NF-light (Neurofilament light) ELISA

Transkript

1 NF-light (Neurofilament light) ELISA SVENSKA Bruksanvisning NF-light (Neurofilament light) ELISA Kvantitativ immunoassay för bestämning av humant neurofilament light (NF-L) protein i cerebrospinalvätska. Antikropparna korsreagerar med neurofilament light från råtta, ko samt makak och kan användas för forskning på dessa djurarter x8 2-8 C EU: U.S.: For research use only Not for use in diagnostic procedures UmanDiagnostics AB Box 7996 Tel: info@umandiagnostics.com Umeå, Sverige Bruksanvisning på andra språk finns för nedladdning på företagets hemsida.

2 Användningsområde Enzymimmunoassay för kvantitativ bestämning av humant neurofilament light (NF-L) protein i cerebrospinalvätska. Antikropparna korsreagerar med neurofilament light från råtta, ko och makak och kan användas till forskning på dessa djurarter. Introduktion UmanDiagnostics NF-light (neurofilament light) assay är en enzymatisk immunoassay avsedd för kvantitativa bestämningar av NF-light i human cerebrospinalvätska. Testet grundar sig på två mycket specifika icke-kompetitiva monoklonala antikroppar (Norgren et al, 2002). Neurofilament utgör de huvudsakliga cytoskelettala komponenterna i neuronala celler. Dessa proteiner är viktiga för att bibehålla axonernas volym och morfologiska integritet, vilka påverkar hastigheten och noggrannheten vid neuronala transmissioner. Tre olika typer av neurofilamentkedjor finns, och dessa har namngivits efter deras storlek; neurofilament light, medium och heavy. Neurofilament light-kedjan utgör ryggraden till vilken de övriga kedjetyperna binder och bildar neurofilamentfibern (Lee et al, 1993). Som en följd av skador på nervceller, beroende på direkt trauma eller långsamma degenerativa processer, så kan innehållet i nervcellerna frisättas till omgivande vävnad. Detta möjliggör kvantitativa bestämningar av olika axonala proteiner. Förhöjda nivåer av neurofilament light har kunnat påvisas vid olika degenerativa sjukdomar såsom amyotrofisk lateral skleros, Alzheimers sjukdom, multipel skleros och i djurmodeller för kronisk experimentell autoimmun encephalomyelit (Rosengren et al., 1996; Norgren et al., 2003, 2004, 2005). Denna assay är en 2-site solid phase sandwich ELISA. En av de specifika monoklonala antikropparna har coatats på den fasta ytan och binder neurofilament light. Detektionen genomförs genom användning av en annan specifik konjugerad monoklonal antikropp. Den kvantitativa bestämningen sker enzymatiskt då ett färglöst substrat omvandlas till en färgad produkt, vars mängd motsvarar mängden neurofilament light i provet. Mätområde: 100 pg/ml pg/ml Detektionsgräns: 32 pg/ml Precision: Intra-assay CV% < 5 Inter-assay CV% < 9 Inkubationstid: 2,5 timmar Provstorlek: 50 L / replikat Förvaringstemperatur: 2-8 C. Utsätt inte testet för värme eller direkt solljus. Lagringstid: Upp till 18 månader från produktionsdatum. NF-light strip-plattan skall förbrukas inom fyra veckor efter förpackningen brutits. Tillse att öppnad stripplatta är väl försluten för att undvika fuktighet. Version (7)

3 Föreskrifter och varningar 1. Testet skall endast användas för in vitro diagnostiskt bruk. Endast för professionell användning. 2. Läs igenom bruksanvisningen noggrant och fullständigt innan testet utförs. Använd endast den medföljande versionen av bruksanvisningen. Se till så att inga oklarheter finns kring utförandet. 3. Om förpackningen skadats svårt under transporten, kontakta återförsäljaren i skriftlig form inom en vecka efter att NF-L ELISA kit har levererats. Använd inte skadade reagens. Spara det/de skadade reagenset/reagensen för reklammationsrelaterade frågor. 4. Blanda inte reagens från olika tillverkningsserier. Använd inte utgångna reagens. 5. Använd endast de bifogade 15 ml Sarstedtsrören ( ) vid beredning av konjugatlösning. 6. Prover, kontroller och standard rekommenderas att analyseras i duplikat. Om stora skillnader uppkommer mellan proverna bör provet mätas om. 7. Följ god laboratoriesed och säkerhetsanvisningar. Använd skyddsrock, engångshandskar och skyddsglasögon när det är befogat. 8. Undvik kontakt med stopplösningen. Den kan orsaka hudirritation och frätskador. Säkerhetsdatablad finns tillgängligt och skickas på begäran från UmanDiagnostics. 9. Kemikalier och färdigblandade eller använda reagens skall betraktas som farligt avfall enligt nationella regler för hantering av biologiskt smittsamt material (biohazard) och säkerhetsföreskrifter. 10. Använd roterande ELISA bordskak (800v/min). Kitinnehåll: Innehåll Kit komponent Kvantitet Täckfilm platta 2 st 15 ml provrör avsedda för spädning av konjugat 2 st PLATE Förcoatad, vacuumförpackad anti-nf-light Strip platta 12 x 8 brunnar STOP Stopplösning 1 x 6 ml TMB Färdigblandat TMB-substrat 1 x 12 ml SAMDIL Provspädningsbuffert 1 x 40 ml CONDIL Konjugatspädningsbuffert 1 x 12 ml CONJ Streptavidin-HRP-konjugat-koncentrat 1 x 260 L 50xTRAC Biotinmärkt anti-nf-l mab-koncentrat (50x) 1 x 260 L STAND Koncentrerat ko NF-L-antigen, frystorkat 2 vialer 10xWASH Koncentrerad tvättbuffert (10x) 2 x 40 ml Kromogen- och stoppreagens Enzym: Pepparrotsperoxidas (horse radish peroxidase) Substrat: Tetramethylbenzidine, TMB Stopp lösning: H2SO4 8 % v/v (OBS! frätande) Icke inkluderad nödvändig utrustning: Mikrotiterplattläsare 450 nm (referensvåglängd nm) Mikropipetter L Vortex provrörsskak Roterande ELISA bordsskak (800 v/min) Avjoniserat vatten Tvättflaska, automatiskt eller halvautomatiskt mikrotiter platt-tvättsystem Absorberande papper, pipettspetsar och timer Polystyren eller polypropylen rör för standard och provspädning Viktig information: Använd endast de bifogade 15 ml-rören vid beredning av konjugatlösning. Version (7)

4 Testegenskaper Provtyper NF-light ELISA testet är utvecklat för att analysera cerebrospinalvätskeprover och kan inte i aktuell utformning användas för att analysera blodprover. Temperaturberoende NF-light ELISA testet har utvecklats för rumstemperatur (20 25 C). Mätområde Standardkurvan omfattar intervallet pg/ml NF-L (se kurva på sidan 5). Extrapolering utanför kurvan är inte tillåten vilket medför att prover med koncentrationer utanför standardkurvan måste spädas ytterligare och mätas om. Reagensförberedelser Tvättbuffert Späd ut hela innehållet från en 10x tvättbuffertflaska med avjoniserat vatten till slutvolymen 400 ml. Färdigspädd oanvänd tvättbuffert kan förvaras vid rumstemperatur och bör förbrukas inom 2 månader. 10x tvättbuffertkoncentratet kan se grumlig ut pga hög saltkoncentration (påverkar inte testfunktion). Standard Rekonstituering och förberedning av standardspädningsserien skall göras direkt innan användning. Den högsta standardpunkten (10000 pg/ml) erhålls genom att en vial med frystorkad standard rekonstitueras i angiven volym provspädningsbuffert (indikeras på standardvialens etikett). Vortexa lösningen och förvara i rumstemperatur. Märk 6 mikrorör, en för varje standardpunkt (dvs pg/ml, 5000 pg/ml, 2500 pg/ml, 1000 pg/ml, 500 pg/ml, 100 pg/ml and 0 pg/ml). Späd standardproverna enligt spädningsschema nedan: Spädning av standard: Rör nr. Provspädningsbuffert Standard från rör nr. Koncentration pg/ml Vial Rekonstituera i provspädningsbuffert (SAMDIL) enligt etikett på standardvialen L 300 L (vial) L 300 L (1) L 240 L (2) L 300 L (3) L 60 L (4) µl 0 µl 0 Rekonstituerad standard skall användas omedelbart och kan inte återanvändas. Tracer Den koncentrerade tracern (50xTRAC; biotinmärkt anti-nf-l mab) späds direkt innan användning 1:50 med provspädningsbuffert. Blanda noggrant genom att vända röret flera gånger eller vortexa det. Konjugat Det koncentrerade konjugatet (CONJ; Streptavidin-HRP-konjugat) späds direkt innan användning i ett av de medföljande Sarstedts 15 ml-rören enligt rörets märkning med konjugatspädningsbuffert. Blanda noggrant genom att vända röret flera gånger eller vortexa det. Version (7)

5 Assayinstruktioner Alla reagens som ingår i testet skall vara rumstempererade innan användning. Efter varje tvättcykel skall plattan slås torr mot absorberande papper. Det är MYCKET VIKTIGT att plattan skakas vid 800 v/min. 1. Späd cerebrospinalvätskeproverna med lika volym provspädningsbuffert till en total minimivolym av 210 L. Standardproverna rekonstitueras och späds i enlighet med standardspädningstabellen och är därefter färdiga att användas (d.v.s. ingen ytterligare spädning behövs). 2. Tvätta de brunnar som ska användas med tvättbufferten (3x300 L). Tvättbufferten kan antingen sugas upp eller avlägsnas direkt genom att plattan slås mot absorberande material före nästa tvättcykel. 3. Tillsätt 100 L av varje standard och prov i duplikat. Inkubera på skak (800 v/min) vid rumstemperatur (20-25 C) under 1 timme. 4. Tvätta brunnarna med tvättbuffert (3x300 L), se punkt Tillsätt 100 L nyblandad tracer (biotin anti-nf-l) antikropp till varje brunn. Inkubera på skak (800 v/min) vid rumstemperatur (20-25 C) under 45 minuter. 6. Tvätta brunnarna med tvättbuffert (3x300 L), se punkt Tillsätt 100 L nyblandat konjugat (streptavidin-hrp) till varje brunn. Inkubera på skak (800 v/min) vid rumstemperatur (20-25 C) under 30 minuter. 8. Tvätta brunnarna med tvättbuffert (3x300 L), se punkt Tillsätt 100 µl TMB till varje brunn. Inkubera på skak (800 v/min) vid rumstemperatur (20-25 C) under 15 minuter. 10. Tillsätt 50 L stopplösning till varje brunn och avläs absorbansen vid 450 nm (referensvåglängd nm). Stopplösningen innehåller utspädd svavelsyra och är frätande. Modifieringar i testets utformande eller prestanda Eventuella förändringar av testets utformning och/eller prestanda beskrivs i den kitspecifika medföljande bruksanvisningen. Prov Cerebrospinalvätskeproverna ska inte vara kontaminerade med blod. Alla patientprover ska betraktas som potentiellt smittförande. Efter lumbalpunktion ska proverna förvaras vid -80 C i polypropylen rör. Att frysa/tina proverna upprepade gånger skall undvikas. Provstabilitet Provstabilitet har utvärderats i 5 olika kliniska prover. Provernas reaktivitet efter olika behandling jämfördes med det ursprungliga provet som lagrats vid -80 C. Medelvärde av % av - Medelvärde % range 80 C kontrollen Frys-tining 4 cykler Förvaring 5-8 C 1 vecka t vid RT (22 C) C 1 månad Version (7)

6 Resultat Resultaten kan beräknas automatiskt genom användning av en immunoassaymjukvara. En 4-parameter Marquardttransformation ger den bästa kurvanpassningen (se en typisk standardkurva nedan). Om denna typ av immunoassaymjukvara inte finns tillgänglig kan koncentrationen av NF-L beräknas genom att plotta medelabsorbans vid (λ450 nm minus λ620 nm) mot de kända standardkoncentrationerna. Alla provkoncentrationer erhålls direkt från immunoassaymjukvaran eller från den manuellt plottade kurvan. Prover som uppvisat koncentrationer över högsta standardpunkt måste spädas ytterligare och mätas om. Om prover med förväntade värden över standardkurvan skall mätas bör provet först spädas med lika volym provspädningsbuffert enligt punkt 1 i assayinstruktioner. Detta skall följas av en andra lämplig spädning för att provet skall hamna inom standardkurvan. Koncentrationen som utläses ur mjukvaran eller den manuellt plottade kurvan måste multipliceras med spädningsfaktorn som introducerades i steg två. Bäst resultat erhålls genom att inte mäta i det extremt låga och höga standardområdet. De erhållna värdena från standardkurvan motsvarar direkt NF-L koncentrationen. 3 Standardkurva Medel OD NF-L [pg/ml] 4-parameter Marquardt transformation Förväntade värden Cerebrospinalvätska från 50 till synes friska försökspersoner utan tecken på neurologisk sjukdom har undersökts. Normalvärden uppmättes till mellan 112 och 821 pg/ml. De friska försökspersonerna indelades i tre åldersgrupper och referensnivåerna definierades som medelvärde av NF-L + 2 SD (standardavvikelser). Ålder Referensvärde < 30 år < 290 pg/ml (n=17) år < 380 pg/ml (n=15) 40 - <60 år < 830 pg/ml (n=18) Resultaten är bara giltiga om testet utförts enligt de medföljande användarinstruktionerna och måste korreleras till andra kliniska observationer och diagnostiska tester. Användaren skall följa GLP (god laboratoriesed) eller andra applicerbara standarder/lagar. Det är önskvärt att varje laboratorium etablerar egna normalområden samt använder egna patientprover med kända NF-L-nivåer som interna kontroller. Version (7)

7 Testprestanda Analytisk känslighet (Detektionsgräns) Precision Intra-assay Inter-assay Recovery efter spiking Linjäritet 32 pg/ml LOB+1.645x SD (100 pg/ml standard) Låg (250 pg/ml) Hög (5000 pg/ml) 4.8 % CV 3 % CV 9.1 % CV 3 % CV 250 pg/ml 500 pg/ml 2500 pg/ml 88.4 % Mätområde pg/ml 91 % Seriespädning 1: % Område % Medelvärde Precision 4 % CV 6 % CV Medelvärde Recovery 93 % Medelvärde Utbyte 99.8 % Garanti De testprestanda som presenterats har genererats genom användande av testet enligt denna bruksanvisning. Förändringar eller modifieringar av användandet rekommenderas inte av UmanDiagnostics AB och kan påverka resultatet. I detta fall avsäger sig UmanDiagnostics AB alla garantier uttryckta, antagna eller faktiskt påvisade, inklusive underförstådd garanti för säljbarhet och lämplighet för användning. UmanDiagnostics AB och dess auktoriserade återförsäljare kan vid sådana omständigheter inte göras ansvariga för några skador vare sig direkta eller indirekta eller som en konsekvens av testets genomförande. Referenser: Lee MK, Xu Z, Wong PC, Cleveland DW. Neurofilaments are obligate heteropolymers in vivo. J Cell Biol Sep;122(6): Norgren N, Karlsson JE, Rosengren L, Stigbrand T. Monoclonal antibodies selective for low molecular weight neurofilaments. Hybrid Hybridomics Feb; 21(1): 53-9 Norgren N, Rosengren L, Stigbrand T. Elevated neurofilament levels in neurological diseases. Brain Res Oct 10;987(1): Norgren N, Sundstrom P, Svenningsson A, Rosengren L, Stigbrand T, Gunnarsson M. Neurofilament and glial fibrillary acidic protein in multiple sclerosis. Neurology Nov 9;63(9): Norgren N, Edelstam A, Stigbrand T. Cerebrospinal fluid levels of neurofilament light in chronic experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain Res Bull Oct 30;67(4): Rosengren LE, Karlsson JE, Karlsson JO, Persson LI, Wikkelso C. Patients with amyotrophic lateral sclerosis and other neurodegenerative diseases have increased levels of neurofilament protein in CSF. J Neurochem Nov;67(5): Version (7)

8 Symboler Katalognummer Sista förbrukningsdatum Lotnummer Antal test In Vitro Diagnostisk medicinteknisk produkt Läs bruksanvisning Exponera ej för värme eller solljus Förvaringstemperatur Tillverkare Varning! Version (7)