Mercodia MPO ELISA. Bruksanvisning REAGENSER FÖR 96 BESTÄMNINGAR. För in vitro diagnostiskt bruk. Tillverkad av

Transkript

1 Mercodia MPO ELISA Bruksanvisning REAGENSER FÖR 96 BESTÄMNINGAR För in vitro diagnostiskt bruk Tillverkad av Mercodia AB Sylveniusgatan 8A SE Uppsala Sverige

2 FÖRKLARING AV SYMBOLER SOM ANVÄNDS PÅ ETIKETTERNA = 96 Reagenser för 96 bestämningar Utgångsdatum Förvara vid 2 8 C Lotnr För diagnostisk användning in vitro Mercodia

3 ANVÄNDNING Mercodia MPO ELISA är en analys för kvantitativ bestämning av humant MPO i EDTA-plasma. SAMMANFATTNING Myeloperoxidas (MPO), ett järninnehållande glykoprotein, är ett kovalent bundet tetramerkomplex med en molekylvikt på 150 kda. Det består av två glykosylerade alfakedjor med en molekylvikt på kda och två icke-glykosylerade betakedjor med en molekylvikt på 14 kda. MPO finns i stor mängd i neutrofilernas primära azurofila granula, men förekommer även i monocyter. Som svar på mikrobiell invasion frisätts MPO från neutrofilernas cytoplasmiska granula till fagosomen och det extracellulära rummet, vilket katalyserar omvandlingen av väteperoxid och kloridjoner (Cl - ) till hypokloritsyra, ett potent oxidationsmedel. Den traditionella användningen av myeloperoxidas är som en markör för luftvägsinflammation orsakad av astma eller irriterande ämnen i omgivningen. Man tror också att MPO är delaktigt i olika skeden av aterogenesen samt att det skulle kunna främja ateroskleros. Sambandet mellan förhöjda MPO-nivåer i serum och kardiovaskulär sjukdom (CAD) ger stöd för att MPO spelar en viktig roll som inflammatorisk markör vid kardiovaskulär sjukdom, vilket gör det möjligt att identifiera patienter med risk för hjärtincidenter vid frånvaro av myokardiell nekros. TESTPRINCIP Mercodia MPO ELISA är en fast fas enzym immunoassay som baserar sig på sandwich -teknik, där två monoklonala antikroppar är riktade mot separata antigena determinanter på MPOmolekylen. Under inkuberingen reagerar MPO i provet med anti-mpo-antikroppar bundna till mikrotiterbrunnar. Efter tvätt tillsätts peroxidaskonjugerade anti-mpo-antikroppar. Efter den andra inkuberingen och en enkel tvätt som avlägsnar obunden enzymmärkt antikropp detekteras bundet konjugat genom reaktion med 3,3,5,5 -tetrametylbensidin (TMB). Reaktionen stoppas med tillsats av syra och resultatet avläses spektrofotometriskt. SÄKERHETSÅTGÄRDER För diagnostisk användning in vitro. Innehållet i detta kit eller rester av det får inte komma i kontakt med idisslande djur eller svin. Stop Solution i detta kit innehåller 0.5 M H 2 SO 4. Följ standardenliga säkerhetsåtgärder för hantering av farliga kemikalier. Alla patientprover ska hanteras som om de vore smittbärande. Varje brunn kan bara användas en gång. 3

4 MATERIAL SOM KRÄVS MEN EJ TILLHANDAHÅLLS Pipetter med lämpliga volymer (repeterbara pipetter är att föredra för tillsats av Assay Buffer, enzyme conjugate 1X lösning, Substrate TMB och Stop Solution) Provrör, Bägare och mätglas för iordningställande av reagens Provrör för provspädning Destillerat vatten Magnetomrörare Vortex mixer Mikrotiterplattläsare med 450 nm filter Plattskak varv per minut, orbital rörelse Tvättutrustning för mikrotiterplattor med overflow-funktion (rekommenderas men är inget krav) 4

5 REAGENSER Varje MPO ELISA-kit innehåller reagenser till 96 brunnar, tillräckligt för 42 prover och en kalibreringskurva i duplikat. Använd poolade reagenser från förpackningar med identiska lotnummer för större analysserier. Utgångsdatumet för hela kitet står på ytteretiketten. Rekommenderad förvaringstemperatur är 2 8 C. Coated Plate 1 platta 96 brunnar Färdig att användas Monoklonalt mus-anti-mpo Strips med 8 brunnar Oanvända mikrotiterstrips ska återförslutas i påsen med tejp, förvaras vid 2 8 C och användas inom 2 månader. Calibrators 1, 2, 3, 4, 5 5 flaskor μl Frystorkad Gul färgmärkning Tillsätt μl Koncentrationen anges på flaskans etikett destillerat vatten Förvaring efter rekonstituering: 2 8 C i 2 månader. per flaska Rekonstituerade kalibratorer som förvaras längre än 2 månader ska förvaras vid -20 C. Calibrator 0 1 flaska μl Färdig att användas Gul färgmärkning Sample Buffer 1 flaska 12 ml Färdig att användas Gul färgmärkning Assay Buffer 1 flaska 12 ml Färdig att användas Röd färgmärkning Enzyme Conjugate 11X 1 flaska 1.3 ml Beredning, Peroxidaskonjugerat monoklonalt mus-anti-mpo se nedan Enzyme Conjugate Buffer 1 flaska 13 ml Färdig att användas Blå färgmärkning. Wash Buffer 21X 1 flaska 50 ml Späd med 1000 ml Förvaring efter spädning: 2 8 C destillerat vatten för i 2 månader. framställning av wash buffer 1Xlösning. Substrate TMB 1 flaska 22 ml Färdig att användas Färglös vätska Obs! Ljuskänslig! Stop Solution 1 flaska 7 ml Färdig att användas 0.5 M H 2 SO 4 5

6 Beredning av enzyme conjugate 1X-lösning Bered den mängd enzyme conjugate 1X-lösning som behövs genom att späda Enzyme Conjugate 11X (1+10) med Enzyme Conjugate Buffer eller enligt tabellen nedan. Blanda varsamt. Vid beredning av enzyme conjugate 1X-lösning till en hel platta ska hela innehållet med Enzyme Conjugate Buffer hällas i flaskan med Enzyme Conjugate 11X. Enzyme Enzyme Antal strips Conjugate 11X Conjugate Buffer 12 strips (en platta) 1 flaska 1 flaska 8 strips 700 μl 7.0 ml 4 strips 350 μl 3.5 ml Förvaring efter spädning: 2 8 C i 2 veckor. PROVTAGNING OCH HANTERING I de preanalytiska hanteringsförhållandena är det viktigt att förebygga artificiell frisättning av MPO från neutrofiler i proverna eftersom det kan leda till falskt förhöjda resultat. Det är särskilt viktigt eftersom MPO har visat sig ha potential som en markör för kardiovaskulär sjukdom och det finns rapporter som kopplar samman förhöjda koncentrationer av cirkulerande MPO med ökad risk för kranskärlssjukdom, ökad risk hos patienter med akut koronart syndrom och klinisk nytta vid identifiering av och prognos för patienter med hjärtsvikt. Högre MPO-koncentrationer i heparin-plasma, citrat-plasma och serum kan förklaras av frisättning av MPO från neutrofiler in vitro och att ökningen är tidsberoende i rumstemperatur efter provtagning. EDTA-plasma rekommenderas för mätning av MPO eftersom värdena inte störs av dåligt kontrollerad frisättning av MPO från neutrofiler ex vivo och därför mer exakt kan återge den cirkulerande MPO-koncentrationen. EDTA-plasma EDTA-plasma rekommenderas som provtyp för bestämningar av MPO. Ta blod genom venpunktion i rör som innehåller EDTA som motverkar koagulation och separera plasmadelen genom centrifugering. Serum, heparin-plasma och citrat-plasma Serum, heparin-plasma och citrat-plasma kan användas i analysen. Serum eller förekomst av antikoagulerande heparin eller citrat har ingen effekt på mätningen av själva analyten, men i utvärderingen av resultaten måste eventuella effekter från den preanalytiska hanteringen tas med i beräkningen. 6

7 Förvaring EDTA-plasmablodprover kan förvaras 1 timme i rumstemperatur innan de centrifugeras vid 1500g i 10 min. Separerad plasma ska antingen analyseras direkt eller förvaras fryst under -20 C före analys. SPÄDNING AV PROVER I vanliga fall ska proverna spädas 1:5 (50 μl prov μl Sample Buffer) före analys. 7

8 TESTETS UTFÖRANDE Alla reagenser och prover måste rumstempereras före användning. En kalibratorkurva ska ingå i varje analysomgång. 1. Rekonstituera Calibrator 1 5 med 1000 µl destillerat vatten i vardera flaska. 2. Förbered enzyme conjugate 1X-lösning, wash buffer 1X-lösning och prover. 3. Förbered tillräckligt många mikrotiterbrunnar för att rymma Calibrators, kontroller och prover i duplikat. 4. Pipettera 25 µl vardera av Calibrators, kontroller och prover i lämpliga brunnar. 5. Tillsätt 100 µl Assay Buffer i varje brunn. 6. Inkubera på en plattskak ( rpm) i 1 timme vid rumstemperatur (18 25 C). 7. Tvätta 6 gånger med 700 μl wash buffer 1X-lösning per brunn, använd en automatisk mikrotiterplattskak med overflow-funktion. Vänd och knacka mikrotiterplattan ordentligt på absorberande papper efter den sista tvätten. Använd inte soak-funktionen i tvättproceduren. Eller manuellt, Avlägsna reaktionslösningen genom att vända mikrotiterplattan upp och ner över en slask. Tillsätt 350 μl wash buffer 1X-lösning till varje brunn. Avlägsna tvättlösningen genom att knacka bestämt flera gånger på absorberande papper för att ta bort överflödig vätska. Upprepa 5 gånger. Undvik långvarig soak under tvättproceduren. 8. Tillsätt 100 µl enzyme conjugate 1X-lösning till varje brunn. 9. Inkubera på en plattskak ( v/min) i 1 timme vid rumstemperatur (18 25 C). 10. Tvätta som i steg Tillsätt 200 µl Substrate TMB i varje brunn. 12. Inkubera i 15 minuter på bänken vid rumstemperatur (18 25 C). 13. Tillsätt 50 µl Stop Solution i varje brunn. Placera plattan på en plattskak i ca 5 sekunder så att lösningen blandas. 14. Läs av den optiska densiteten vid 450 nm och beräkna resultaten. Läs av inom 30 minuter. Obs! Användning av separata pipetter för konjugat och substrat rekommenderas för att undvika kontaminering. 8

9 INTERN KVALITETSKONTROLL Interna serumpooler med låga, mellan och höga MPO-koncentrationer bör regelmässigt analyseras som prover och resultaten bör kartläggas dag för dag. Det hör till god laboratoriesed att anteckna följande uppgifter för varje analys: kitets lotnummer, kitkomponenternas spädningsoch/eller rekonstitutionsdatum, OD-värden för Calibrators och kontroller. Laboratorier måste följa statliga regler och ackrediteringskrav vad gäller frekvens av kvalitetskontroller. BERÄKNING AV RESULTATEN Obs! Calibrator 0 (blank) ska inte användas i beräkningen av kalibratorkurvan. Datorberäkning Koncentrationen av MPO i prover ska om möjligt beräknas med datorstödd datareduktion. Jämför de erhållna absorbansvärdena med de kända koncentrationerna i Calibrators 1-5 och använd kubisk spline-regressionsanalys för att konstruera kalibratorkurvan. Multiplicera de beräknade MPO-koncentrationerna med spädningsfaktorn (t.ex. x5) Manuell beräkning 1. Märk ut absorbansvärdena som erhålls för Calibrators 1-5 mot den kända MPOkoncentrationen på ett log-log-papper och konstruera en kalibratorkurva för hand. 2. Läs av provernas koncentration från kalibratorkurvan. 3. Multiplicera MPO-koncentrationerna med spädningsfaktorn (t.ex. x5). 9

10 Exempel på resultat Brunnar Identitet A 450 Konc. μg/l** 1A-B Calibrator / C-D Calibrator 1* 0.101/ E-F Calibrator 2* 0.195/ G-H Calibrator 3* 0.453/ A-B Calibrator 4* 1.479/ C-D Calibrator 5* 2.471/ E-F Prov / G-H Prov / A-B Prov / * Koncentrationen anges på flaskans etikett **Resultatet multiplicerat med spädningsfaktorn (x5) Exempel på kalibratorkurva En typisk kalibratorkurva visas här. Använd inte den här kurvan för att fastställa verkliga analysresultat. Koncentration (μg/l) 10

11 METODENS BEGRÄNSNINGAR Liksom för alla andra diagnostiska tester bör man inte basera en definitiv diagnos på resultaten från ett enstaka test. Diagnosen bör ställas av en läkare efter att alla kliniska fynd har utvärderats. Starkt lipemiska, ikteriska eller hemolyserade prover interfererar inte med analysen. Separata pipetter bör användas för pipettering av konjugat och substrat. FÖRVÄNTADE VÄRDEN Det hör till god laboratoriesed att varje laboratorium fastställer sitt eget intervall för förväntade värden. PRESTANDAEGENSKAPER Detektionsgräns Detektionsgränsen definieras som detektionsförmågan enligt ISO11843-Part 1. Detektionsförmåga ska ses som en del av metodvalideringen snarare än den lägsta mätbara koncentrationen. Detektionsgränsen är lägre än koncentrationen för Calibrator 1, som fastställts enligt metoden som beskrivs i ISO11843-Part 4. Koncentrationen för prover med absorbansvärden som är lägre än Calibrator 1 ska inte beräknas. Istället ska de uttryckas som mindre än eller lika med ( ) koncentrationen som anges på Calibrator 1-flaskan. Hook-effekt Prover med koncentrationer på upp till µg/l har testats utan att ge falskt låga resultat. Recovery (utbyte) Utbyte vid tillsats är % (medel 89 %). Utbyte vid spädning är % (medel 101 %). Precision Varje prov analyserades i 4 replikat vid 33 olika tillfällen. Prov Medelvärde (µg/l) inom analys (%) Variationskoefficient mellan analys (%) total analys (%)

12 Specificitet Följande korsreaktioner har påvisats: TPO 0.01 % CRP 0.01 % EPO 3.53 % Lysosym 0.03 % Elastas 0.12 % alfa-1-antitrypsin 0.01 % KALIBRERING MPO ELISA-kitet kalibreras mot en höggradigt renad, fullt validerad, kommersiell MPO-beredning. GARANTI De uppgifter som presenteras här erhölls med användning av påvisat förfarande. Förändringar eller modifieringar av förfarandet som inte rekommenderas av Mercodia AB kan påverka resultaten. I dessa fall frånsäger sig Mercodia AB alla garantier, uttryckta, underförstådda eller lagstadgade, inklusive underförstådda säljbarhets- och användbarhetsgarantier. Mercodia AB och deras auktoriserade distributörer ska i sådana fall inte hållas ansvariga för direkta eller indirekta skador. 12

13 REFERENSER Baldus S. et al. (2003) Myeloperoxidase Serum Levels Predict Risk in Patients With Acute Coronary Syndromes. Circulation 108: Brennan M-L. et al. (2003) Prognostic value of Myeloperoxidase in Patients with Chest Pain. The New England Journal of Medicine 349: Carr A C. et al. (2000) Oxidation of LDL by Myeloperoxidase and Reactive Nitrogen Species. Arterioscler Thromb Vasc Biol 20: Hazen S L. et al. (1999) Formation of Nitric Oxide-Derived Oxidants by Myeloperoxidase in Monocytes. Circ. Res. 85: Nambi V. (2005) The Use of Myeloperoxidase As a Risk marker for Atherosclerosis. Current Atherosclerosis Reports 7: Zhang R. et al. (2001) Association between myeloperoxidase levels and risk of coronary artery disease. JAMA. 286: Klebanoff SJ. (2005) Myeloperoxidase: friend and foe. J Leukoc Biol 2005;77: Scheffer PG. et al. (2009) Myleoperoxidase concentrations in EDTA-plasma of healthy subjects are discordant with concentration in heparin-plasma and serum. Clin Biochem 42: Shih J. et al. (2008) Effect of Collection Tube Type and Preanalytical Handling on Myleoperoxidase Concentrations. Clin Chem 54: Schindhelm RK. et al. (2009) Myeloperoxidase: a useful biomarker for cardiovascular disease risk stratification? Clin Chem 55: Ytterligare referenser finns på vår hemsida: 13

14 SAMMANFATTNINGSPROTOKOLL Mercodia MPO ELISA Tillsätt Calibrators, kontroller* och prover 25 μl TIllsätt Assay Buffer Inkubera Tvätta plattan med wash buffer 1X-lösning Tillsätt enzyme conjugate 1X-lösning Inkubera Tvätta plattan med wash buffer 1X-lösning Tillsätt Substrate TMB Inkubera Tillsätt Stop Solution Mät A μl 1 timme vid C på en plattskak rpm 700 µl, 6 gånger 100 μl 1 timme vid C på en plattskak rpm 700 µl, 6 gånger 200 μl 15 minuter 50 μl Skaka i 5 sekunder så att lösningen blandas Utvärdera resultaten * Medföljer ej För fullständig information se sida Version 7.0