1 gav ett CV värde på 3,5 %, som ligger över det åsatta CV värdet 3,7 % (tabell VII). Det lägst uppmätta värdet blev 79,1 ku/l och det högsta 92,5 ku/l (bilaga 2, tabell c). 10

Instrument 2 Analys av CA 15-3 med den låga kontrollnivån på instrument 2 gav ett CV värde på 3,5 %, som ligger över det åsatta CV värdet (2,5 %) (tabell VII). Det lägst uppmätta värdet blev 17,8 ku/l och det högsta blev 20,3 ku/l (bilaga 2, tabell d). Analys av CA 15-3 med den höga kontrollnivån gav ett CV värde på 4,9 %, som ligger över det åsatta CV värdet (3,7 %) (tabell VII). Det lägst uppmätta värdet blev 91,1 ku/l och det högsta 109 ku/l (bilaga 2, tabell d). Tabell VII: Repeterbarhet för CA 15-3 analyserad på 2 Roche Cobas e411 instrument med två kontrollnivåer. Analys skedde 20 gånger. Det åsatta CV-värdet är från företaget Roche Diagnostics. CA 15-3 ku/l Instr. Mv (ku/l) SD C V % Åsatt CV % Låg (18,3) 1 17,4 0,6 3,6 2,5 2 19,1 0,7 3,5 Hög (94,2) 1 87,1 3,1 3,5 3,7 2 101 5,0 4,9 4.3.3 CA 19-9 Instrument 1 Analys av CA 19-9 med den låga kontrollnivån på instrument 1 gav ett CV värde på 3,2 %, som ligger under det åsatta CV värdet (4,4 %) (tabell VIII). Det lägst uppmätta värdet blev 19,8 ku/l och det högsta 21,7 ku/l (bilaga 2, tabell e). Analys av den höga kontrollen gav ett CV värde på 1,7 %, som ligger under det åsatta CV värdet (2,9 %) (tabell VII). Det lägst uppmätta värdet blev 99,8 ku/l och det högsta 106 ku/l (bilaga 2, tabell e). Instrument 2 Analys av CA 19-9 med den låga kontrollnivån på instrument 2 gav ett CV värde på 4,1 %, som ligger under det åsatta CV värdet (4,4 %) (tabell VIII). Det lägst uppmätta värdet blev 22,1 ku/l och det högsta 25, 9 ku/l (bilaga 2, tabell f). Analys av den höga kontrollen gav ett CV värde på 2,7 %, som ligger under det åsatta CV värdet (2,9 %) (tabell VIII). Medelvärdet (118 ku/l) är högre än det åsatta värdet (105 ku/l) (tabell VIII). Det lägst uppmätta värdet blev 113 ku/l och det högsta 124 ku/l (bilaga 2 tabell f). 11

Tabell VIII: Repeterbarhet för CA 19-9 analyserad på 2 Roche Cobas e411 instrument med två kontrollnivåer. Analys skedde 20 gånger. Det åsatta CV-värdet är från företaget Roche Diagnostics. CA 19-9 ku/l Instr. Mv (ku/l) SD C V % Åsatt CV % Låg (21,9) 1 20,9 0,7 3,2 4,4 2 24,1 1,0 4,1 Hög (105) 1 104 1,7 1,7 2,9 2 118 3,2 2,7 4.4 Korrelationsstudier 4.4.1 CA 125 Jämförelsen mellan Abbot Architect och Roche Cobas e411 (instrument 1) avseende analys av CA 125 (n=23) resulterade i en korrelationskoefficient på 0,9 (figur 3). Det finns en positiv bias då analys med Roche Cobas e411 gav högre värden jämfört med analys med Abbot Architect (figur 4). Ingen nivåskillnad erhölls mellan metoderna, dvs. inget värde var lägre än cut off värdet (<35 ku/l) med en metod och högre än cut-off värdet (>35 ku/l) med den andra metoden (bilaga 3, tabell b). Figur 3: Korrelationsstudie mellan Abbot Architect och Roche Cobas e411 (instrument 1) (n=32) Med avseende på analys av CA 125. Bilden till vänster är ursprungsbilden där samtliga värden anges. Bilden till höger har de höga värdena (> 100 ku/l) (prov nr 2, 4, 7 och 18) tagits bort för att lättare se spridningen bland de låga resultaten. (X: Abbot, Y: Roche, instrument 1) 12

Figur 4: Bias av CA 125 på instrument 1 (n=32). Bilden till vänster visar de låga talen (<100 ku/l). Bilden till höger visar de höga värdena (>100 ku/l) (prov nr 2, 4, 7, 18 och 19) (X: Abbot, Y-X: Differensen mellan Roche, instrument 1 och Abbot). 4.4.2 CA 15-3 Jämförelsen mellan Abbot Architect och Roche Cobas (instrument 1) avseende analys av CA 15-3 (n=17) resulterade i en korrelationskoefficient på 0,96 (figur 5). Det finns en positiv bias då analys med instrument 1 gav högre värden jämfört med analys med Abbot Architect (figur 6). En nivåskillnad erhölls mellan metoderna då två värden (prov nr 6 och 12) var lägre än cut off värdet (<30 ku/l) med Abbot Architect och högre än cut-off värdet (>25 ku/l) med instrument 1 (bilaga 3, tabell c och d). Figur 5: Korrelationsstudie mellan Abbot Architect och Roche Cobas e411 (instrument 1) med avseende på analys av CA15-3. Bilden till vänster är ursprungsbilden där samtliga värden anges (n=17). I bilden till höger har de höga värdena (>100 ku/l) (prov nr 4, 11 och 16) tagits bort för att lättare se spridningen bland de låga resultaten (<100 ku/l). (X: Abbot, Y: Roche, instrument 1). 13

Figur 6: Bias av CA 15-3 på instrument 1 (n=17). Bilden till vänster visar de låga värdena (<100 ku/l) och bilden till höger visar de höga värdena (>100 ku/l) prov nr. 2, 11 och 16. (X: Abbot, Y-X: Differensen mellan Roche, instrument 1 och Abbot). Jämförelse mellan Abbot Architect och Roche Cobas e411 (instrument 2) avseende analys av CA 15-3 (n=17) resulterade i en korrelationskoefficient på 0,7 (figur 7). Det finns en positiv bias då analys med instrument 2 gav högre värden jämfört med analys med Abbot Architect (figur 8). En nivåskillnad erhölls mellan metoderna då två värden (prov nr 12 och 14) var lägre än cut-off värdet (<30 ku/l) med Abbot Architect och högre än cut-off (>25 ku/l) med instrument 2 (bilaga 3, tabell e och f). Figur 7: Korrelationsstudie mellan Abbot Architect och Roche Cobas e411 (instrument 2) med avseende på analys av CA 15-3 (n=17). (X: Abbot, Y: Roche, instrument 2) Figur 8: Bias av CA 15-3 på Abbot Architect och Roche Cobas e411(instrument 2), (n=17). Bilden till vänster visar de låga värdena (<80 ku/l) och bilden till höger visar de höga värdena ( 81 ku/l) (prov nr 4, 9, 11 och 16). (X: Abbot, Y-X: Differensen mellan Roche instrument 2 och Abbot). 14

Jämförelse mellan Roche Cobas instrument 1 och 2 avseende analys av CA 15-3 (n=17) resulterade i en korrelationskoefficient på 0,8 (figur 9). Det finns en positiv bias då analys med instrument 2 oftare gav högre värden än instrument 1 (figur 10). En nivåskillnad erhölls då ett värde var lägre än cut-off värdet med instrument 1 och högre med instrument 2 (bilaga 3, tabell g och h). 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 y = 0,5643x + 17,006 R² = 0,6821 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 X Figur 9: Korrelationsstudie mellan Roche instrument 1 och instrument 2 (n=17) med avseende på analys av CA 15-3. (X: instrument 1, Y: instrument 2) Figur 10: Bias av CA 15-3 på Roche Cobas instrument 1 och 2 (n=17). Bilden till vänster visar de låga värdena (<80 ku/l) och bilden till höger visar de höga värdena ( 81 ku/l) (prov nr 4, 9, 11 och 16). (X: instrument 1, Y-X: Differensen mellan instrument 1 och 2). 4.4.3 CA 19-9 Jämförelsen mellan Abbot Architect och Roche Cobas e411 (instrument 1) avseende analys av CA 19-9 (n=19) resulterade i en korrelationskoefficient på 0,68 (figur 11). En nivåskillnad erhölls med två värden (prov nr 6 och 15) då de med Abbot Architect var lägre än cut-off värdet (<35 ku/l) och med Roche Cobas e411 högre (>27 ku/l) (bilaga 3, tabell i och j). Vid analys av de låga värdena (<100 ku/l) gav Roche Cobas e411 högre värden jämfört med Abbot Architect. Vid analys av de höga värdena (>100 ku/l) gav Abbot Architect högre värden jämfört med Roche Cobas e411 (figur 12). 15

Avvikelser ses med prov nr 16 då högre värden erhölls med Abbot Architect (11316 ku/l) och lägre med Roche Cobas e411 (98 ku/l) (bilaga 3, tabell j). Figur 11: Korrelation av CA 19-9 mellan Abbot Architect och Roche Cobas e411 (instrument 1) (n=19). Bilden till vänster är ursprungsbilden där samtliga värden anges. Bilden till höger har de höga värdena (>100 ku/l) tagits bort (prov nr 1, 3, 4, 8, 10, och 16). (X: Abbot, Y: Roche) Figur 12: Bias av CA 19-9 på instrument 1 (n=19). Bilden till vänster visar prov nr 2, 5, 6, 7, 11, 13, 17, 18 och 19. Bilden till höger visar resterande prov nr. (X: Abbot, Y-X: Differensen mellan Roche och Abbot). 5 DISKUSSION Syftet med studien var att verifiera analysmetoderna för tumörmarkörerna CA 125, CA 15-3 och CA 19-9 på två Roche Cobas e411 instrument inför införandet av dessa vid avdelningen för klinisk kemi och transfusionsmedicin, Landstinget Kalmar län. Eftersom alla tre tumörmarkörer, CA 125, CA 15-3 och CA 19-9, kan öka i koncentration i plasma/serum även vid andra tillstånd än cancer kan det vara svårt att helt säkert veta att det är en tumör och inte ett annat sjukdomstillstånd. Även graviditet och operation kan orsaka ökande koncentrationer av markörerna i plasma/serum. Därför bör markörerna inte användas för diagnostisering utan som stöd och för att följa en tumörsjukdom vid behandling (3). 16