PLATELIA Aspergillus IgG TEST DETEKTION AV IgG ANTI-ASPERGILLUS-ANTIKROPPAR I HUMANT SERUM ELLER PLASMA MED EN IMMUNOENZYMATISK METOD

Transkript

1 PLATELIA Aspergillus IgG TEST DETEKTION AV IgG ANTI-ASPERGILLUS-ANTIKROPPAR I HUMANT SERUM ELLER PLASMA MED EN IMMUNOENZYMATISK METOD 1 AVSEDD ANVÄNDNING Platelia Aspergillus IgG är en indirekt immunoenzymatisk teknik för detektion av IgG anti-aspergillus-antikoppar i humant serum eller plasma. 2 ANVÄNDARINFORMATION Platelia Aspergillus IgG är en analys som, när den tolkas med utgångspunkt från patientens kliniska och terapeutiska bakgrund och när den utförs tillsammans med andra diagnoser som radiologiska, cytologiska, immunologiska och mykologiska undersökningar, kan användas som ett komplement för att fastställa aspergillus-sjukdomar. 3 KLINISK BETYDELSE Olika kroniska aspergillus-sjukdomar kan finnas hos immunokompetenta och diagnosen kan ofta vara svårställd. Känslighet mot mögel beror på allergier som astma, allergisk bronkopulmonär aspergillos (ABPA), som representerar den värsta kliniska formen 4, 8. Patienter med mukoviskidos riskerar ABPA och övervakas regelbundet med avseende på denna diagnos 1, 2. Hos som inandats mycket sporer kan yttre alveolit utvecklas; de mest kända formerna är "bird-raiser s disease" och "farmer s lung disease", två olika typer av lungsjukdomar. Aspergillom representerar den mest typiska icke allergiska kroniska sjukdomen som beror på kolonisering av redan befintliga svampmycelier i lungan (tuberkulos, emfysem, sarkoidos, lungcancer) och som formar en "aspergillus-boll" 4, 6, 10. Tillsammans med andra icke allergiska sjukdomar är kronisk nekrotisk aspergillos en särskilt allvarlig dödlig form. I dessa olika kliniska förekomster, antingen allergiska eller icke allergiska, är det ofta svårt att diagnostisera aspergillos. Det beror på att de kliniska tecknen ofta även kan tyda på andra svamp-, bakterie- och virusinfektioner eller t.o.m. cancer. Radiologisk undersökning, som är vanligt för aspergillom, är mindre vanligt för andra former av aspergillos, där klinisk och radiologisk undersökning bara utgör begränsade delar av diagnosen. Biologiska parametrar och i synnerhet serologiska tester är oumbärliga när det gäller att ställa denna diagnos 5. Hos med risk för aspergillom, en allvarlig men svårupptäckt infektion, har serologisk övervakning visat sig vara relevant. Diagnosen av ABPA baseras på fem kriterier som även omfattar serologisk detektion av anti-aspergillusantikroppar 13. Platelia Aspergillus IgG, en analys som används för att detektera immunoglobuliner av klass G riktade mot en rekombinant renad antigen av aspergillus, är ett hjälpmedel för att diagnostisera de här kroniska formerna av aspergillos som kan finnas hos immunokompetenta 3. Dessutom har förekomsten av anti-aspergillus-antikroppar beskrivits hos onko-hematologiska, innan en immunsuppressiv behandling för benmärgsgraft görs. De här studierna föreslår detektion av aspergillus-kolonisering när patienten läggs in på sjukhuset eller före graften hos de som riskerar att få invasiv aspergillos efter immunsuppressiv behandling. 4 TESTPRINCIP Platelia Aspergillus IgG är en indirekt immunoenzymatisk teknik i 2 faser för detektion av IgG anti-aspergillusantikoppar i humant serum eller plasma. Prover av utspätt serum eller plasma fördelas i brunnarna på mikroplattan som sensibiliserats med den rekombinanta renade antigenen av aspergillus 7. Efter en inkubation vid 37 C tvättas remsorna för att avlägsna allt fritt material. Konjugatet (antihuman IgG-monoklonal antikropp från mus märkt med peroxidas) tillsätts i mikroplattans alla brunnar och inkuberas vid 37 C. Ett komplex bildas om IgG anti-aspergillus finns i det humana provet: Ag aspergillus human IgG anti-aspergillus - antihuman IgG Ab/peroxidas från mus. Remsorna tvättas för att avlägsna allt fritt material. Kromogen som innehåller peroxidassubstrat och som inkuberas i rumstemperatur används för att detektera om komplex har bildats. Den enzymatiska reaktionen avbryts genom tillsats av 1N svavelsyra. En spektrofotometer som är inställd på 450/620 nm används för att läsa av den optiska densiteten.

2 5 REAGENSER Reagenserna räcker för 96 test i högst 9 satser. Mer information om förvaring och sista förbrukningsdag finns på förpackningen. Låt alla reagenser uppnå rumstemperatur ( C) innan de används. Förvara reagenserna vid +2 8 C igen direkt efter användningen. Sätt tillbaka alla oanvända remsor i originalförpackningen och förslut den. Ta inte bort torkmedlet. R1 R2 Märkning Reagenstyp Innehåll Microplate Concentrated Washing Solution (20x) Mikroplatta: - 96 brunnar (12 remsor som vardera innehåller 8 brunnar) sensibiliserade med renad rekombinant aspergillus-antigen. Koncentrerad tvättlösning (20x): - -NaCl-buffert (ph 7,4) - 2 %Tween x 70 ml R3 Calibrator 0 R4a Calibrator 10 R4b Calibrator 20 R4c Calibrator 40 R4d Calibrator 80 R6 R7a Conjugate Sample Diluent 1 Kalibrator 0 AU/ml (klar att använda): - Tris-NaCl-buffert som inte innehåller IgG anti-aspergillus Kalibrator 10 AU/ml (klar att använda): - Humant serum som innehåller antikroppar mot antiaspergillus. Kalibrator 20 AU/ml (klar att använda): - Humant serum som innehåller antikroppar mot antiaspergillus. Kalibrator 40 AU/ml (klar att använda): - Humant serum som innehåller antikroppar mot antiaspergillus. Kalibrator 80 AU/ml (klar att använda): - Humant serum som innehåller antikroppar mot antiaspergillus. Konjugat (klar att använda) - Antihuman IgG monoklonal antikropp från mus märkt med peroxidas - Fenolrött Provutspädningsmedel 1 (klart att använda): - Tris-NaCl-buffert - 0,1 % Tween 20 - Fenolrött 1 x 2,5 ml 1 x 2,5 ml 1 x 2,5 ml 1 x 2,5 ml 1 x 2,5 ml 1 x 26 ml 1 x 28 ml R7b Sample Diluent 2 Provutspädningsmedel 2 (klart att använda): - Tris-NaCl-buffert - 0,1 % Tween 20 - Bromkresolpurpur 1 x 26 ml R9 R10 Chromogen TMB Stopping Solution Kromogen TMB-lösning (klar att använda) 1 x 28 ml - 3,3,5,5 -tetrametylbensidin-(< 0,1 %)lösning, H2O2 (<1,0 %) Stopplösning (klar att använda): 1 x 28 ml - 1 N svavelsyralösning Självhäftande folie 4

3 6 HÄLSO- OCH SÄKERHETSANVISNINGAR 1. Endast för in vitro-diagnostisk användning. 2. Endast för professionellt bruk. 3. Vi rekommenderar inte att detta testpaket används för andra prov än humant serum eller plasma. 4. Kalibrator R4a, R4b, R4c och R4d är baserade på humant serum som testats negativt för antikroppar mot anti-hiv- 1, anti-hiv-2, anti-hcv samt HBs med CE-märkta tester. Hantera dock alla reagenser som potentiellt smittfarliga. Alla tester måste genomföras enligt OSHA-standarden om patogena agenser som överförts hematogent, enligt biologisk säkerhetsnivå 2 eller enligt andra vedertagna säkerhetsförfaranden. 5. Använd skyddskläder som laboratorierock, ögon-/ansiktsskydd och engångshandskar (syntetiska handskar, ej latex, rekommenderas) och tillämpa god laboratoriesed när du hanterar reagenser och patientprover. Tvätta händerna noggrant efter ett test. 6. Pipettera inte med munnen. 7. Rök, drick och ät inte i områden där prover eller reagenser hanteras. 8. Undvik stänk från prover och lösningar. 9. Rengör noggrant ytor som fått stänk av kontaminerad vätska som inte innehåller syra med ett effektivt rengöringsmedel. Desinfektionsmedel som kan användas innehåller (inte bara) en lösning av 10 % natronlut (0,5 % lösning natriumhypoklorit), 70 % etanol eller 0,5 % Wescodyne Plus. Materialet som används för rengöring måste kastas i en särskild behållare för smittfarligt avfall. VARNING! Häll aldrig lösning med natronlut i autoklaven. 10. Om den kontaminerade vätskan är en syra måste ytorna torkas eller neutraliseras med natriumbikarbonat och ytorna måste sköljas och torka. Om den kontaminerade vätskan innehåller biologiskt farliga ämnen ska ytorna rengöras med ett kemiskt desinfektionsmedel. 11. Hantera alla prover och reagenser som använts för analysen som potentiellt smittfarliga. Farligt kemiskt och biologiskt avfall måste hanteras enligt gällande bestämmelser. 12. VARNING! Eventuella kemiska risker som finns i samband med en del av komponenterna anges i listan nedan (se kapitel 5 REAGENSER) Xi-Irriterande Vissa reagenser innehåller ProClinTM 300 < 1.5%: R43: Kan ge allergi vid hudkontakt. S : Undvik inandning av ånga/spray. Undvik kontakt med huden. Använd lämpliga skyddshandskar. Detta material och dess behållare ska tas om hand som farligt avfall. 13. Ett säkerhetsdatablad kan fås på begäran. 7 FÖRESKRIFTER FÖR ANVÄNDARE 1. FRYSTA PROV SOM FÖRVARAS UNDER OKÄNDA FÖRHÅLLANDEN KAN GE FELAKTIGT POSITIVA RESULTAT PÅ GRUND AV ATT DE SMITTATS MED SVAMP OCH/ELLER BAKTERIER. 2. Använd inte testet eller någon av dess komponenter efter sista förbrukningsdatum. 3. Blanda eller kombinera inte reagenser från satser med olika partinummer under samma procedur. OBS! Du kan använda andra partier av tvättlösningen (R2, grönmärkt* som 20x), kromogen (R9, turkosmärkt* som TMB) och stopplösningen (R10, rödmärkt* som 1N) än de som medföljer satsen under förutsättning att reagenserna helt och fullt motsvarar samma parti under samma procedur. OBS! Tvättlösningen (R2 grönmärkt* som 20x) får inte blandas med tvättlösningen (R2 blåmärkt* som 10x) i Bio-Rad reagenssatser. * på etiketten 4. Innan reagenserna fördelas ska de nå rumstemperatur (mellan +18 och +30 C) i 30 minuter. 5. Använd helst engångsutrustning. Om detta inte är möjligt kan glasbehållare som noggrant diskats och sköljts med destillerat vatten användas. 6. Kontrollera pipetternas precision och att instrument som ska användas fungerar felfritt. 7. Rekonstituera reagens R2 noggrant, undvik kontaminering. 8. Den enzymatiska reaktionen är mycket känslig för metaller och metalljoner. Metall får därför inte komma i kontakt med de olika lösningarna som innehåller konjugat- eller substratlösning. 9. Använd en ny pipettspets varje gång kalibratorer och prover pipetteras i en brunn för att undvika kontaminering. 10. Följ det rekommenderade antalet tvättcykler och se till att alla brunnar är helt fyllda och därefter helt tömda för att brunnarna ska vara tvättade på rätt sätt. Tvätta med en tvättanordning för mikroplattor. 11. Se till att mikroplattan inte hinner torka efter tvättproceduren innan reagenser har hällts i. 12. Använd inte samma behållare för konjugat- och framkallningslösningarna. 13. Undvik att utsätta kromogen- eller framkallningslösningen för starkt ljus vid förvaring och inkubation. Låt inte koromogenlösningar komma i kontakt med oxiderande medel. 14. Kromogen (R9) ska vara transparent. Om den är blå kan reagensen inte användas och ska bytas. 15. Undvik all kontakt mellan stopplösningen och oxiderande medel, metall eller metalljoner. 16. Häll inte tillbaka oanvänt konjugat i originalbehållaren.

4 8 FÖRBEREDELSE OCH FÖRVARING AV REAGENS Mikroplatta (R1) Alla ramar som innehåller 12 remsor ligger i en förpackning. Använd en sax för att öppna förpackningen strax nedanför förslutningen. Öppna förpackningen och ta ut ramen. Lägg tillbaka ramar som innehåller oanvända remsor i originalförpackningen. Stäng noggrant förpackningen och förvara den i +2 8 C. När den vakuumförslutna förpackningen har öppnats förblir remsorna stabila i upp till 8 veckor förutsatt att de förvaras vid +2 8 C i samma väl förslutna originalförpackning. Se till att torkmedlet ligger kvar i förpackningen. Tvättlösning (R2) Förbered tvättlösningen genom att späda ut koncentratet 20 gånger i destillerat vatten: 50 ml R2 i 950 ml destillerat vatten. (650 ml utspädd tvättlösning behövs för en hel platta med 12 remsor, förutom använt tvättvatten). Den utspädda tvättlösningen kan förvaras i 14 dagar vid C. När den koncentrerade tvättlösningen har öppnats och förvaras vid C är den stabil till det sista förbrukningsdatumet på etiketten, om den inte kontamineras. Kalibrator 0 (R3), kalibrator 10 (R4a), kalibrator 20 (R4b), kalibrator 40 (R4c), kalibrator 80 (R4d): Kalibratorerna är färdiga att använda. När reagenserna har öppnats är de stabila i 8 veckor, om de förvaras i +2 8 C utan att utsättas för kontaminering. Konjugat (R6), provutspädningsmedel 1 (R7a), provutspädningsmedel 2 (R7b), TMB-kromogenlösning (R9): Reagenserna är färdiga att använda. När reagenserna har öppnats är de stabila i 8 veckor, om de förvaras i +2 8 C utan att utsättas för kontaminering. Stopplösning (R10): Reagensen är färdig att använda. När reagensen har öppnats och förvaras vid +2 8 C är den stabil till det sista förbrukningsdatumet på etiketten, om den inte kontamineras. 9 PROVER 1. Testerna ska utföras på serum- eller plasmaprover som tagits från EDTA heparin- eller citratantikoagel. 2. Följ dessa anvisningar vid provtagning, bearbetning och förvaring av dessa blodprover: Ta blodprov enligt sedvanlig praxis. Låt serumet koagulera fullständigt innan det centrifugeras. Förslut rören. Extrahera serumet eller plasman efter centrifugeringen och förvara i ett slutet rör. Proverna kan förvaras i +2 8 C om testet sker inom 4 dagar. Proverna ska frysas vid -20 C (eller -80 C) om testet inte utförs inom 4 dagar. Frys och tina inte fler än fem gånger. Prover måste homogeniseras (vortexblandas) noggrant efter upptining innan testet utförs. 3. Resultaten påverkas inte av prover som innehåller 90 g/l albumin eller 100 mg/l okonjugerat bilirubin, lipemiska prover som innehåller motsvarande 36 g/l triolein (triglycerid) eller hemolyserade prover som innehåller 10 g/l hemoglobin. 4. Värm inte proverna. 10 METOD Utrustning som ingår Se avsnittet REAGENSER. Nödvändig utrustning som inte ingår 1. Sterilt destillerat eller avjoniserat vatten för att späda ut den koncentrerade tvättlösningen. 2. Absorberande papper. 3. Engångshandskar. 4. Skyddsglasögon. 5. Natriumhypoklorit (natronlut) och natriumbikarbonat. 6. Pipetter eller multipipetter, automatiska eller halvautomatiska, justerbara eller fasta, för mätning och fördelning av 10 µl till 1000 µl, 1 ml, 2 ml och 10 ml. 7. Provrör med gradering för 25 ml, 50 ml, 100 ml och 1000 ml. 8. Engångsrör. 9. Behållare för smittfarligt avfall. 10. Vortex-blandare. 11. Inkubator för mikroplattor som kan ställas in på 37 C ± 1 C (*). 12. Halvautomatisk eller automatisk tvättanordning för mikroplattor (*). 13. Avläsare för mikroplattor med 450 och 620 nm filter (*). (*) Fråga gärna efter mer information om den utrustning som vår tekniska avdelning rekommenderar.

5 EIA-metod Följ anvisningarna noga. Tillämpa god laboratoriesed: - Låt alla reagenser uppnå rumstemperatur (18 30 C) under minst 30 minuter innan de används. - Använd alla kalibratorer vid varje analysomgång för att validera testet. Gör så här: 1. Fastställ fördelnings- och identifieringsplanen noggrant för kalibratorer och patientprover. 2. Späd i förväg ut de prover som ska testas: 1:20, t.ex. 10 μl serum eller plasma μl provutspädningsmedel 1 (R7a). När proverna späds ut i förväg färgas de röda. 3. Ta ut ramen och remsorna (R1) ur skyddsförpackningen. Stoppa tillbaka oanvända remsor i förpackningen och förslut den. 4. Fördela 190 μl provspädningsmedel 2 (R7b) i brunnarna för proverna som ska testas och tillsätt 10 μl förutspädd provvätska i förhållandet 1:20, blanda försiktigt genom att suga 2 till 3 gånger. Observera! Det här stadiet kan kontrolleras genom att brunnarna som innehåller provvätskan blir gråa när 10 μl förutspädd provvätska tillsätts. En kopp som inte innehåller prov är blålila. 5. Fördela de färdiga kalibratorerna med 200 μl per brunn enligt följande: - A1: kalibrator 0 (R3) - B1: kalibrator 10 AU/ml (R4a) - C1: kalibrator 20 AU/ml (R4b) - D1: kalibrator 40 AU/ml (R4c) - E1: kalibrator 80 AU/ml (R4d) A R3 S4 S12 B R4a S5 C R4b S6 D R4c S7 E R4d S8 F S1 S9 G S2 S10 H S3 S11 6. Täck mikroplattan med självhäftande folie genom att trycka över hela ytan. Se till att det blir tätt. 7. Inkubera genast mikroplattan i en torr mikroplattsinkubator i 60 ± 5 minuter vid 37 C (±1 C). 8. Bered den utspädda tvättlösningen (se avsnitt 8). 9. Ta bort den självhäftande folien. Aspirera innehållet i alla brunnar i en avfallsbehållare (som innehåller natriumhypoklorit) för smittfarligt avfall. 10. Tvätta mikroplattan 4 gånger med en tvättanordning för mikroplattor (med 800 μl utspädd tvättlösning). Efter den sista tvättningen ska mikroplattan vändas upp och ner, slå med lätta slag mot det absorberande pappret för att få bort vätskerester. 11. Homogenisera innehållet i behållare R6 genom att vända den upp och ned före användning. Om du använder en pipett med flera kanaler måste du se till att du bara använder nödvändig mängd för testet: Använd 3,5 ml för två remsor med 8 koppar. 12. Fördela 200 μl R6-konjugat i varje brunn. 13. Täck mikroplattan med självhäftande folie genom att trycka över hela ytan. Se till att det blir tätt. 14. Inkubera mikroplattan i en torr mikroplattsinkubator i 60 ± 5 minuter vid 37 C (±1 C). 15. Ta bort den självhäftande folien. Aspirera innehållet i alla brunnar i en avfallsbehållare (som innehåller natriumhypoklorit) för smittfarligt avfall. 16. Tvätta mikroplattan 4 gånger med en tvättanordning för mikroplattor (med 800 μl utspädd tvättlösning). Efter den sista tvättningen ska mikroplattan vändas upp och ner, slå med lätta slag mot det absorberande pappret för att få bort vätskerester. 17. Undvik direkt ljus och fördela snabbt 200 µl TMB-kromogen (R9) i alla brunnar. 18. Inkubera mikroplattan i mörker i rumstemperatur ( C) i 30 ± 5 minuter. Använd ingen självhäftande folie under denna inkubering. 19. Tillsätt 100 µl av stopplösningen (R10) i varje brunn. Använd samma ordningsföljd och fördelningshastighet som för substratlösningen. Blanda väl. 20. Torka noggrant av mikroplattans botten. 21. Läs av den optiska densiteten i varje brunn vid 450 nm (referensfilter vid 620 nm) inom 30 minuter efter att stopplösningen tillsatts (remsorna måste alltid hållas borta från direkt ljus innan avläsningen). 22. Kontrollera överensstämmelsen mellan utskriften och fördelningsplanen för plattan innan du antecknar resultaten. 11 KVALITETSKONTROLL (VALIDERINGSKRITERIER) Använd kalibratorerna på varje mikroplatta vid varje test. Följande kriterier måste uppfyllas för att validera testet:

6 Värde för optisk densitet: OD R4a > 0,200 Kvoter: OD R4a / OD R3 > 3,00 OD R4b / OD R4a > 1,20 OD R4c / OD R4b > 1,20 OD R4d / OD R4c > 1,00 12 UTVÄRDERING AV RESULTATEN Fastställ kalibreringskurvan Kalibreringskurvan definieras med 5 intervallpunkter (kalibratorer) 0, 10, 20, 40 och 80 AU/ml. Rita kalibreringskurvan [OD = funktion (AU/ml)] genom att fastställa OD för kalibratorerna R3, R4a, R4b, R4c och R4d på den vertikala (Y) axeln, sedan genom att fastställa deras respektive koncentration i AU/ml på den horisontella (X) axeln. Dra en linje från punkt till punkt som sammanbinder de olika intervallpunkterna. Bestämning av koncentrationen av IgG anti-aspergillus-antikroppar (AU/ml) i testade prover Koncentrationen av IgG anti-aspergillus-antikroppar som uttrycks i AU/ml kan fastställas för varje prov som testats med hjälp av kurvan i avsnitt 12. Utvärdering av resultaten Prover med en koncentration lägre än 5 AU/ml (C < 5) anses vara "negativa" med avseende på förekomst av IgG anti-aspergillus-antikropp. Prover med en koncentration mellan 5 och 10 AU/ml (5 C < 10) anses vara "indeterminanta" med avseende på förekomst av IgG anti-aspergillus-antikropp. Prover med en koncentration högre än eller lika med 10 AU/ml (C 10) anses vara "positiva" med avseende på förekomst av IgG anti-aspergillus-antikropp. Intervallpunkterna som används för att rita kalibreringskurvan medger inte exakt bestämning av koncentrationer som är större än 80 AU/ml. Om du vill bestämma positiva prover mer exakt måste du börja om från början och späda ut provet med R7a: - För prov med titer > 80 AU/ml och OD < 3,000: späd först provet med 1:5 av R7a. - För prover med titer > 80 AU/ml och OD 3,000: späd först provet med 1:60 av R7a. När du har gjort denna förutspädning gör du som i kapitel 10 (späd ut till 1:20 i R7a och sedan till 1:20 i R7b). Titern i det positiva provet beräknas genom att den fastställda titern multipliceras med faktorn i den första förutspädningen (t.ex. 5 eller 60 allt efter förutspädning). Ett "indeterminant" resultat kan bekräftas genom att ett nytt prov tas från patienten inom 2 3 veckor. Om patienten övervakas serologiskt rekommenderar vi att patientens samtliga prover testas i samma serie så att titervariationer av IgG anti-aspergillus-antikroppar kan upptäckas. 13 TESTETS BEGRÄNSNINGAR 1. Ett negativt resultat innebär inte att aspergillos inte förekommer. Diagnos av aspergillos kan endast fastställas efter betraktande av kliniska, terapeutiska, radiologiska, cytologiska, direkt mykologiska och serologiska resultat, varvid varje separat del ska tolkas med försiktighet. 2. Hos en immunokompetent patient med misstanke om aspergillos där ett prov tas tidigt i sjukdomsstadiet, kan resultatet visa sig vara negativt för IgG anti-aspergillus. Ett nytt test av prov som tas med två till tre veckors intervall rekommenderas därför. 3. Proceduren och resultatutvärderingen för test med Platelia Aspergillus IgG måste övervakas vid testning av prover för förekomst av antikroppar mot IgG anti-aspergillus. Läs noggrant anvisningarna i förpackningen innan testet utförs. Följ noggrant anvisningarna för pipettering av prover och reagenser, tvättning av mikroplattan och tider för inkubationsstadier. 4. Om anvisningarna om hur prover och reagenser tillsätts inte följs, kan ett felaktigt negativt resultat bli följden. Om en felaktig metod används måste ett nytt prov testas från samma patient. 5. Kontamination av negativa patientprovbrunnar från brunnar med positiva patientprover eller patientprover kan förekomma, om innehållet från en brunn spiller över till en annan vid oförsiktig hantering av mikroplattan eller dålig pipetteringsteknik där reagenser tillsätts. 6. Resultaten för Platelia Aspergillus IgG har inte fastställts med prover av serum eller plasma från nyfödda eller barn. 7. Platelia Aspergillus IgG har inte utvecklats för manuell avläsning och/eller visuellt fastställande.

7 14 FÖRVÄNTADE VÄRDEN Prevalensen av anti-aspergillus IgG som uppmätts med testet Platelia Aspergillus IgG utvärderades med en panel bestående av 129 prover från 64 franska med cystisk fibros och som riskerade en aspergillus-infektion. Av de 129 proverna var 53 positiva och 12 indeterminanta för en prevalens på 53/129 = 41,1 % [95 % CI: 32,5-50,1 %] när indeterminanta resultat anses som negativa och 65/129 = 50,4 % [95 % CI: 41,4-59,3 %] när indeterminanta resultat anses som positiva. Av de 64 som testades hade 29 minst ett och 5 hade minst ett indeterminant prov och inga positiva, för en prevalens på 29/64 = 45,3 % [95 % CI: 3,.8-58,3 %] när indeterminanta resultat anses som negativa och 34/64 = 53,1 % [95 % CI: 40,2-65,7 %] när indeterminanta resultat anses som positiva. 15 PRODUKTEGENSKAPER A. Studier om reproducerbarhet Precision inom test (reproducerbarhet): För att utvärdera reproducerbarheten inom test testades ett negativt och fem positiva prover 32 gånger i samma analys. Titern i AU/ml fastställdes för varje prov. Genomsnittet av titerna, standardavvikelsen (SD) och variationskoefficienten (CV%) för varje prov listas i tabellen nedan: Precision inom test (reproducerbarhet ) N=332 Negativt prov Mediumpositivt prov Starkt Medelvärde 2,44 9,31 10,31 13,64 31,69 43,10 (AU/ml) Standardavvikelse 0,067 0,320 0,218 0,387 0,939 1,546 CV % 2,7% 3,4% 2,1% 2,8% 3,0% 3,6% Precision mellan test (reproducerbarhet): För att utvärdera reproducerbarheten mellan test, testades alla sex proverna (ett negativt och fem positiva prover) med dubbelprover, två omgångar per dag under en tjugodagarsperiod. Titern i AU/ml fastställdes för varje. Det negativa provet uttrycks som kvot. Genomsnittet av koncentrationerna eller kvoterna, standardavvikelsen (SD) och variationskoefficienten (CV%) för varje prov listas i tabellen nedan: Precision mellan test (reproducerbarhet) N=80 Negativt prov Mediumpositivt prov Starkt Medelvärde 1,88 3,60 6,99 12,34 32,49 51,65 (AU/ml) Standardavvikelse 0,26 0,46 0,92 1,49 5,25 7,65 CV % 13,8% 12,8% 13,1% 12,1% 16,2% 14,8% B. Korsreaktivitet Patologi Antal testade prov Antal positiva prov Anti-candida-antikroppar 54 2* Anti-ds-DNA-antikroppar 10 0 ANA-positiv 10 0 Myeloma IgG 10 0 Toxoplasma OgG 10 0 Humana antimus-antikroppar 12 0 HIV 10 0 Reumafaktor 10 0 * De två serum som var positiva bekräftades med en vanlig sats för att fastställa antikroppar mot anti-aspergillus IgG. C. Linjäritet Den dynamiska linjäritetens omfång för Platelia Aspergillus IgG-dosen fastställdes mellan 2 och 80 UA/ml med utspädningsstudier som utfördes på 5 positiva prover. D. Kliniska studier Egenskaperna hos Platelia Aspergillus IgG-satsen utvärderades på två platser med totalt 499 prover från 329.

8 KÄNSLIGHET Känslighet beräknades på en panel av 277 prover från 2 platser belägna i Frankrike och delade enligt följande: 129 serum från 64 med cystisk fibros och med hög risk för allergisk bronkopulmonell aspergillos (ABPA) testades på plats serum från 43 med allvarlig, kronisk aspergillos testades på plats 2. Resultat för plats 1 Tabellen nedan sammanfattar resultaten från plats 1 för en grupp med cystisk fibros och som testades för ABPA med utgångspunkt från kliniska data, med resultat för total IgE, aspergillus-elektrosyneres, detektion av aspergillus-antigener och detektion av anti-aspergillus IgG-antikroppar med ett vanligt EIA-test, ej Platelia Aspergillus IgG. Patienterna delades in i 4 kategorier: ingen ABPA, tidigare ABPA, misstanke om ABPA och bekräftad ABPA 9, 11. Ingen ABPA utesluter inte någon annan aspergillus-patologi 12. Patientens status med aspergillus-elektrosyneres eller Platelia Aspergillus IgG ansågs som positiv när minst ett av patientens prover visade sig positivt med den aktuella metoden. I annat fall ansågs statusen som indeterminant om minst ett av patientens prover visade sig indeterminant och negativt om patientens alla prover visade sig negativa. Patientkategorier 49 utan ABPA 5 utan tidigare ABPA 4 med misstanke om 6 med ABPA Elektrosyneresresultat Platelia TM Aspergillus IgG-resultat Patientstatus Status Antal Positivt Indeterminant Negativt ansågs som negativa) 7/40 (17.5%) Negativt 40 7 (1) 4 (2) 29 [7,3-32,8%] Positivt /9 (88,9%)* Negativt 5 5(3) 0 0 5/5 (100,0%)* ansågs som positiva) 11/40 (27.5%) [14,6-43,9%] 9/9 (100,0%)* 5/5 (100,0%)* Positivt Negativt 2 2 (4) 0 0 2/2 2/2 (100,0%)* (100,0%)* ABPA Positivt /2 2/2 (100,0%) (100,0%) Negativt 3 2 (5) 0 1 2/3 2/3 (66,7%)* (66,7%)* Positivt /3 3/3 (100,0%)* (100,0%)* 1): 57 % (4/7) av de positiva resultaten med Platelia Aspergillus IgG testades som positiva med en annan EIA-sats för anti-aspergillus IgG. (2): 100 % (4/4) av de indeterminanta resultaten med Platelia Aspergillus IgG testades som negativa med en annan EIA-sats för anti-aspergillus IgG. (3): 100 % (5/5) av de positiva resultaten med Platelia Aspergillus IgG testades som positiva med en annan EIA-sats för anti-aspergillus IgG. (4): 100 % (2/2) av de positiva resultaten med Platelia Aspergillus IgG testades som positiva med en annan EIA-sats för anti-aspergillus IgG. (5): 100 % (2/2) av de positiva resultaten med Platelia Aspergillus IgG testades som positiva med en annan EIA-sats för anti-aspergillus IgG. * : 95 % konfidensintervall kunde inte beräknas pga. för få prover. Resultat för plats 2 Tabellen nedan sammanfattar resultaten för prover från med allvarlig kronisk aspergillos som fastställts med kompatibla pulmonära bilder, expektorationskulturer positiva för aspergillus och aspergillus-positiva serologiska tester med immunoelektroforesteknik (IEP).

9 Resultat per prov Patientkategorier Allvarlig kronisk aspergillos IEP-resultat Platelia TM Aspergillus IgG-resultat Patientstatus Status Antal Positivt Indeterminant Negativt ansågs som negativa) 96,3% Positivt [90,8-99,0] 68,2% Indetermitant [45,1-86,1] 35,3% Negativt [14,2-61,7] ansågs som positiva) 99,1% [95,0-100] 86,4% [65,1-97,1] 64,7% [38,5-85,8] Resultat per patient Patientens status med aspergillus-immunoelektrofores eller Platelia Aspergillus IgG ansågs som positiv när minst ett av patientens prover visade sig positivt med aktuell metod. I annat fall ansågs statusen som indeterminant om minst ett av patientens prover visade sig indeterminant och negativt om patientens alla prover visade sig negativa. Patientkategorier Allvarlig kronisk aspergillos IEP-resultat Platelia TM Aspergillus IgG-resultat Patientstatus Status Antal Positivt Indeterminant Negativt ansågs som negativa) 95,0% Positivt [83,1-99,4] ansågs som positiva) 97,5% [86,8-99,00] Negativt ,3%* 66,7%* * : 95 % konfidensintervall kunde inte beräknas pga. för få prover. SPECIFICITET Specificiteten fastställdes med en panel av 222 prover från 222 inlagda på sjukhus på plats 1 (200 prover) och plats 2 (22 prover) och som inte visade några symptom på aspergillus-infektion. Population som testats /plats Antal prover Negativt Indeterminant Positivt Plats Plats Totalt Specifitet som ansågs negativa) 99,5% [97,2-100% [84,6-99,6% [97,5- Specifitet som ansågs positiva) 100% [98,2-100% [84,6-100% [98,3-16. TILLVERKARENS KVALITETSKONTROLL Alla reagenser tillverkas och bereds i enlighet med vårt kvalitetssystem, från mottagandet av råmaterial till den slutliga marknadsföringen av produkten. Varje parti genomgår en kvalitetskontroll och släpps endast ut på marknaden om det överensstämmer med definierade acceptanskriterier. Handlingar som beskriver produktion och kontroll av varje enskilt parti sparas hos Bio-Rad.

10 17. LITTERATUR 1. Agarwal, R Allergic bronchopulmonary aspergillosis. Chest 135 (3): p Agarwal, R., Nath, A., Aggarwal, A. N., Gupta, D., Chakrabarti, A Aspergillus hypersensitivity and allergic bronchopulmonary aspergillosis in patients with acute severe asthma in a respiratory intensive care unit in North India. Mycoses Centeno-Lima, S., de Lacerda, J. M., do Carmo, J. A., Abecasis, M., Casimiro, C., Exposto, F Follow-up of anti-aspergillus IgG and IgA antibodies in bone marrow transplated patients with invasive aspergillosis. Journal of clinical laboratory analysis 16: p Denning, D. W Chronic forms of pulmonary aspergillosis. Clinical microbiology and infection 7 (Suppl 2): p Latzin, P., Hartl, D., Regamey, N., frey, U., Schoeni, M. H., Casaulta, C Comparison of serum markers for allergic bronchopulmonary aspergillosis in cystic fibrosis. Eur. Respiratory Journal 31: p Pagella, F., Matti, E., De Bernardi, F., Semino, L., Cavanna, C., Marone, P., Farina, C., Castelnuovo, P Paranasal sinus fungus ball: diagnosis and management. Mycoses 50: p Sarfati, J., Monod, M., Recco, P., Sulahian, A., Pinel, C., Candolfi, E., Fontaine, T., Debeaupuis, J.P., Tabouret, M., Latgé, J.P Recombinant antigens as diagnostic markers for aspergillosis. Diagnostic microbiology and infectious disease 55: p Schubert, M. S Allergic fungal sinusitis: pathophysiology, diagnosis and management. Medical Mycology p Shah, A Aspergillus-associated hypersensitivity respiratory disorders. Indian journal of Chest disease and allied sciences 50: p Shah, R., Vaidesswar, P., Pandit, S. P Pathlogy of pulmonary aspergillomas. Indian journal of pathology and microbiology 51 (3): p Thia, L. P., Balfour Lynn, I. M Diagnosing allergic bronchopulmonary aspergillosis in children with cystic fibrosis, Paediatric Respiratory Reviews 10: p Tillie-Leblond, I., Tonnel, A. B Allergic bronchopulmonary aspergillosis. Allergy 60: p Virnig, C., Bush, R. K Allergic bronchopulmonary aspergillosis: a US perspective. Current opinion in Pulmonary Medicine 13: p Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel.: +33 (0) Fax: +33 (0) /2009