DiviTum V2. Bruksanvisning IVD. Denna bruksanvisning avser endast DiviTum V2. Ref. 932, rev. SV 1

Transkript

1 DiviTum V2 Bruksanvisning Denna bruksanvisning avser endast DiviTum V2 IVD 40 Ref. 932, rev. SV 1 1

2 Innehåll 1. Introduktion... 3 Avsedd användning... 3 Bakgrund... 3 Analysprincipen för DiviTum V DiviTum testets egenskaper Information inför användning... 4 Översikt över arbetsgången... 4 Generella säkerhetsrutiner:... 4 Provtagning, beredning, transport och lagring... 5 Utrustning och material som krävs, men inte medföljer Kitkomponenter... 6 Förvaring och behandling av reagenserna Utförande Uträkning av TK-aktivitet

3 1. Introduktion Avsedd användning DiviTum V2 är en icke-radioaktiv högkänslig IVD produkt avsedd för kvantitativ bestämning av tymidinkinasaktivitet i serum. Bakgrund Tymidinkinas (TK) är ett enzym som har en nyckelfunktion vid DNA-syntesen och därigenom vid celldelning. TK konverterar deoxitymidin till deoxitymidinmonofosfat som efter vidare konverteringar används som byggsten i DNA. Det finns två former av TK, men endast den ena formen, TK1, visar ökad aktivitet vid celldelning. Korrelation mellan förhöjd TK-aktivitet och cancer och tumörers aggressivitet har visats i många studier sedan den första publikationen Förutom vid malign sjukdom har förhöjda TKaktivitetsnivåer i serum visats vid vitamin B 12 -brist och vissa virusinfektioner men förekommer även vid sårläkning och även i andra kroppsvätskor. DiviTum V2 testet är endast godkänt för användning med serumprover. Ytterligare information om tymidinkinas samt referenser finns på vår hemsida: Analysprincipen för DiviTum V2 Serumprovet blandas med en reaktionsblandning med bromdeoxiuridin som av TK från provet fosforyleras till sitt monofosfat. BrdU monofosfatet fosforyleras vidare till trifosfat av andra kinaser i reaktionslösningen och inkorporeras av omvänt transkriptas i en DNA-sträng som är bunden till mikrotiterplattan. Därefter tillsätts en antikropp mot bromdeoxiuridin som är konjugerad till alkaliskt fosfatas. Mängden inbunden antikropp bestäms genom en alkalint fosfatas-beroende färgreaktion. Resultatet av färgreaktionen mäts i en plattläsare. Vid hög serum TK-aktivitet erhålls ett högt absorbansvärde. Med användning av en standardkurva omräknas absorbansvärdet till TK-aktivitet angivet som DiviTum units per liter (Du/L). 3

4 DiviTum testets egenskaper DiviTum V2-testet har i vårt referenslaboratorium en nedre gräns för arbetsområdet på 20 Du/L (Lower limit of quantitaton). Rekommenderat arbetsområde är från 20 Du/L upp till 4000 Du/L eller läsarens övre absorbansgräns, då denna motsvarar en TK-aktivitet lägre än 4000 Du/L. Precisionen (Variationskoefficienten, CV) vid 100 Du/L är bättre än 20%. Definition av enheten Du/L: 1000 Du/L är den aktivitet som erhölls med ett referensprov som innehöll 1000 ng rekombinant TK per liter. I kliniska serumprover har TK-aktiviteter på mindre än 10 till mer än Du/L noterats. 2. Information inför användning Varje kit innehåller material för analys av 40 prover i duplikat. 2 x 20 µl krävs av varje prov. För att få god noggrannhet skall alla patientprover analyseras i duplikat. Hela testproceduren genomförs normal på mindre än 8 timmar. Översikt över arbetsgången Planera arbetet. Rekonstituera komponenter. Späd proverna i spädningsplattan. Förbered reaktionsblandningen, sätt den till testplattan. Överför spädda prover till testplattan och inkubera. Tvätta testsplattan för att stoppa enzymreaktionen. Sätt antikropp konjugerad till alkalint fosfatas till testplattan och inkubera. Tvätta testplattan för att avlägsna överskottet av antikroppskonjugatet. Sätt kromogen substratlösning till testplattan. Mät absorbansen efter 30 minuter och 60 minuter. Beräkna TK-aktiviteten i patientproverna med hjälp av standardkurva. Generella säkerhetsrutiner: Behandla patientprov, material och utrustning som potentiellt smittförande. Använd skyddskläder och handskar. 4

5 Kitkomponenter innehåller natriumazid i låg koncentration. Undvik kontakt med hud eller slemhinnor. Spola efter med stora mängder vatten när lösningar hälls ut i avloppet. Kombinera inte komponenter från olika DiviTum V2-kit. Kontrollera utgångsdatum. Stor noggrannhet måste iakttas vid pipettering och tvätt för att förhindra korskontamination och spädningsfel. Provtagning, beredning, transport och lagring Proverna bör endast bestå av serum. Blodkoagel skall tas bort från prover omedelbart efter koagulering. Under transport skall prover hållas kylda (2-8 C) eller frysta. Prover kan förvaras i kylskåp vid 2-8 C i upp till 3 dagar före analys. Långtidslagring av prover kräver temperatur under -18 C. Frysta sera måste blandas noga efter upptining. Använd inte prover som är grovt lipemiska eller hemolyserade. Utrustning och material som krävs, men inte medföljer Avjoniserat eller destillerat vatten. Inkubationsskåp (37 ± 1 C). Plattläsare med filter 405 nm och 630 nm. Plattvätt (En tvätt med over flow-funktion rekommenderas) Pipett 20 µl. 5 ml och/eller 10 ml mätpipetter. Flerkanalspipetter (8 eller 12 kanaler, volym mellan µl). Pipettspetsar. Flaska > 1 L för blandning av tvättvätska. Antiskummedel till waste bottle. Absorberande papper 5

6 3. Kitkomponenter Namn Beskrivning Förpackning Antal Volym Självhäftande tejpfolie 3 Lock till mikrotiterplatta 1 Vannor 4 Provspädningsplatta (96 brunnar) Godkännandecertifikat för kit 1 Reaction Plate Testplatta (96 brunnar) aluminiumpåse 1 Reaction Buffer Provspädningsvätska, Rekonstitutionsbuffert plastflaska 1 40 ml REAG A V2 Reagens A (frystorkad) 15 ml glasflaska 1 REAG B Reagens B (frystorkad) 15 ml glasflaska 1 Control Low Låg kontroll (frystorkad) 4 ml glasflaska 1 Control High Hög kontroll (frystorkad) 4 ml glasflaska 1 Standard 1 Standardprov 1 4 ml glasflaska 1 Standard 2 Standardprov 2 4 ml glasflaska 1 Standard 3 Standardprov 3 4 ml glasflaska 1 Standard 4 Standardprov 4 4 ml glasflaska 1 Wash buffer Tvättbuffert 15 ml glasflaska 1 13 ml Dil Conj Enz Rekonstitutionsbuffert för enzymkonjugat 15 ml glasflaska 1 12,5 ml Conj Enz V2 Enzymkonjugat, frystorkat 15 ml glasflaska 1 Buf Subs Conj Enz Subs Rekonstitutionsbuffert för kromogent substrat. Substrat för alkalint fosfatas 15 ml brun glasflaska 1 13,5 ml Tablett pnpp i blisterförpackning 1 1 Förvaring och behandling av reagenserna Kit kan användas fram till utgångsdatum om det förvaras vid -18 C eller kallare. Vid förvaring i kylskåp (+8 C eller kallare) skall kit användas inom 2 veckor. Tina frysta reagens vid rumstemperatur och blanda försiktigt före användning. Rekonstituerade reagens skall inte sparas. 6

7 4. Utförande Viktigt: Följ anvisningarna för genomförandet noga. 1. Planera arbetet. Välj patientprover och sätt upp ditt protokoll för testet med provernas placering på plattan angivna. Patientprover, Standarder och kontrollprover skall alltid köras i duplikat. Prover som tidigare konstaterats ha TK aktivitet som överskriver den övre gränsen för mätområdet körs om, dels i normal spädning (=1/10), och dels spädda ytterligare 10 gånger (=1/100). Observera att analysen alltid skall utföras med den serummängd och de inkubationstider som anges i denna bruksanvisning. Fyra brunnar på plattan skall användas som bakgrundskontroll. 2. Tina följande komponenter. Reag A V2, Reag B, control low, control high, standarder, Reaction Plate och Reaction Buffer. 3. Rekonstituera reagens. Sätt 10 ml Reaction Buffer till Reag A V2. Blanda försiktigt. Sätt 3 ml Reaction Buffer till Reag B. Blanda försiktigt. Sätt 200 µl Reaction Buffer till flaskorna med kontroller och standarder. Placera alla flaskor på en shaker under tiden provspädningen (steg 4 och 5) genomförs, dock minst 20 och som mest 60 minuter. 4. Sätt Reaction Buffer till provspädningsplattan Sätt 180 µl Reaction Buffer per brunn i de brunnar som skall användas. 5. Sätt prover till provspädningsplattan Sätt 20 µl serumprov, kontroll eller standard till de brunnar som skall användas enligt ditt protokoll. OBS! tvätta pipettspetsen genom att pumpa upp och ned en extra gång i spädningsvätskan för att få ut allt serum. 6. Blanda prover och reaktionsblandning genom att pumpa upp och ned 5 gånger med en 100 µl multikanalspipett. 7. Iordningställ reaktionsblandningen Blanda REAG B försiktigt. Sätt 2 ml till REAG A V2 och blanda försiktigt. 7

8 8. Sätt reaktionsblandning till brunnarna i testplattan Sätt 100 µl reaktionsblandning till alla brunnar i testplattan som skall användas med en multikanalpipett. Glöm inte brunnarna för bakgrundsmätning. 9. För över prover till testplattan För över 20 µl av utspädda patientprover, kontroller, standarder och bakgrunder från brunnarna i provspädningsplattan till motsvarande brunnar i testplattan med en multikanalpipett, Detta startar TK-reaktionen. 10. Inkubering Förslut testplattan med bifogad plastfolie för att förhindra avdunstning. Placera plattan på ett skakbord och låt skaka försiktigt under en minut. Inkubera sedan vid 37 C i 180 minuter. 11. Tina under tiden följande komponenter. Wash Buffer, Dil Conj Enz, Conj Enz V2, Buf Subs och Conj Enz Subs. 12. Förbered tvättbuffert Späd Wash Buffer med avjoniserat vatten till en slutlig volym av 1 L. För att undvika kraftig skumbildning sätts den koncentrerade tvättbufferten till huvuddelen av vattnet först. Blanda sedan mycket noga, då stamlösningen av tvättbufferten är mycket viskös. Sätt anti-skummedel till uppsamlingsflaskan för använd tvättvätska för att minimera skumbildning. 13. Rekonstituera enzymkonjugat Sätt innehållet i Dil Conj Enz till Conj Enz V2. Placera på shaker min. 14. Tvätta testplattan Tvätta plattan med tvättbuffert tre gånger med en plattvätt med over flow-funktion. Tvättcykel 1: Ej overflowfunktion. 300 µl tvättvätska per brunn. Tvättcykel 2 och 3: Med overflowfunktion. 650 μl tvättvätska per brunn och cykel. Välj ett lågt tryck på flödet. Om en apparat med over flow-funktion inte är tillgänglig, tvätta 5 cykler, 300 µl per brunn. Efter tvätt dunkar man plattan 6 till 8 gånger mot absorberande papper för att avlägsna vätska. Därefter lämnas plattan upp och ned på absorberande papper i 10 minuter. 8

9 Slutligen dunkar man igen plattan 6 till 8 gånger mot absorberande papper. 15. Starta konjugatbindningen Tillsätt 100 µl rekonstituerad Conj Enz V2 per brunn i Reaction Plate. Täck plattan med den medföljande plastfolien. Inkubera vid 37 C under 60±10 minuter. 16. Bered substratlösning Låt substrattabletten, Conj Enz Subs, lösa sig minuter i flaskan med substratbuffert, Buf Subs. Blanda försiktigt före användning. 17. Tvätta reaktionsplattan Avsluta antikroppsinbindningen genom att tvätta Reaction Plate enligt beskrivningen i punkt 15 ovan. 18. Starta substratreaktionen Tillsätt 120 µl substratlösning per brunn. Täck med lock och inkubera vid 37 C i mörker. (Substratet är ljuskänsligt). 19. Absorbansmätningar Efter 30 minuters inkubation, mät absorbansen vid 405 nm med 630 nm som referensvåglängd. Upprepa absorbansmätningen efter ytterligare 30 minuters inkubation med lock vid 37 C. 20. Beräkna TK-aktivitetsvärden Räkna om de uppmätta absorbansvärdena till TK-aktivitet i Du/L. 9

10 5. Uträkning av TK-aktivitet Patientprover som efter 30 minuter har ett OD som överskrider den övre gränsen för den använda läsarens lineära arbetsområde kan inte utvärderas. De körs om, dels i normal spädning (=1/10), och dels spädda ytterligare 10 gånger (=1/100). För övriga brunnar subtraheras absorbansvärdena för 630 nm från absorbansvärdena för 405 nm för att beräkna delta OD. Avvikande värden för bakgrunder utesluts ur beräkningarna. Därefter beräknas medelvärde och standardavvikelse av delta OD för återstående bakgrunder. Medelvärdet av delta OD för bakgrunderna subtraheras från delta OD för proverna, (inklusive standarder och kontroller) för erhållande av delta OD minus bakgrund. Prover som har ett delta OD minus bakgrund lägre än 0,02 eller lägre än 2 gånger standardavvikelsen för bakgrunderna är osäkra och utesluts ur beräkningarna. Välj ett log-log program med linjär regression i ELISA-läsaren för beräkning av provernas TKaktivitet. Lägg in standardernas värden för TK-aktivitet i läsaren för att härleda standardkurvan (standardernas TK-värden anges i kit-certifikatet). Provernas aktivitet i Du/L beräknas ur standardkurvan. Beräkna C.V. för patienternas dubbelprovvärden i Du/L. Om C.V. är >20%, bör provet köras om. Normalt bör de värden som erhålls vid 1 timmes inkubation användas. Resultaten från 30 minuter inkubation skall endast användas för prover som vid 1 timmes inkubation överskrider arbetsområdet. Arbetsområdet sträcker sig upp till 4000 Du/L eller läsarens övre absorbansgräns, då denna motsvarar en TK-aktivitet lägre än 4000 Du/L. Prover som redan vid avläsningen efter 30 minuter ger värden över arbetsområdet skall köras om, dels i normal spädning (=1/10), och dels spädda ytterligare 10 gånger (=1/100). 10

11 Biovica International är certifierad enligt kvalitetsledningssystem standard SS-EN ISO för tillverkning och marknadsföring av kit för in vitro Klinisk kemi och dokumentation av dess kliniska användning av Lloyds Register Quality Assurance, certifikat nummer GBG Kontaktuppgifter: Biovica International AB Tel: Fax: E-post: Hemsida: Art. No: rev 932 SV