1 platta Kvalitativ detektion av IgM-antikroppar mot borrelia burgdorferi sensu lato i humant serum genom immunologisk enzymanalys

Transkript

1 PLATELIA LYME IgM 1 platta Kvalitativ detektion av IgM-antikroppar mot borrelia burgdorferi sensu lato i humant serum genom immunologisk enzymanalys /11 1. ANVÄNDNINGSOMRÅDE Platelia Lyme IgM är en immunologisk analys för kvalitativ detektion av IgM-antikroppar mot Borrelia burgdorferi sensu lato i humant serum eller human plasma. 2. KLINISK BETYDELSE Lyme borreliosis (borrelios) är en icke smittsam infektion som orsakas av en bakterie i gruppen spiroketer, Borrelia burgdorferi, som överförs av fästingar av släktet Ixodes (2). Olika djur fungerar som värdar för bakterien och överföring till människor sker genom bett av infekterade fästingar. Överföringsrisken ökar ju längre fästingen sitter kvar. Prevalensen av borrelia är hög i tempererade och kalla klimatzoner i norra hemisfären, från Kina till Nordamerika och från Skandinavien till Nordafrika. Uppskattningsvis rapporteras ca fall varje år i USA (3) och förmodligen fler än i Europa, med en positiv gradient från väst till öst (4). Man har nu tydligt kunnat visa att Borrelia burgdorferi, som 1984 beskrevs som en unik baktierieart, i verkligheten är ett komplex av flera arter, varav fem är patogena för människor: Borrelia burgdorferi sensu stricto (ss), Borrelia garinii, Borrelia afzelii, Borrelia spielmanii och Borrelia bavariensis (7,8). Ytterligare två arter är potentiellt patogena: Borrelia valaisiana och Borrelia lusitaniae. Dessa sju arter förekommer i Europa men i USA förekommer endast B. burgdorferi sensu stricto. Kliniska symptom på borrelios är skiftande och ibland svåra att identifiera (6). Tre stadier kan urskiljas under sjukdomens kliniska utveckling. Det första stadiet (stadium I) kan vara asymptomatiskt och karakteriseras av ett influensaliknande syndrom. I 50 till 80 % av fallen uppträder flera dagar eller veckor efter fästingbettet en typisk, avgränsad och ringformad hudrodnad, erythema migrans (EM). Utan behandling orsakar en hematogen spridning av borrelios flera veckor senare inflammatorisk artrit, neurologiska och meningeala störningar samt hud- och hjärtsymptom (stadium II). Efter flera månader eller år kan sjukdomen utvecklas till ett kroniskt stadium förknippat med acrodermatitis chronica atrophicans, encefalopati, encefalomyelit och kronisk artrit (stadium III) (1). Varje art av Borrelia burgdorferi har en speciell tropism. Erythema migrans i stadium I är förknippad med samtliga tre arter. Neurologiska komplikationer är dock oftare förknippade med B. garinii och artrit är oftare förknippad med B. burgdorferi ss, medan acrodermatitis chronica atrophicans är specifik för B. afzelii. Diagnosen av borrelia får inte bekräftas utan en noggrann undersökning av patientens medicinska bakgrund, kliniska och biologiska kriterier och en uppskattning av sannolikheten för fästingexponering. På grund av svårigheterna med direkt upptäckt av borrelios, isolerade odlingar och implementeringen av molekylärbiologiska metoder, kvarstår serologi som ett viktigt element för biologisk diagnostisering av borrelios (1,5,9). IgM-antikroppar mot Borrelia burgdorferi uppträder ca 3 till 6 veckor efter kontamination och kan bestå under hela sjukdomsutvecklingen medan IgG-antikroppar uppträder senare och når en topp först efter flera månader eller till och med år. Även om serologi är mindre användbart under det tidiga stadiet är det mycket viktigt under det andra och tredje stadiet, framförallt vid avsaknad av erythema migrans. När man med serologi får ett negativt resultat trots att den kliniska statusen tyder på infektion, måste ny serologi utföras tre veckor efter det första testet. Förekomst av specifika IgM-antikroppar är inte synonymt med nyligen förvärvad infektion. På samma sätt är förekomst av specifika IgGantikroppar inte alltid ett bevis för tidigare infektion. De antigener och antikroppar som används i analyser med Platelia Lyme IgM (ref ) och Platelia Lyme IgG (ref ) har utvalts för detektion av specifika IgM- respektive specifika IgG-antikroppar mot de olika amerikanska och europeiska stammarna av Borrelia burgdorferi sensu lato (B. burgdorferi ss, B. garinii, B. azfelii). 3. PRINCIP Platelia Lyme IgM är ett kvalitativt test för detektion av IgM-antikroppar mot Borrelia burgdorferi sensu lato i humant serum eller human plasma genom immunologisk enzymanalys med insamlig av IgM på den fasta fasen. Den fasta fasen (mikroplattans brunnar) bestryks med antihumana µ-kedjeantikroppar. En blandning av nativt Borrelia-antigen och monoklonal antikropp mot flagellärt Borrelia-antigen märkt med peroxidas används som konjugat. Testet består av följande steg: Steg 1 Patientprover och kontroller späds 1/101 och fördelas sedan i mikroplattans brunnar. Under inkuberingen, en timme i 37 C, binds IgM-antikroppar till Borrelia burgdorferi som finns i provet till mikroplattans brunnar belagda med anti-µ-antikroppar. Efter inkuberingen tas icke-specifika antikroppar och serumproteiner bort genom tvättning. 1

2 Steg 2 Konjugatet (blandningen av Borrelia-antigen och anti-borrelia-antikroppar märkta med peroxidas) tillsätts i mikroplattans brunnar. Under inkuberingen, en timme i 37 C, binds konjugatet till de specifika IgM anti-borrelia-antikropparna. Obundet konjugat avlägsnas genom tvättning när inkubationsperioden är slut. Steg 3 Förekomsten av immunkomplex (antihumana µ-kedjor/igm anti-borrelia/borrelia-antigen/peroxidasmärkta monoklonala anti- Borrelia-antikroppar) påvisas genom tillsats av en enzymatisk framkallningslösning i varje brunn. Steg 4 Efter inkubering i rumstemperatur ( C) avbryts den enzymatiska reaktionen genom att 1 N svavelsyralösning tillsätts. Den optiska densiteten, som avläses med hjälp av en spektrofotometer inställd på 450/620 nm, är proportionell mot mängden IgM-antikroppar mot Borrelia burgdorferi i provet. 4. PRODUKTINFORMATION Den tillhandahållna mängden reagens är beräknad för 96 test i maximalt 6 analysomgångar. Alla reagenser är enbart avsedda för in vitro-diagnostik. Märkning Typ av reagens Innehåll R1 R2 R3 R4 R5 R6a R6b R7 R9 Microplate Concentrated Washing Solution (20x) Negative Control Cut-off Control Positive Control Antigen Conjugate (51x) Diluent Chromogen TMB Mikroplatta (färdig att användas) 12 remsor med vardera 8 brytbara brunnar, bestrukna med antihumana µ-kedjor. Koncentrerad tvättlösning (20x) Tampon TRIS-NaCl (ph 7,4), 2 % Tween 20 Konserveringsmedel: 0,04 % ProClin 300 Negativ kontroll Humant serum negativt för IgM-antikroppar mot Borrelia burgdorferi samt negativt för HBs-antigen, anti-hiv1, anti-hiv2 och anti-hcv. Konserveringsmedel: 0,15 % ProClin 300 Gränsvärdeskontroll Humant serum reaktivt för IgM-antikroppar mot Borrelia burgdorferi samt negativt för HBs-antigen, anti-hiv1, anti-hiv2 och anti-hcv. Konserveringsmedel: 0,15 % ProClin 300 Positiv kontroll Humant serum reaktivt för IgM-antikroppar mot Borrelia burgdorferi samt negativt för HBs-antigen, anti-hiv1, anti-hiv2 och anti-hcv. Konserveringsmedel: 0,15 % ProClin 300 Antigen (frystorkad) Bovint serumalbumin, Borrelia-antigen 1 mikroplatta 1 x 70 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 2 x qsp. 8,0 ml Konjugat (51x) Murin monoklonal antikropp anti-borrelia märkt med peroxidas 1 x 0,4 ml Konserveringsmedel: 0,16 %% ProClin 300 Spädningsmedel för prover och konjugat (färdigt att användas) Tris-NaCl (ph 7,7), fosterkalvserum, 0,1 % Tween 20 och 2 x 65 ml fenolrött Konserveringsmedel: 0,15 % ProClin 300 Kromogen (färdig att användas) 3,3,5,5 tetrametylbenzidin (<0,1 %), H 2O 2 (<1 %) 1 x 28 ml R10 Stopping Solution Stopplösning (färdig att användas) 1 N svavelsyralösning 1 x 28 ml Mer information om förvaringsvillkoren och sista förbrukningsdag finns på förpackningen. 2

3 5. VARNINGAR OCH FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER Resultatens kvalitet är beroende av att god laboratoriesed (GLP) tillämpas: Använd inte reagenser vars bäst-före-datum har passerat. Blanda inte reagenser från olika partier inom en bestämd analysomgång. KOMMENTAR: För tvättlösningen (R2, märknings-id: 20x grönfärgad), kromogen (R9, märknings-id: TMB turkosfärgad) och stopplösning (R10 märknings-id: 1 N rödfärgad) kan du använda andra partier än de som ingår i testet om dess reagenser är helt likvärdiga och om samma parti används inom en bestämd analysomgång. Vänta 30 minuter så att reagenserna uppnår rumstemperatur (18 30 C) innan du använder dem. Rekonstituera och späd noggrant reagenserna och undvik all kontaminering. Utför inte testet i närvaro av reaktiva ångor (syraångor, alkaliska ångor, aldehydångor) eller damm som skulle kunna ändra konjugatets enzymatiska aktivitet. Använd glasvaror som noggrant har diskats och sköljts med avjoniserat vatten, eller ännu hellre engångsmaterial. Tvättningen av mikroplattan är ett kritiskt steg. Följ det rekommenderade antalet tvättcykler och se till att alla brunnar är helt fyllda och därefter helt tömda. Felaktig tvättning kan leda till felaktiga resultat. Se till att mikroplattan inte hinner torka efter tvättproceduren och innan reagenset har hällts i. Använd aldrig samma behållare till att fördela konjugatet och framkallningslösningen. Den enzymatiska reaktionen är mycket känslig för metaller och metalljoner. Därför får ingen metall komma i kontakt med de olika lösningar som innehåller konjugatet eller kromogenen. Kromogenlösningen (R9) ska vara färglös. Om den är blåfärgad är detta en indikation på att reagenset inte kan användas utan måste ersättas. Använd en ny pipettspets för varje prov. Kontrollera precisionen för pipetterna och annan utrustning och att de fungerar korrekt. Hälso- och säkerhetsanvisningar Material av humant ursprung som använts vid beredning av reagenserna har testats och befunnits vara icke-reaktivt för hepatit B-ytantigen (HBsAg), antikroppar mot hepatit C-virus (anti-hcv) och antikroppar mot humant immunbristvirus (anti-hiv1 och anti-hiv2). Eftersom ingen testmetod med säkerhet kan garantera frånvaron av smittsamma ämnen, ska reagenser av humant ursprung och patientprover hanteras som potentiellt smittsamma. Betrakta allt material, däribland tvättlösningar, som kommer i direkt kontakt med prover och reagenser av humant ursprung som potentiellt smittsamt. Använd engångshandskar vid hantering av prover och reagenser. Pipettera inte med munnen. Undvik att spilla prover eller lösningar som innehåller prover. Spill måste sköljas bort med blekmedel som spätts till 10%. Vid spill av syra måste den först neutraliseras med natriumbikarbonat och därefter renas med blekmedel som spätts ut till 10 %, och torkas upp med absorberande papper. Materialet som används för rengöring måste kastas i en behållare för smittfarligt avfall. Prover, reagenser av humant ursprung liksom smittfarligt material och smittfarliga produkter får endast kastas efter sanering: - antingen genom att sänkas ned i blekmedel vid en slutlig koncentration på 5 % natriumhypoklorid i 30 minuter, - eller genom att autoklaveras i 121 C i minst 2 timmar. VARNING! Ställ inte in lösningar som innehåller natriumhypoklorit i autoklaven Undvik all hud- och slemhinnekontakt med både kromogenlösningen och stopplösningen (risk för förgiftning, irritation eller brännskador). Kemiskt och biologiskt avfall måste hanteras och avlägsnas enligt rutiner för god laboratoriesed (GLP). Alla reagenser som ingår i testet är enbart avsedda för in vitro-diagnostik. Mer information om risk- och försiktighetsinformation för vissa kemiska komponenter i testkitet hittar du på etiketterna och i den information som finns sist i bruksanvisningen. Säkerhetsdatabladet (SDS) finns tillgängligt på 6. PROVTAGNING, -BEREDNING OCH -FÖRVARING 1. Serum och plasma (EDTA, heparin eller citrat) är rekommenderade provtyper. 2. Följ nedanstående anvisningar för hantering, bearbetning och förvaring av blodprover: Ta alla blodprover med venpunktion och vidtag vanliga försiktighetsåtgärder. Låt serumproverna koagulera fullständigt före centrifugering. Rören ska alltid vara förslutna. Separera serum eller plasma från koaglet eller erytrocyterna och förvara i väl förslutet rör efter centrifugering. Proverna kan förvaras i +2 8 C om testet genomförs inom 7 dagar. Om testet inte kommer att slutföras inom 7 dagar, eller om proverna ska skickas iväg, ska proverna frysas ned till 20 C eller kallare. Använd inte prover som tinats mer än fem gånger. Prover som har varit frysta ska blandas ordentligt (vortex) efter upptining innan testet utförs. 3

4 3. Prover som innehåller upp till 90 g/l albumin eller 100 mg/l okonjugerat bilirubin, lipemiska prover som innehåller upp till motsvarande 36 g/l triolein (triglycerid) och hemolyserade prover som innehåller upp till 10 g/l hemoglobin påverkar inte resultaten. 4. Värm inte proverna. 7. TESTFÖRFARANDE 7.1 Nödvändigt men ej bifogat material Vortexmixer. Avläsare för mikroplattor med 450 nm och 620 nm filter (*). Inkubator för mikroplattor, termostatstyrd till 37±1 C (*). Automatisk, halvautomatisk eller manuell tvättanordning för mikroplattor (*). Sterilt destillerat eller avjoniserat vatten. Engångshandskar. Skyddsglasögon. Absorberande papper. Automatiska eller halvautomatiska, justerbara eller förinställda pipetter eller multipipetter för mätning och fördelning av 10 till µl respektive 1, 2 och 10 ml. Mätcylindrar med volymerna 25 ml, 50 ml, 100 ml och ml. Natriumhypoklorit (blekmedel) och natriumbikarbonat. Behållare för smittförande avfall. Engångsrör. (*) Begär gärna mer information om den rekommenderade utrustningen från vår tekniska avdelning. 7.2 Reagensrekonstituering R1: Låt påsen stå 30 minuter i rumstemperatur ( C) innan den öppnas. Ta ut brickan och lägg omedelbart tillbaka oanvända remsor i påsen samt kontrollera att det finns torkmedel. Återförslut påsen noggrant och förvara den i +2 8 C. R2: Späd tvättlösningen R2 1/20 med destillerat vatten, till exempel 50 ml R2 och 950 ml destillerat vatten till en tvättlösning som är färdig att användas. Bered 350 ml utspädd tvättlösning för en platta med 12 remsor om tvättningen sker manuellt. R3, R4, R5: Späd 1/101 med spädningsmedel (R7) (exempel: 10 µl R3 + 1 ml R7). R6a: Till en platta rekonstituerar du den frystorkade antigenen genom att tillsätta 8 ml spädningsmedel (R7) i varje ampull. Blanda väl. Om du väntar 15 minuter innan du blandar med konjugatet (R6b) blir rehydreringen av antigenen homogen. R6b: Bered den erforderliga kvantiteten konjugat för ett test genom att tillsätta en del koncentrerat konjugat (51x) till 50 delar spädningsmedel (R7). Till en platta blandar du 0,3 ml R6b och 15 ml R7. R6 (R6a+R6b): Blanda lika delar rekonstituerade reagenser R6a och R6b. Till en platta blandar du 12 ml av den rekonstituerade lösningen R6a och 12 ml av den rekonstituerade lösningen R6b. Vänta 45 minuter före användning. 7.3 Förvaring av och validitet hos öppnade och/eller rekonstituerade reagenser Testet måste förvaras vid +2 8 C. När testet förvarats vid +2-8 C innan det öppnas kan varje komponent användas till det bäst-före-datum som anges på testets yttre etikett. R1: Efter öppnandet är remsorna hållbara i en månad vid förvaring i +2 8 C i samma väl förslutna påse (kontrollera att påsen innehåller torkmedel). R2: Så snart tvättlösningen är utspädd kan den förvaras i 2 veckor i C. Den koncentrerade tvättlösningen är stabil till det bäst-före-datum som anges på etiketten om den förvaras i C utan att utsättas för kontaminering. R3, R4, R5, R6b, R7: Reagenser som förvaras i +2-8 C utan att utsättas för kontaminering är stabila i en månad. R6a+R7: En rekonstituerad antigen är stabil i 15 dagar vid +2-8 C eller frusen vid -20 C. Fryst rekonstituerad antigen får inte tinas mer än tre gånger. R6b+R7: När konjugatlösningen är rekonstituerad är den stabil i 8 timmar i rumstemperatur ( C) och i 24 timmar vid +2-8 C. R6 (R6a+R6b): När konjugatarbetslösningen är rekonstituerad är den hållbar i 8 timmar om den förvaras i rumstemperatur ( C). R9: Om reagenset förvaras i +2-8 C utan att utsättas för kontaminering är det stabilt i upp till 2 månader. R10: Om reagenset förvaras i +2-8 C utan att utsättas för kontaminering är det stabilt till det bäst-före-datum som anges på etiketten. 7.4 Metod Följ beskrivningen av testförfarandet och god laboratoriesed noggrant. Låt reagenserna uppnå rumstemperatur ( C) före användning. Använd de negativa, gränsvärdesrelaterade och positiva kontrollerna vid varje analysomgång för validering av testresultaten. 1. Fastställ fördelnings- och identifieringsplanen noggrant för kontroller och patientprover. 2. Bered den utspädda tvättlösningen (R2) [se avsnitt 7.2]. 3. Ta ut brickan och remsorna (R1) ur skyddsförpackningen [se avsnitt 7.2]. 4. Rekonstituera antigen R6a-ampullen genom att tillsätta 8 ml spädningsmedel (R7). Blanda väl. 4

5 5. Späd kontrollerna R3, R4, R5 och patientproverna (S1, S2 ) med spädningsmedel (R7) så att spädningen blir 1/101: 10 µl prov och 1,0 ml spädningsmedel (R7). Blanda de utspädda proverna med vortexmixern. 6. Bered konjugatarbetslösningen (R6): Späd den nödvändiga mängden konjugat (R6b) med spädningsmedlet (R7) till 1/51 spädning. Blanda sedan lika delar rekonstituerad R6a och R6b reagenter [se avsnitt 7.2]. Konjugatarbetslösningen måste beredas minst 45 minuter innan den fördelas på plattan. Blanda väl. 7. Följ den angiva sekvensen nedan noggrant och fördela i varje brunn 200 µl av de utspädda kontrollerna och patientproverna: A R3 S5 S13 B R4 S6 C R4 S7 D R5 S8 E S1 S9 F S2 S10 G S3 S11 H S4 S12 8. Täck mikroplattan med självhäftande folie. Tryck sedan till ordentligt på plattan så att folien sluter tätt. Inkubera mikroplattan direkt i ett termostatkontrollerat vattenbad eller i en torr inkubator vid 37±1 C i 1 timme ±5 minuter. 9. Ta bort den självhäftande folien när den första inkuberingsperioden är slut. Aspirera samtliga brunnars innehåll till en behållare för smittfarligt avfall (innehållande natriumhypoklorit). Tvätta mikroplattorna 4 gånger med 350 µl tvättlösning (R2). Vänd mikroplattan upp och ned och slå med lätta slag mot det absorberande papperet så att resterande vätska försvinner. 10. Fördela 200 µl av konjugatarbetslösningen (R6) i alla brunnar. Lösningen måste skakas varsamt före användning. 11. Täck mikroplattan med självhäftande folie. Tryck sedan till ordentligt på plattan så att folien sluter tätt. Inkubera mikroplattan direkt i ett termostatkontrollerat vattenbad eller i en torr inkubator vid 37±1 C i 1 timme ±5 minuter. 12. Ta bort den självhäftande folien när den andra inkuberingsperioden är slut. Aspirera samtliga brunnars innehåll till en behållare för smittfarligt avfall (innehållande natriumhypoklorit). Tvätta mikroplattorna 4 gånger med 350 µl tvättlösning (R2). Vänd mikroplattan upp och ned och slå med lätta slag mot det absorberande papperet så att resterande vätska försvinner. 13. Fördela snabbt, skyddat från ljus, 200 µl kromogenlösning (R9) i alla brunnar. Låt reaktionen fortgå i mörker i 30 ±5 minuter i rumstemperatur ( C). Använd inte självhäftande folie under denna inkubering. 14. Stoppa den enzymatiska reaktionen genom att tillsätta 100 µl stopplösning (R10) i varje brunn. Använd samma ordningsföljd och samma fördelningshastighet som för framkallningslösningen. 15. Torka noggrant av mikroplattans botten. Avläs den optiska densiteten vid 450/620 nm med hjälp av mikroplattans avläsare inom 30 minuter efter det att reaktionen har avbrutits. Remsorna måste alltid skyddas mot ljus innan de läses av. 16. Kontrollera överensstämmelsen mellan avläsningarna och fördelningsplanen för plattan och proverna innan du rapporterar resultaten. 8 BERÄKNING OCH UTVÄRDERING AV RESULTAT 8.1 Beräkning av gränsvärdet (CO) Gränsvärdet (CO) utgör medelvärdet av de optiska densitetsvärdena (OD) hos de dubbla gränskontrollerna (R4): CO = medelvärdet av OD R4 8.2 Beräkning av provkvot Provresultat uttrycks som en kvot med hjälp av följande formel: Provkvot = provets OD/CO 8.3 Kvalitetskontroll Inkludera alla kontroller för varje mikroplatta vid varje analysomgång och analysera de erhållna resultaten. För att analysen ska kunna valideras måste följande villkor uppfyllas: Värden för optisk densitet: - CO > 0,2-0,80 x CO < OD R4 replikat 1 < 1,20 x CO - 0,80 x CO < OD R4 replikat 2 < 1,20 x CO (Individuella OD för varje replikat av gränsvärdeskontrollen (R4) får inte avvika med mer än 20 % av CO-värdet). Kvoter för optisk densitet: - R3-kvot (OD R3 / CO) < 0,5 - R5-kvot (OD R5 / CO) > 2,0 Om kvalitetskontrollkriterierna inte är uppfyllda ska testet göras om. 5

6 8.4 Utvärdering av resultaten Provkvot Resultat Utvärdering Kvot < 0,80 Negativt Provet anses vara icke-reaktivt med avseende på förekomsten av IgM-antikroppar mot Borrelia burgdorferi sensu lato. 0,80 kvot < 1,2 Tveksamt Provet anses vara tveksamt med avseende på förekomsten av IgM-antikroppar mot Borrelia burgdorferi sensu lato. Resultatet måste bekräftas med ett nytt test som ska göras på ett andra prov taget minst 3 veckor efter det första provet. Kvot 1,2 Positivt Provet anses vara reaktivt med avseende på förekomsten av IgM-antikroppar mot Borrelia burgdorferi sensu lato. Om infektion misstänks kan kompletterande serologiska test som detektion av IgG anti-borrelia-antikroppar vara användbara för bekräftelse av diagnosen. Om serologitestet utfaller positivt eller tveksamt bör provet testas med en konfirmeringsmetod, till exempel ett Western-Blot (9). 8.5 Ofta förekommande problem Icke validerade eller icke repeterbara reaktioner orsakas ofta av följande: Otillräcklig tvättning av mikroplattan. Kontaminering av negativa prov med serum eller plasma med en hög antikroppstiter. Kontaminering av framkallningslösningen med kemiska oxidationsmedel (blekmedel, metalljoner ). Kontaminering av stopplösningen. 8.6 Beräkningsexempel Obs: Följande uppgifter är endast exempel och får inte användas i stället för faktiska resultat. Kontroller och patientprover OD (450/620 nm) Kvot Resultat R3 0,155 0,22 Negativt R4 0,709 / / R4 0,697 / / R5 2,280 3,24 Positivt Prov 1 1,181 1,67 Positivt Prov 2, osv... 0,597 0,85 Positivt Gränsvärde: - CO = (0,709+0,697)/2 = 0,703 Värden för optisk densitet: - OD CO = 0,703 (N > 0,200) - OD R4 replikat 1 = 0,709 (0,80 x OD CO < OD R4 replikat 1 < 1,20 x OD CO) - OD R4 replikat 2 = 0,697 (0,80 x OD CO < OD R4 replikat 2 < 1,20 x OD CO) Kvoter för optisk densitet: - Kvot R3 = 0,22 (N < 0,5) - Kvot R5 = 3,24 (N > 2,0) Kvalitetskontroll: Godkänt 9 EGENSKAPER 9.1 Prevalens Prevalensbestämning av IgM-antikroppar mot Borrelia burgdorferi sensu lato i humanserum beräknades med hjälp av en panel av 296 prover från blodgivare från norra Frankrike. Följande resultat erhölls: 286 negativa, 8 ej påvisat och 2 positiva sera. Prevalens med användning av Platelia Lyme IgM-analysen fastställdes till 0,68 % (2/296). 9.2 Specificitet Specificitet i ett icke-endemiskt område Specificiteten beräknades med en panel av 286 sera som tagits från friska blodgivare, boende i ett icke-endemiskt område i norra Frankrike. Prover utvaldes från negativa resultat erhållna från en kommersiell EIA-analys som används i Europa (CEmärkt) och som betraktas som referensanalys Specificitet i ett endemiskt område Specificiteten bestämdes också med en panel av 197 sera från friska blodgivare som bor i ett endemiskt område i östra Frankrike, av vilka ingen uppvisade kriterier relaterade till Lymes sjukdom (inga kliniska symptom på borrelios, ingen historia av fästingbett). Prover utvaldes från negativa resultat erhållna med en kommersiell EIA-analys som används i Europa (CE-märkt) och som betraktas som referensassay. 6

7 Erhållna resultat presenteras i tabellen nedan: Serapanel Negativt Ej påvisat (1) Positiva (2) Specificitet 99,6 % Icke-endemiskt område (n=286) (3) (280/281) [98,0 %-] Endemiskt område (n=197) ,0 % (191/193) [96,3 %-99,9 %] (1) Ej påvisade resultat exkluderades för specificitetsberäkningen. (2) Ett av de tre proverna som var positiva med Platelia Lyme IgM-analysen var även positivt med Western blot-analys. (3) IC 95 %: 95 % konfidensintervall. 9.3 Sensitivitet Platelia Lyme IgM-analysens sensitivitet beräknades och inkluderades med sensitivitetsresultat från Platelia Lyme IgGanalysen (Ref ) på en panel med 70 prover från patienter som hade olika former av Lymes sjukdom i olika kliniska stadier. Resultaten presenteras i tabellen nedan och jämfördes med sensitivitetsresultat erhållna med kommersiella EIAanalyser som används i Europa (CE-märkta) och som betraktas som referensanalyser: Kliniskt stadium Antal sera Platelia Lyme (1) Referens Europa (1) IgM IgG IgM + IgG IgM + IgG Erythema migrans (Stadium I) 17 58,8 % [32,9 %-81,6 %] 66,7 % [38,4 %-88,2 %] 82,4 % [56,6 %-96,2 %] 93,3 % [68,1 %-99,8 %] Neuroborrelios (Stadium II) 33 36,7 % [19,9 %-56,1 %] 96,9 % [83,4 %-99,9 %] 96,9 % [83,4 %-99,9 %] 97,0 % [84,2 %-99,9 %] Acrodermatitis chronica atrophicans (Stadium III) 5 20,0 % [0,05 %-71,6 %] [54,9%-] [54,9 %-] [54,9 %-] Lyme Artrit (Stadium III) 15 0,0 % [0,0 %-18,1 %] [81,9 %- ] [81,9 %-] [81,9 %-] (1) Ej påvisade resultat exkluderades för sensitivitetsberäkningen. Platelia Lyme IgM-analysens sensitivitet visades också på en dokumenterad panel av prover tillhandahållna av CDC (Center for Disease Control) och jämfördes med sensitivitetsresultat erhållna med kommersiella EIA-analyser som används i Europa (CE-märkta) och USA (FDA-godkända) och som betraktas som referensanalyser. Resultaten presenteras i tabellen nedan: Kliniskt stadium Erythema migrans Antal sera 28 Platelia Lyme (1) Referens Referens USA Europa (1) (1) IgM IgG IgM + IgG IgM + IgG IgM + IgG 73,7 % [48,8%-90,9 %] 38,5 % [20,2%-59,5 %] 86,4 % [65,1%-97,1 %] 70,4 % [49,8 %-86,3 %] 87,0 % [66,4 %-97,2 %] Artrit / Arthralgia 6 40,0 % [5,3 %-85,3 %] [60,7 %- ] [60,7%- ] [60,7 %- ] [60,7 %- ] Okänt stadium 4 [0,05 %- ] [36,8 %- ] [47,3 %- ] [19,4 %-99,9 %] [36,8 %- ] (1) Ej påvisade resultat exkluderades för sensitivitetsberäkningen. 7

8 9.4 Precision Precision inom körning (repeterbarhet): För att utvärdera repeterbarheten inom analysen testades ett negativt och tre positiva prover 30 gånger under samma körning. Kvoten (Prov OD / CO) fastställdes för varje prov. Medelkvot, standardavvikelse och variationskoefficient (CV %) för vart och ett av de fyra proverna kan ses i tabellen nedan: Precision inom körning (repeterbarhet) N=30 Negativt prov Lågpositivt prov Positivt prov Högpositivt prov Kvot (Prov OD / Gränsvärde) Medel 0,24 1,17 1,88 4,23 Standardavvikelse 0,040 0,052 0,070 0,104 CV % 15,2 % 4,4 % 3,7 % 2,5 % Precision mellan körningar (reproducerbarhet): För att utvärdera reproducerbarheten mellan analyser analyserades vart och ett av de fyra proverna (ett negativt och tre positiva prover) i duplikat med två körningar om dagen över en period av 20 dagar. Kvoten (Prov OD / CO) fastställdes för varje prov. Medelkvot, standardavvikelse och variationskoefficient (CV %) för vart och ett av proverna kan ses i tabellen nedan: Precision mellan körningar (reproducerbarhet) N=80 Negativt prov Lågpositivt prov Positivt prov Högpositivt prov Kvot (Prov OD / Gränsvärde) Medel 0,24 1,21 1,76 4,18 Standardavvikelse 0,029 0,067 0,104 0,153 CV % 12,0 % 5,5 % 5,9 % 3,7 % 9.5 Korsreaktivitet 338 prover med karakteristika som potentiellt kunde resultera i icke-specifika reaktioner testades med Platelia Lyme IgManalysen. Resultaten presenteras i tabellen nedan: Panel Antal prover Ej påvisat (1) Positivt Korsreaktivitet % Syfilis ,2 % (2) CMV ,3 % (2) EBV ,4 % (3) Leptospiros ,3 % (3) Malaria ,0 % (3) Antinukleära antikroppar (ANA) ,0 % Heterofila antikroppar (HAMA) ,0 % Reumafaktor ,0 % HSV ,0 % Toxoplasmos ,6 % (2) Röda hund ,0 % Mässling ,0 % Påssjuka ,0 % HIV ,0 % VZV ,0 % TOTALT ,8 % (1) Ej påvisade resultat exkluderades för beräkning av korsreaktiviteten. (2) Ingen signifikant skillnad från prevalens i endemiskt område (Fisher test, p>0,05). (3) Signifikant skillnad från prevalens i endemiskt område (Fisher test, p<0,05). 8

9 De 16 proverna som visade sig positiva med Platelia Lyme IgM-analysen testades också med kommersiella EIA-analyser som används i Europa (CE-märkta) och med en Western Blot-metod. Resultaten presenteras i tabellen nedan: Prov EIAanalys Western blot (1) Prov EIAanalys Western blot (1) Syfilis Negativt Negativt Leptospiros Positivt Positivt CMV Negativt Negativt Malaria Ej påvisat NT EBV Positivt Positivt Malaria Positivt NT EBV Positivt Negativt Malaria Ej påvisat NT EBV Positivt Negativt Malaria Positivt NT EBV Positivt NT Malaria Negativt NT EBV Positivt Ej påvisat Malaria Negativt NT Leptospiros Negativt Positivt Toxoplasmos Positivt Negativt (1) NT: inte testat på grund av otillräcklig provvolym. 10 TESTETS BEGRÄNSNINGAR En diagnos av nyligen förvärvad Borrelia burgdorferi-infektion kan endast fastställas utifrån en kombination av kliniska och biologiska data. Resultatet från ett enda test för detektion av IgM anti-borrelia burgdorferi-antikroppar är inte tillräckligt för diagnos av infektion av Borrelia burgdorferi sensu lato. Om serologitestet utfaller positivt eller tveksamt bör provet testas med en konfirmeringsmetod, till exempel ett Western-Blot (9). I synnerhet har det rapporterats att patienter med malaria eller patienter som infekterats med Epstein-Barr-virus eller andra spiroketarter (leptospiros osv.) potentiellt kan uppvisa positiva reaktioner med diagnostiska analyser med antikroppar mot Borrelia burgdorferi. Dessa situationer ska tas med i beräkningen när resultat från sådana tester tolkas. 11 TILLVERKARENS KVALITETSKONTROLL Alla tillverkade reagenser bereds i enlighet med vårt kvalitetssystem, från mottagandet av råmaterial till kommersialiseringen av den slutgiltiga produkten. Varje parti genomgår en kvalitetskontroll och lanseras på marknaden endast om det överensstämmer med fördefinierade acceptanskriterier. Handlingar som beskriver produktion och kontroller av varje enskilt parti sparas hos Bio-Rad. 12 REFERENSER 1. Aguero-Rosenfeld, M. E., Wang, G., Schwartz, I., Wormser, G Diagnosis of Lyme borreliosis. Clin. Microbiol. Rev. 18: Burgdorfer, W., Barbour, A. G., Hayes, S. F., Benach, J. L., Grunwaldt, E., Davis, J.P Lyme disease a tickborne spirochetosis? Science. 216: Center for Disease Control and Prevention Lyme disease United States, Morb. Mortal. Wkly. Rep. 53: Hubalek, Z., Halouzka, J Distribution of Borrelia burgdorferi sensu lato genomic groups in Europe, a review. Eur. J. Epidemiol. 13: Reed, K. D Laboratory testing for Lyme disease: possibilities and practicalities. J. Clin. Microbiol. 40: Stanek, G., Strle, F Lyme borreliosis. Lancet. 362: Wang, G., Van Dam, A. P., Spanjaard, L., Dankert, J Molecular typing of Borrelia burgdorferi sensu lato: taxonomic, epidemiological, and clinical implications. Clin. Microbiol. Rev. 12: Rudenko, N., Golovchenko, M., Grubhoffer, L Updates on Borrelia burgdorferi sensu lato complex with respect to public health. Ticks Tick Borne Dis. 2(3): Wilske, B Diagnosis of Lyme borreliosis in Europe. Vector Borne Zoonotic Dis. 3:

10 10

11 11

12 Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) /11 Fax : +33 (0)