Bruksanvisning - NF-light (Neurofilament light) ELISA

Transkript

1 Bruksanvisning - 1. Avsedd användning NF-light ELISA är en invitro diagnostisk produkt avsedd för kvantitativa bestämningar av humant neurofilament light (NF-L) protein i cerebrospinal vätska (CSF). Resultatet används som stöd för att ställa diagnos av neurologiska sjukdomar såsom amylotrofisk lateral skleros (ALS), multipell skleros (MS), demenssjukdomar och Parkinsons sjukdom (PD). Kitet är avsett för yrkesmässig laboratorieanvändning. NF-light ELISA kan även användas för forskningsändamål för prover från andra arter. Antikropparna korsreagerar med neurofilament light från råtta, ko samt makak. 2. Sammanfattning och förklaring av analysen Neurofilament utgör de huvudsakliga cytoskelettala komponenterna i neuronala celler. Dessa proteiner är viktiga för att bibehålla axonernas diameter och morfologiska integritet, vilka påverkar hastigheten och noggrannheten vid neuronala signaler. Det finns tre olika typer av neurofilamentkedjor, och dessa har namngivits efter deras storlek; neurofilament light, medium och heavy. Neurofilament light-kedjan utgör ryggraden till vilken de övriga kedjetyperna binder och bildar neurofilamentfibern (Lee et al, 1993). Som en följd av skador på nervceller, beroende på direkt trauma eller långsamma degenerativa processer, så kan innehållet i nervcellerna frisättas till omgivande vävnad. Detta möjliggör kvantitativa bestämningar av olika axonala proteiner. Förhöjda nivåer av neurofilament light har kunnat påvisas vid olika degenerativa sjukdomar såsom amyotrofisk lateral skleros, Alzheimers sjukdom, multipel skleros och i djurmodeller för kronisk experimentell autoimmun encephalomyelit (Rosengren et al., 1996; Norgren et al., 2003, 2004, 2005). 3. Metodbeskrivning UmanDiagnostics NF-light (neurofilament light) assay är en enzymatisk immunoassay avsedd för kvantitativa bestämningar av NF-light i human cerebrospinalvätska. Testet grundar sig på två mycket specifika icke-kompetitiva monoklonala antikroppar (Norgren et al, 2002). Denna assay är en 2-site solid phase sandwich ELISA. En av de specifika monoklonala antikropparna har coatats på den fasta ytan och binder neurofilament light. Detektionen genomförs genom användning av en annan specifik konjugerad monoklonal antikropp. Den kvantitativa bestämningen sker enzymatiskt då ett färglöst substrat omvandlas till en färgad produkt, vars mängd motsvarar mängden NF-L i provet. Mätområde: 100 pg/ml pg/ml Detektionsgräns: 33 pg/ml Precision: Intra-assay CV% < 5 Inter-assay CV% < 10 Inkubationstid: 2.5 timmar Provstorlek: 50 µl / replikat 4. Varningar och försiktighetsåtgärder Testet skall endast användas för in vitro diagnostiskt bruk. Om kit eller kitkomponenter är skadade vid ankomst, kontakta leverantör skriftligen inom en vecka efter att produkt togs emot. Använd inte skadade produkter, lagra dessa för ev reklamation. 1 (7)

2 Följ instruktionerna i bruksanvisningen. Analysresultatens tillförlitlighet kan inte garanteras om man avvikit från instruktionerna i denna bruksanvisning. Följ god laboratoriesed (GLP) och övriga säkerhetsföreskrifter. Använd labrock, hanskar och skyddsglasögon vid behov. VARNING: Undvik kontakt med Stop reagent. Den kan orsaka hudirritation och brännskada. Säkerhetsdatablad finns tillgängligt på förfrågan. 5. Generell hantering Kitet har designats så att det kan användas vid två separata analystillfällen. Det rekommenderas att analysera prov och standard i duplikat. Om höga standardavvikelser erhålls, upprepa analysen. Blanda inte kitkomponenter från olika loter av ELISA kit. Under inkuberingsstegen, använd en höghastighetsskak med hastighet 800 rpm. Det är MYCKET VIKTIGT att plattan skakas vid 800 v/min. Alla inkubationssteg ska utföras vid rumstemperatur ( C). Använd bifogade 15 mls Sarstedtrör ( ) vid beredning av brukslösning av konjugat. Andra rör kan påverka lösningen negativt. Hållbarhet och lagring av reagens Kit ska lagras kallt, +(2-8) C och inte exponeras för värme och direkt solljus. Kitet ska inte frysas. Rekonstituerad standard skall användas omedelbart och kan inte återanvändas. NF-light strip-plattan skall förbrukas inom fyra veckor efter förpackningen brutits. Tillse att öppnad platta är väl försluten för att undvika fuktighet. Hållbarheten hos kitet är 18 månader från tillverkning. 6. Provhantering och lagring NF-light ELISA test är utvecklat för analys av cerebrospinalvätska och kan inte I sin nuvarande design användas för blodprov. Alla patientprover ska betraktas som potentiellt smittförande. Efter lumbalpunktion ska proverna förvaras vid -80 C i polypropylen rör. Repetitiv frys/tining av proverna skall undvikas. Provstabilitet har utvärderats i 5 olika kliniska prover. Provernas reaktivitet efter olika behandling jämfördes med det ursprungliga provet som lagrats vid -80 C. Medelvärde av % av -80 C kontrollen Frys-tining 4 cykler Förvaring 5-8 C 1 vecka t vid RT (22 C) C 1 månad Medelvärde % range 2 (7)

3 7. Material Kitkomponenter: Förkortning Fullständigt namn Beskrivning Mängd PLATE Anti-NF-Light Strip platta Platta med brunnar belagda med mus anti-nf-l antikroppar. Platta förvaras i 12 x 8 brunnar vakuumförsluten plastpåse med torkmedel. STOP Stopplösning Utspädd H2SO4 (8% v/v) 1 x 6 ml TMB TMB-substrat Tetramethylbenzidinesubstrat 1 x 12 ml SAMDIL Provspädningsbuffert Vattenbaserad buffert med detergent. 1 x 40 ml CONDIL Konjugatspädningsbuffert Vattenbaserad biotinfri stabiliserande buffert. 1 x 12 ml CONJ Konjugatkoncentrat Konjugat (Streptavidin Horseradish 1 x 260 L peroxidase) i vattenbaserad biotinfri buffert. Späds enligt etikett. 50xTRAC Tracerkoncentrat (50x) Biotinmärkt anti NF-L monoklonal antikropp 1 x 260 L spädd i vattenbaserad biotinfri buffert. Späds 50x innan användning. STAND Bovin NF-L standard Rekonstitueras i provspädningsbuffert enligt etikett. (Innehåller BSE-, FMD-negativ bovint NF-L protein av tyskt ursprung). 2 vialer 10xWASH Tvättbuffert koncentrat (10x) Övrigt inkluderat material: Täckfilm platta 2 st 15 ml provrör avsedda för spädning av konjugat 2 st Vattenbaserad buffert med detergent. Späds 10x innan användning. Icke inkluderad nödvändig utrustning: Mikrotiterplattläsare 450 nm (referensvåglängd nm) Mikropipetter µl Vortex provrörsskak Roterande ELISA bordsskak (800 v/min) Avjoniserat vatten Tvättflaska, automatiskt eller halvautomatiskt mikrotiter platt-tvättsystem Absorberande papper, pipettspetsar och timer Polystyren- eller polypropylenrör för standard och provspädning 8. Förfarande 2 x 40 ml Förberedelser: Alla kitkomponenter ska anta rumstemperatur (20 25 C) före användning. Beredning av tvättbuffert; Späd ut hela innehållet från en tvättbuffertflaska 10x (10xWASH) med avjoniserat vatten till slutvolymen 400 ml. Färdigspädd oanvänd tvättbuffert kan förvaras vid rumstemperatur och bör förbrukas inom 2 månader. 10x tvättbuffertkoncentratet kan se grumlig ut pga hög saltkoncentration (påverkar inte testfunktion). Uppspädning av standardkurva (kalibratorer): Rekonstituering och förberedning av standardspädningsserien skall göras direkt innan användning. Märk 6 mikrorör, en för varje standardpunkt (dvs pg/ml, pg/ml, pg/ml, 500 pg/ml, 100 pg/ml and 0 pg/ml). Den högsta standardpunkten ( pg/ml) erhålls genom att en vial med frystorkad standard (STAND) rekonstitueras i angiven volym provspädningsbuffert (SAMDIL) (indikeras på standardvialens etikett). Vortexa lösningen och förvara i rumstemperatur. 3 (7)

4 Späd standardproverna enligt spädningsschema nedan: Rör nr: Koncentration pg/ml Vial Provspädningslösning (SAMDIL) Standard från rör nr. Rekonstituera i prov-spädningsbuffert (SAMDIL) enligt etikett på standardvialen L 300 L (vial) L 300 L (1) L 240 L (2) L 300 L (3) L 60 L (4) L 0 L Protokoll: 1. Späd cerebrospinalvätskeproverna med lika volym (1+1) provspädningsbuffert (SAMDIL) till en total minimivolym av 210 µl. Standardproverna rekonstitueras och späds i enlighet med standardspädningstabellen och är därefter färdiga att användas (d.v.s. ingen ytterligare spädning behövs). 2. Tvätta de brunnar som ska användas med tvättbufferten (3x300 µl). Tvättbufferten kan antingen sugas upp eller avlägsnas direkt genom att plattan slås mot absorberande material före nästa tvättcykel. 3. Tillsätt 100 µl av varje standard och prov i duplikat. Inkubera i rumstemperatur på skak (800 v/min) under 1 timme. 4. Tvätta brunnarna med tvättbuffert (3x300 µl), se punkt Direkt innan användning, späd den koncentrerade tracern (50xTRAC) (biotinmärkt anti-nf-l mab) 1:50 med provspädningsbuffert (SAMDIL). Blanda noggrant genom att vända röret flera gånger eller vortexa det. Tillsätt 100 µl nyblandad tracer antikropp till varje brunn. Inkubera på skak (800 v/min) under 45 minuter i rumstemperatur. 6. Tvätta brunnarna med tvättbuffert (3x300 µl), se punkt Direkt innan användning, späd det koncentrerade konjugatet (CONJ) i ett av de medföljande Sarstedts 15 ml-rören enligt rörets märkning med konjugatspädningsbuffert (CONDIL). Blanda noggrant genom att vända röret flera gånger eller vortexa det. Tillsätt 100 µl nyblandat konjugat till varje brunn. Inkubera på skak (800 v/min) under 30 minuter i rumstemperatur. Viktig information: Använd endast de bifogade 15 ml-rören vid beredning av konjugatlösning! 8. Tvätta brunnarna med tvättbuffert (3x300 µl), se punkt Tillsätt 100 µl TMB-substrat (TMB) till varje brunn. Inkubera på skak (800 v/min) under 15 minuter i rumstemperatur. 10. Tillsätt 50 µl stopplösning (STOP) till varje brunn och avläs absorbansen vid 450 nm (referensvåglängd nm). Stopplösningen innehåller utspädd svavelsyra och är frätande. 4 (7)

5 Mean OD 9. Beräkning av resultat Resultaten kan beräknas automatiskt genom användning av en immunoassaymjukvara. En 4-parameter Marquardttransformation ger den bästa kurvanpassningen (se en typisk standardkurva nedan). Om denna typ av immunoassaymjukvara inte finns tillgänglig kan koncentrationen av NF-L beräknas genom att plotta medelabsorbans vid (λ450 nm minus λ620 nm) mot de kända standardkoncentrationerna. Koncentrationerna av NF-L i provet erhålls genom direkt avläsning på kalibreringskurvan, spädningen av provet (1+1) har redan kompenserats för, ingen ytterligare multiplicering ska göras. 10. Kvalitetskontroll 3 Standard Curve NF-L [pg/ml] 4-parameter Marquardt transformation För att säkerställa att analysen ger hög tillförlitlighet, ska följande kriterier vara uppfyllda; - Kalibreringskurvans utseende ska överensstämma med figuren ovan. - Maximala absorbansen för pg/ml ska vara > 2.0 AU. - Bakgrunden ska vara <0.1 AU. Om testet ska användas i klinisk rutinanalys bör varje laboratorium etablera egna interna kontroller från friska individer samt kontroller från patienter med förhöjda nivåer. 11. Mätintervall Kalibreringskurvan omfattar området pg/ml NF-L. Extrapolering utanför kurvan är inte tillåtet, dessa prov behöver spädas ytterligare och analyseras på nytt. 12. Spädning Prov med koncentrationer högre än högsta standardpunkten i kalibreringskurvan behöver spädas ytterligare och analyseras på nytt för att kunna kvantifieras korrekt. Om prover med förväntade värden över standardkurvan skall mätas bör provet först spädas med lika volym provspädningsbuffert enligt punkt 1 i protokollet. Detta skall följas av en andra lämplig spädning för att provet skall hamna inom standardkurvan. Koncentrationen som utläses ur mjukvaran eller den manuellt plottade kurvan måste multipliceras med spädningsfaktorn som introducerades i steg två. Bäst resultat erhålls genom att inte mäta i det extremt låga och höga standardområdet. 13. Begränsningar i användning Vid fastställande av diagnos, måste alltid resultaten från denna assay tolkas tillsammans med övriga kliniska symptom. Interferens från heterofila antikroppar kan orsaka felaktiga resultat. Patienter som regelbundet exponerats för djur eller som fått immunoterapi eller genomgått diagnostiska procedur som involverar immunoglobuliner eller fragment av immunoglobuliner kan ha producerat anti-djur antikroppar, ex HAMA som kan störa analysen. Viss försiktighet 5 (7)

6 bör iakttas vid tolkning av resultat från denna grupp av patienter. Interferens kan även förekomma i prover där patienter fått biotinterapi. Även här bör försiktighet iakttas. 14. Förväntade värden Cerebrospinalvätska från 50 till synes friska försökspersoner utan tecken på neurologisk sjukdom har undersökts. Normalvärden uppmättes till mellan 112 och 821 pg/ml. De friska försökspersonerna indelades i tre åldersgrupper och referensnivåerna definierades som medelvärde av NF-L + 2 SD (standardavvikelser). Ålder Resultaten är bara giltiga om testet utförts enligt de medföljande användarinstruktionerna och måste korreleras till andra kliniska observationer och diagnostiska tester. Användaren skall följa GLP (god laboratoriesed) eller andra applicerbara standarder/lagar. Det är önskvärt att varje laboratorium etablerar egna normalområden samt använder egna patientprover med kända NF-L-nivåer som interna kontroller. 15. Prestandaegenskaper Specificitet CSF prov har spikats med pg/ml neurofilament medium (NF-M) och neurofilament heavy (NF-H). Recovery av NF-L i NF-M och NF-H spikade prover varierade mellan %. Analytisk Sensitivitet Detektionsgräns (LoD) 33 pg/ml, Kvantifieringsgräns (LoQ) 81 pg/ml Precision Intra-precision NF-light : < 5% ( pg/ml) Inter-precision NF-light : < 10% ( pg/ml) Linjäritet Metoden är linjär i koncentrationsintervallet pg/ml. Parallellism Spädning av CSF prov följer samma trend som spädning av spikade prover. Spädning påverkar inte koncentrationsbestämning av endogent NF-L i det undersökta området pg/ml. Utbyte Recovery i det undersökta koncentrationsområdet pg/ml varierar mellan %. Riktighet Det är inte möjligt att jämföra resultat från flera metoder eftersom det inte finns något annat CE-märkt kit. Inget standardreferensmaterial finns tillgängligt för NF-L. 16. Garanti De testprestanda som presenterats har genererats genom användande av testet enligt denna bruksanvisning. Förändringar eller modifieringar av användandet rekommenderas inte av UmanDiagnostics AB och kan påverka resultatet. I detta fall avsäger sig UmanDiagnostics AB alla garantier uttryckta, antagna eller faktiskt påvisade, inklusive underförstådd garanti för säljbarhet och lämplighet för användning. UmanDiagnostics AB och dess auktoriserade återförsäljare kan vid sådana omständigheter inte göras ansvariga för några skador vare sig direkta eller indirekta eller som en konsekvens av testets genomförande. 17. Referenser Referensvärde < 30 år < 290 pg/ml (n=17) år < 380 pg/ml (n=15) 40 - <60 år < 830 pg/ml (n=18) Lee MK, Xu Z, Wong PC, Cleveland DW. Neurofilaments are obligate heteropolymers in vivo. J Cell Biol Sep;122(6): Norgren N, Karlsson JE, Rosengren L, Stigbrand T. Monoclonal antibodies selective for low molecular weight neurofilaments. Hybrid Hybridomics Feb; 21(1): (7)

7 Norgren N, Rosengren L, Stigbrand T. Elevated neurofilament levels in neurological diseases. Brain Res Oct 10;987(1): Norgren N, Sundstrom P, Svenningsson A, Rosengren L, Stigbrand T, Gunnarsson M. Neurofilament and glial fibrillary acidic protein in multiple sclerosis. Neurology Nov 9;63(9): Norgren N, Edelstam A, Stigbrand T. Cerebrospinal fluid levels of neurofilament light in chronic experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain Res Bull Oct 30;67(4): Rosengren LE, Karlsson JE, Karlsson JO, Persson LI, Wikkelso C. Patients with amyotrophic lateral sclerosis and other neurodegenerative diseases have increased levels of neurofilament protein in CSF. J Neurochem Nov;67(5): Symboler Katalognummer Sista förbrukningsdatum Lotnummer Antal test In Vitro Diagnostisk medicinteknisk produkt Läs bruksanvisning Exponera ej för värme eller solljus Förvaringstemperatur Tillverkare Varning! UmanDiagnostics AB Tvistevägen 48C Telefon: +46(0) info@umandiagnostics.com Umea, Sweden Bruksanvisningar på andra språk finns att ladda ner på företagets hemsida. 7 (7)