FluoroSpheres Kodnr. K0110

Transkript

1 FluoroSpheres Kodnr. K0110 Femte upplaga Kalibreringspärlor för daglig övervakning av flödescytometer. Satsen innehåller reagenser för 40 kalibreringar. ( ) K0110/SE/TJU/ p. 1/7

2 Innehåll Avsedd användning...2 Sammanfattning och förklaring...2 Testprincip...2 Reagenser...3 A. Tillhandahållet material...3 B. Ytterligare material som ej ingår...3 Förvaring...3 Testförfarande och datainsamling...3 Analys av data, kalibreringskurva...4 A. Definitioner...5 B. Manuell kalibrering. För instrument som uttrycker MFI i linjära värden...5 C. Manuell kalibrering. För instrument som uttrycker MFI i kanalnummer...6 Avsedd användning För diagnostisk användning in vitro. FluoroSpheres är avsett för övervakning av flödescytometerns prestanda. Sammanfattning och förklaring Kitet tillhandahåller blindpärlor och kalibreringspärlor med en storlek av 3,2 µm. Kalibrerinsgpärlorna är en blandning av fem pärlor med olika fluorscensintensitet och en icke fluorescerande pärla. Fångat i de fluorescerande pärlorna finns en kombination av unika fluorokromer vilka möjliggör excitering av ljus vid vilken som helst våglängd, från 365 till 650 nm. Eftersom pärlornas fluorokrom är annorlunda än det fluorokrom som vanligen användes inom flödescytometri är spektralegenskaperna annorlunda. Därför kan dessa pärlor ej användas för inställning av fluorescenskompensation. Med tilldelade molekyler med motsvarande fluorokromvärde (MEF) för det fluorescerande pärlbeståndet, möjliggör användandet av FluoroSpheres omvandlingen av godtyckliga enheter av genomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) till absoluta enheter för kvalitetssäkring och rapportering av flödescytometridata. Testprincip 1. Först analyseras blindpärlor för att etablera den optimala instrumentinställningen vid alla aktuella kanaler. 2. Därefter analyseras kalibreringspärlorna. Dessa data användes att konstruera kalibreringskurvan, där MFI plottas mot MEF. Kalibreringskurva och associerade statistiska parametrar användes vid utvärdering av instrumentets linjäritet. Dessutom kan även detektionströskel och dynamiskt område bestämmas från kalibreringskurvan. Sida ( ) K0110/SE/TJU/ p. 2/7

3 Kalibrering med hjälp av FluoroSpheres kan utföras på två sätt: Konstant instrumentinställning. Vid användandet av denna metod kommer samtliga instrumentinställningar att vara oförändrade. MFI för de olika topparna övervakas och resultaten visas som kalibreringsdatum kontra MFI. Konstant instrumentrespons. Vid denna metod justeras PMT-spänningen på så sätt att MFI vid en av de höga fluorescenstopparna visas i exakt samma kanal varje gång. Resultaten visas sedan som kalibreringsdatum kontra PMT-spänning. Reagenser A. Tillhandahållet material Vial 1 1,7 ml i 0,02 % sodiumazid, 0,01 % NP40 Vial 2 1,7 ml Innehåller blindpärlor och fem pärlblandningar med olika kvantiteter fluorokrom uttryckta i MEF värden för respektive FITC, RPE, RPE-TxRED, RPE-Cy5 och APC. För satsspecifika MEF-värden, se bilagt Blad för Analytiskt värde. I 0,02 % sodiumazid, 0,01 % NP40. B. Ytterligare material som ej ingår Allmän laboratorieutrustning för användning av flödescytometer. Semi- och dubbellogaritmiskt femcykel-grafiskt papper. Kalkylator. Mjukvara för analys av flödescytometridata. Kalkylprogram, såsom Microsoft Excel. Dessa program är tillval. Försiktighetsåtgärder 1. För professionella användare. 2. Denna produkt innehåller natriumazid (NaN 3), en kemikalie som i ren form är synnerligen toxisk. I produktkoncentrationer kan natriumazid, trots att det inte klassificeras som farligt, reagera med kopparrör och bilda högexplosiva metallazider. Skölj med stora mängder vatten när det kastas bort så att inte metallazider byggs upp i avloppen. Förvaring Förvara vid 2 8 C. Använd inte efter det utgångsdatum som är stämplat på vialen. Om reagensen förvaras i en annorlunda miljö än det specificerade, måste förhållandena kontrolleras av användaren. Kontakta vår tekniska service om oväntade resultat observeras som inte kan förklaras med variationer i laboratorieprocedurerna och om det misstänks vara något problem med kitet. Testförfarande och datainsamling 1. Blanda pärlorna kraftigt med antingen en vortexblandare eller genom skakning. ( ) K0110/SE/TJU/ p. 3/7

4 2. Tillsätt 0,5 ml lämplig utspädningsbuffer, t.ex. fosfatbuffrad koksalt, ph 7,2 till vardera av de två teströren. Tillsätt en droppe från vial 1, blindpärlor, till det första röret och en droppe från vial 2, kalibreringspärlor, till det andra röret. Blanda med vortexblandare för att tillse att pärlorna är i suspension. 3. Innan datainsamlingen väljes den logaritmiska fluorescensdetektor som är aktuell och fluorescenskompensationen för alla parametrar ställs på noll. 4. Anbringa röret med blindpärlor på flödescytometern. 5. Justera PMT-spänningen så att toppen av blindpärlorna visas i den första dekaden i histogrammet. 6. Med hjälp av framåtspridning kontra den sidvisa spridningen sätts den aktiva öppningen på enstaka pärlor (se bild 1). 7. Inhämta ett minimum av 5000 styrda händelser med blindpärlor. 8. Tillsätt röret med kalibreringspärlor till flödescytometern och inhämta data för ett minimum av 5000 styrda händelser. 9. Sex olika fluorescerande intensitetstoppar skall vara synliga i den fluorescerande kanalen som är aktuell (Se bild 2). Analys av data, kalibreringskurva Analys av resultaten begränsas till styrda, enstaka pärlor utan störningar, såsom definierat på punktplotten med en framåtriktad spridning kontra en sidospridning (se bild 1). Individuella markeringar eller regioner används vid definiering av vardera sex pärlsamlingar med dessa kalibreringspärlor (se bild 2). Dessa regioner används för bestämning av MFI hos varje pärlsamling. Bild 1. Framåtriktad spridning kontra sidväga spridning av blindpärlor. Porten har ställts in för att insamla enstaka pärlor. ( ) K0110/SE/TJU/ p. 4/7

5 855 R5 R6 R3 R4 641 R2 R1 Counts FL1-H Bild 2. Histogram av FluoroSpheres pärlsamling. A. Definitioner Log offset Log offset representerar fluorescensvärdet i kanal 0. Kanal 0 representeras vanligen i tillverkarnas mjukvara av godtyckliga värden, t.ex. 1 för de flesta av Becto Dicksons mjukvaror och 0,1 för de flesta av Coulters mjukvaror. AvgRes% Den genomsnittliga kvarstående procentsatsen (AvgRes%) är ett icke viktat mått på instrumentets linjära respons. Detta beräknas genom att bestämma den genomsnittliga absoluta procentsatsen som regresslinjen varierar från de verkliga punkterna. r 2 Bestämningskoefficienten (r 2 ) är ett viktat mått på linjäriteten. Det är mest användbart vid analys av loggdata. Tröskel för detektion Trots att blindpärlor är utan inneslutna fluorokromer kan de avge en signal. Denna signal representerar bakgrundsbrus och därigenom detektionsnivån för instrumentet. MEF Ekvivalenta fluorokrommolekyler är mängden fluorokrom per pärla. Loggdekad Loggdekad är det kalibrerade fullskaliga området, eller dynamiskt område, med de kalibrerade fluorescensparametrarna. Flödescytometrar är i allmänhet utrustade med förstärkare vilka har ett dynamiskt område av 3,5 till 4 loggdekader, beroende på tillverkaren. Minskad prestanda hos flödescytometern kommer att påverka loggdekaden. B. Manuell kalibrering. För instrument som uttrycker MFI i linjära värden Konstruktion av kalibreringskurvan: 1. Bestäm MFI för var och en av de sex samlingarna av FluoroSpheres kalibrerinsgpärlor. 2. Plotta loggen MFI mot motsvarande logg MEF för de olika topparna. Beräkna den "bäst passande" raka linjen enligt följande formel: ( ) K0110/SE/TJU/ p. 5/7

6 logg (MEF) = a x logg (MFI) + b där a är lutningen och b är y-axelns skärningspunkt, även kallad "log offset" eller "nollkanalens värde". 3. Beräkna de tillhörande statistiska parametrarna AvgRes% och r 2 hos kalibreringskurvan. 4. Förstärkarens dynamiska område uttrycks i loggdekader. Loggdekader kan beräknas från regressionslinjen genom att subtrahera logg (MEF min ) från logg (MEF max ). Logg (MEF min ) och logg (MEF max ) härleds från det lägsta och högsta av MFI-värdena. I detta fall är MFI för MEF min och MEF max 10 0 respektive Bild 3. Kalibrerinsgskurva (regressionslinje) baserad på FluoroSpheres. Beräkningsexempel: loggdekader = logg (MEF max ) - logg (MEF min ) loggdekader = logg ( ) - log (30.8) loggdekader = 5,28-1,49 loggdekader = 3,79 Kanaler per dekad: Eftersom antalet kanaler är 1024 är antalet kaneler per dekad: 1024/3,79 = 270 C. Manuell kalibrering. För instrument som uttrycker MFI i kanalnummer Konstruktion av kalibreringskurvan: 1. Bestäm MFI för var och en av de sex samlingarna av FluoroSpheres kalibreringspärlor. 2. Plotta MFI mot logg (MEF) och beräkna den "bäst passande" raka linjen enligt följande formel: logg (MEF) = a x MFI + b där a är lutningen och b är y-axelns brytpunkt. 3. Beräkna de tillhörande statistiska parametrarna AvgRes% och r 2 hos kalibreringskurvan. 4. Förstärkarens dynamiska område uttrycks i loggdekader. Loggdekader kan beräknas från regressionslinjen genom att subtrahera logg (MEF min ) från logg (MEF max ). Logg (MEF min ) och logg (MEF max ) härleds från det lägsta och det högsta av MFI värdena. I detta fall är MFI för MEF min och MEF max är 0 respektive ( ) K0110/SE/TJU/ p. 6/7

7 Bild 4. Kalibreringskurva (regressionslinjen) baserad på FluoroSpheres. Beräkningsexempel: loggdekader = logg (MEF max ) - log (MEF min ) loggdekader = logg ( ) - log (30,8) loggdekader = 5,28-1,49 loggdekader = 3,79 Kanaler per dekad: Eftersom antalet kanaler är 1024 är antalet kanaler per dekad: 1024/3,79 = 270 Förklaring av symboler Katalognummer In vitro diagnostisk medicinsk apparat Läs instruktioner för användning Temperaturbegränsning Batchkod Använd före Tillverkare Producerat av: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Denmark Tel Fax ( ) K0110/SE/TJU/ p. 7/7