Monolisa HBe Ag-Ab PLUS tests HBe Ag - 96 tests HBe Ab

Transkript

1 Monolisa HBe Ag-Ab PLUS tests HBe Ag - 96 tests HBe Ab TEST FÖR DETEKTION AV HBe Ag OCH HBe Ab GENOM IMMUNOLOGISK ENZYMANALYS IVD Tillverkarens kvalitetskontroll Alla reagenser tillverkas och marknadsförs i enlighet med ett fullständigt kvalitetssystem, från mottagandet av råmaterial till den slutliga marknadsföringen av produkten. Varje parti genomgår en kvalitetskontroll och släpps endast ut på marknaden om det överensstämmer med acceptanskriterierna. Handlingar som hör samman med produktion och kontroll av varje enskilt parti sparas inom vårt företag.

2 1. ANVÄNDNINGSOMRÅDE 2. KLINISK BETYDELSE 3. TESTPRINCIP INNEHÅLLSFÖRTECKNING 4. TESTETS BESTÅNDSDELAR 5. NÖDVÄNDIGT MEN EJ BIFOGAT MATERIAL 6. FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER 7. HÄLSO- OCH SÄKERHETSANVISNINGAR 8. REKONSTITUERING AV REAGENSER 9. VALIDITET - FÖRVARING 10. PROVER 11. TESTFÖRFARANDE 12. BERÄKNING OCH UTVÄRDERING AV RESULTATEN 13. SPEKTROFOTOMETRISK VERIFIERING AV PROV- OCH REAGENSPIPETTERING 14. TESTRESULTAT 15. REFERENSER 58

3 1 - ANVÄNDNINGSOMRÅDE Monolisa HBe Ag-Ab PLUS ska användas för kvalitativ bestämning genom immunologisk enzymanalys av hepatit Be-antigen (HBe Ag) eller antikropp mot hepatit Be-antigen (anti-hbe) i humant serum eller human plasma. 2 - KLINISK BETYDELSE Förekomst av HBe Ag avspeglar i allmänhet aktiv virusreplikation och indikerar infektionstillstånd i serumprover). HBe Ag uppträder tidigt under hepatit B-infektion och dess persistens (mer än en månad) utgör en risk för ökad leverpatologi genom virusreplikation. Förekomst av antikropp mot HBe Ag indikerar minskad virusreplikation och innebär i allmänhet en god klinisk prognos. 3 - TESTPRINCIP a) Påvisa HBe-antigen Detektion av HBe Ag baseras på en immunologisk enzymanalys av sandwich -typ i två steg där en human anti-hbe-antikropp och ett par murina monoklonala anti-hbe-antikroppar märkta med peroxidas (mab 1 och mab 2) används mot olika epitoper. Den fasta fasen består av 8 remsor med polystyrenbrunnar som är belagda med human anti-hbeantikropp. Testproceduren innehåller följande steg : 1. Inkubering av kontroll och okända prover med belagd anti-hbe-antikropp på den fasta fasen. 2. Tvätt, inkubering av fixerade komplex med peroxidasmärkta monoklonala antikroppar. 3. Eliminering genom tvätt av fritt konjugat och därefter framkallning av enzymaktiviteten som är bunden till den fasta fasen genom tillsats av substratet. 4. Avbrott av färgframkallningsreaktionen, därefter avläsning av absorbansen vid 450/620 nm och utvärdering av resultaten. b) Påvisa anti-hbe-antikroppar Vid detektion av anti-hbe används samma fasta fas som för HBe Ag. Testet baseras på konkurrens mellan den fixerade antikroppen och antikroppen i provet om en begränsad mängd HBe Ag som används som neutraliserande reagens. Detektion åstadkoms med hjälp av en annan blandning av peroxidasmärkta monoklonala antikroppar (mab 1 och mab 2). Testproceduren innehåller följande steg : 1. Inkubering av kontroll och okända prover med belagd anti-hbe-antikropp på den fasta fasen och den neutraliserande reagensen. 2. Tvätt, inkubering av fixerade komplex med peroxidasmärkta monoklonala antikroppar. 3. Eliminering genom tvätt av fritt konjugat och därefter framkallning av enzymaktivitet som är bunden till den fasta fasen genom tillsats av substratet. 4. Avbrott av färgframkallningsreaktionen, därefter avläsning av absorbansen vid 450/620 nm och utvärdering av resultaten. 4 - TESTETS BESTÅNDSDELAR Alla reagenser som ingår i testet är enbart avsedda för in vitro-diagnostiskt bruk. Reagenserna räcker till 2 x 96 test i 1 upp till 12 oberoende körningar och i följande kombinationer : antingen 96 HBe Ag-test och 96 anti-hbe-test antigen 2 x 48 HBe Ag-test och 2 x 48 anti-hbe-test samtidigt. 59

4 MÄRKNING REAGENSSAMMANSÄTTNING INNEHÅLL R1 MIKROPLATTA : 12 x 8 brunnremsor, belagda med humana 2 plattor anti-hbe-antikroppar från plasma positiv för HBs Ag, inaktiverat. R2 KONCENTRERAD TVÄTTLÖSNING (20X) 1 flaska Tris-NaCl-buffert ph 7,4 235 ml Konserveringsmedel : ProClin TM 300 (0,04 %) R3 NEGATIV KONTROLL gemensam för HBe Ag- och anti-hbe-test 1 flaska Humanserum, negativt för antikroppar mot HBs Ag, anti-hiv1, 8 ml anti-hiv2 och anti-hcv Konserveringsmedel : 0,1 % natriumazid R4 HBe Ab POSITIVT KONTROLLSERUM 1 flaska Defibrinerad anti-hbe-positiv human plasma, potentiellt positiv 1,5 ml för HBs Ag och negativ för antikroppar mot anti-hiv1, anti-hiv2 och anti-hcv, inaktiverat Konserveringsmedel : 0,1 % natriumazid R5 HBe Ag POSITIVT KONTROLLSERUM 1 flaska Defibrinerad HBe Ag och HBs Ag-positiv human plasma, negativ 1,5 ml för anti-hiv1, anti-hiv2 och anti-hcv, inaktiverat Konserveringsmedel : 0,1 % natriumazid R6 NEUTRALISERANDE HBe-ANTIGEN 1 flaska Defibrinerad HBe Ag och HBs Ag-positiv human plasma, negativ 8 ml för antikroppar mot anti-hiv1, anti-hiv2 och anti-hcv, inaktiverat Konserveringsmedel : 0,1 % natriumazid R7a KONCENTRERAT ANTI HBe-TESTKONJUGAT (5X) 1 flaska Ett par monoklonala anti-hbe-antikroppar (mab1 och mab2)* 3 ml märkta med peroxidas. R7b KONCENTRERAT Ag HBe-KONJUGAT (5X) 1 flaska Ett par monoklonala anti-hbe-antikroppar (mab1 och mab2)* 3 ml märkta med peroxidas. R8 PEROXIDASSUBSTRATBUFFERT 1 flaska Citronsyra- och natriumacetatlösning ph 4,0 innehållande 60 ml H 2 O 2 (0,015 %) och DMSO (4 %) R9 KROMOGEN 1 flaska Lösning innehållande tetrametylbensidin (TMB) 5 ml R10 STOPPREAGENS 1 flaska 1 N svavelsyra 28 ml TOM FLASKA FÖR UTSPÄTT REAGENS 1 flaska 25 ml * Mab 1/mab 2-kvoten är olika för R7a- och R7b-konjugaten. Byt inte ut de 2 konjugaten mot varandra 5 - NÖDVÄNDIGT MEN EJ BIFOGAT MATERIAL Destillerat eller helt avjoniserat vatten. Natriumhypoklorit (blekmedel) och natriumbikarbonat. Absorberande papper. Engångshandskar. Engångspolystyrenrör (12 x 75 mm). Manuella eller halvautomatiska, justerbara eller förinställda pipetter för mätning och fördelning av 50 µl, 100 µl, 200 µl och 1 ml. Mätcylindrar : 10 ml, 50 ml, 100 ml, ml. Mixer av vortex-typ. Behållare för biologiskt riskavfall. 60

5 Manuell, halvautomatisk eller automatisk tvättanordning för mikroplattor.* Vattenbad inställt via termostat på 40 ± 1 C, eller i en likvärdig inkubator för uppvärmning av mikroplattor.* Avläsare för mikroplattor med 450 nm- och 620 nm-filter.* (*) Om du har frågor kring den utrustning som rekommenderas kan du vända dig till vår tekniska avdelning. 6 - FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER Resultatens kvalitet är beroende av att god laboratoriesed (GLP) tillämpas : Blanda inte reagenser från olika partier inom en bestämd testkörning. KOMMENTAR : För tvättlösningen (R2, etikettmärkning : 20X grönfärgad), peroxidassubstrat-bufferten (R8, märknings-id : TMB buf. blåfärgad), kromogen (R9, märknings-id : TMB 11X lilafärgad) och stopplösning (R10 märknings-id : 1N rödfärgad) kan du använda andra partier än de som ingår i testet om samma parti används inom en bestämd testkörning. Dessa reagenser kan användas tillsammans med vissa andra Bio- Rad-produkter. Dessutom kan tvättlösningen (R2, etikett-märkning: 20X grönfärgad) blandas med de 2 andra tvättlösningarna som ingår i olika Bio-Rad-reagens-satser (R2, etikettmärkningar: 10X blå- eller 10X orangefärgad) vid korrekt blandning, förutsatt att endast en blandning används vid en given testkörning. Kontakta vår avdelning för teknisk service om du vill ha mer information. Namnet på testet och testets specifika ID-nummer är skrivna på ramen för varje mikrotiterplatta. Det specifika ID-numret anges också på varje remsa. Monolisa HBe Ag-Ab PLUS: Specifikt ID-nummer = 56. Kontrollera det specifika ID-numret före användning. Om ID-numret saknas eller om det skiljer sig från det angivna numret ovan ska remsan inte användas. Använd inte reagenser vars bäst före-datum har passerats. Före användning ska reagenserna stabiliseras i rumstemperatur i 30 minuter och den utspädda tvättbufferten R2 i 1 timme. Rekonstituera noggrant reagenserna och undvik all kontaminering. Utför inte testet i närvaro av reaktiva ångor (syraångor, alkaliska ångor, aldehydångor) eller damm som skulle kunna ändra konjugatets enzymatiska aktivitet. Använd glasvaror som noggrant har diskats och sköljts med avjoniserat vatten, eller ännu hellre engångsmaterial. Se till att mikroplattan inte hinner torka efter tvättproceduren innan reagenset har hällts i. Använd en ny pipettspets för varje prov. Tvättningen av brunnarna är ett kritiskt steg i proceduren. Följ det rekommenderade antalet tvättcykler och se till att alla brunnar är helt fyllda och därefter helt tömda. Felaktig tvättning kan leda till felaktiga resultat. Använd aldrig samma behållare för fördelning av konjugat- och framkallningslösning. Kontrollera precisionen för pipetterna och annan utrustning och att de fungerar korrekt. Ändra inte testförfarandet. Framkallningslösningen (substratbuffert och kromogen) måste vara rosafärgad. Om den rosa färgen förändras några minuter efter rekonstitueringen är detta en indikation på att reagensen inte kan användas och måste ersättas. Framkallningslösningen kan beredas i rena engångstråg av plast eller i glasbehållare som först har förtvättats med 1 N HCl och därefter sköljts noggrant med destillerat vatten och torkats. Detta reagens måste förvaras i mörker. 7 - HÄLSO- OCH SÄKERHETSANVISNINGAR Alla reagenser som ingår i testet är avsedda för in vitro-diagnostiskt bruk. Använd engångshandskar när du hanterar reagenser och prover. Tvätta händerna noggrant efter hanteringen. Pipettera inte med munnen. Material av humant ursprung som använts vid beredningen av reagens R3 (negativ kontroll) har kontrollerats och befunnits icke-reaktivt för hepatit B-ytantigen (HBs Ag), antikroppar mot humant immunbristvirus (anti-hiv-1 och anti-hiv-2). Material av humant ursprung som används vid beredningen av reagens R1 (sensibiliserad 61

6 mikroplatta) testades och befanns vara icke-reaktivt för antikroppar mot humant immunbristvirus (anti-hiv-1 och anti-hiv-2) och för antikroppar mot hepatit C-virus (HCV). Det är reaktivt för hepatit B-ytantigen (HBs Ag). Det inaktiverades fotokemiskt. Material av humant ursprung som använts vid beredningen av R4 (Anti-HBe-positiv kontroll), R5 (HBe Ag-positiv kontroll) och R6 (Neutraliserande HBe Ag) har kontrollerats och befunnits ickereaktivt för antikroppar mot humant immunbristvirus (anti-hiv-1 och anti-hiv-2) och antikroppar mot hepatit C-virus (anti-hcv). R5 och R6 har befunnits reaktiva för hepatit B-ytantigen (HBs Ag), R4 är potentiellt reaktivt för HBs Ag. Det inaktiverades fotokemiskt. Eftersom ingen testmetod med säkerhet kan garantera frånvaron av smittsamma ämnen, ska reagenser och patientprover hanteras som potentiellt smittsamma. Betrakta material i direkt kontakt med prover och reagenser samt tvättlösningar som kontaminerat material och hantera det som sådant. Undvik att spilla prover eller lösningar som innehåller prover. Spill måste sköljas med blekmedel som spätts till 10%. Om den smittfarliga lösningen är en syra måste spill först neutraliseras med natriumbikarbonat och därefter torkas upp med absorberande papper. Materialet som används för rengöring måste kastas i en behållare för smittfarligt avfall. Prover och reagenser av humant ursprung, liksom smittfarligt material och smittfarliga produkter måste omhändertas efter saneringen enligt följande: - antingen sänkas ned i blekmedel vid en slutkoncentration på 5% natriumhypoklorit (1 del blekmedel till 10 delar smittfarlig vätska eller smittfarligt vatten) i 30 minuter - eller autoklaveras i 121 C i minst 2 timmar. Autoklavering är den bästa metoden för inaktivering av HIV- och HBV-virus. HÄLL INGA LÖSNINGAR INNEHÅLLANDE NATRIUMHYPOKLORIT I AUTOKLAVEN Glöm inte att neutralisera och/eller autoklavera lösningar eller tvättavfall eller vätskor som innehåller biologiska prover innan de hälls ut i vasken. Ett säkerhetsdatablad kan erhållas på begäran. Hantering och kassering av kemiska produkter ska genomföras enligt rutiner för god laboratoriesed (GLP). Undvik all hud- och slemhinnekontakt med substratbuffert, kromogen och stopplösning (risk för förgiftning, irritation eller brännskador). Natriumazid ingår som konserveringsmedel i många testkomponenter. Natriumazid har visat sig bilda koppar- eller blyazider i avloppsledningar. Sådana azider är explosiva. För att undvika att azider bildas ska ledningarna spolas med rikligt med vatten om lösningar som innehåller azider slås ut i avloppet efter inaktivering. Vissa reagenser innehåller ProClin 300 (0.04%, 0.1 % och/eller 0,5%) Xi Irriterande R43 : kan förorsaka överkänslighet vid hudkontakt S28/37 : Vid kontakt med huden, tvätta genast med mycket tvål och vatten. Använd lämpliga skyddshandskar. 8 - REKONSTITUERING AV REAGENSER OBS : Låt reagenserna uppnå rumstemperatur (18-30 C) före användning Mikroplatta (R1) Varje stödram innehåller 12 remsor och är förrpackad i en försluten påse. Klipp upp påsen med en sax eller skär upp den med en skalpell 0,5-1 cm ovanför förslutningen. Öppna påsen och ta ut ramen. Lägg tillbaka oanvända remsor i påsen. Stäng påsen noggrant och förvara den i +2-8 C. Koncentrerat Tvättlösning (20X) : R2 Späd 1:20 med destillerat vatten för att få en färdig tvättlösning. Blanda. Det behövs 75 ml bruksfärdig tvättlösning till en remsa. Koncentrerat anti HBe-konjugattest (R7a) Späd R7a 1:5 med beredd R2-lösning enligt det antal remsor som ska användas : 62

7 Antal remsor som ska användas Volym R7a (ml) Komplett med beredd R2 upp till (ml) 1 0, , , , , , , , , ,4 12 Blanda. Konjugatet R7a kan användas som det är, utan förspädning med följande rekommenderade procedur: Tillsätt 80 µl utspädd tvättlösning (R2) till 20 µl anti-hbe-konjugatet R7a. Blanda. Koncentrerat Ag HBe-konjugattest (R7b) Gör på samma sätt som med R7a-konjugatet. Färgframkallningslösning (R8 + R9) Späd reagensen (R9) 1:11 med reagens R8 (exempel : 1 ml reagens R9 i 10 ml reagens R8). Homogenisera. 10 ml krävs och är tillräckligt för 1 till 10 remsor. 9 - VALIDITET - FÖRVARING Testet ska förvaras i +2-8 C. Om det förvaras i rätt temperatur kan alla reagenser som ingår användas till det sista förbrukningsdatum som anges påförpackningen (om inga specialinstruktioner anges). R1 : När den vakuumförslutna förpackningen har öppnats kan remsorna användas i upp till 1 månad förutsatt att de förvaras vid +2-8 C i samma väl förslutna förpackning. R2 : Den utspädda tvättlösningen kan förvaras vid rumstemperatur (2-30 C) i 2 veckor. Den koncentrerade tvättlösningen (R2) kan förvaras vid C. R7a : Utspätt konjugat för HBe Ag-test kan förvaras 8 timmar i rumstemperatur (18-30 C). Aktiv konjugatlösning skyddas från ljus vid rumstemperatur (18-30 C). R7b : Utspätt konjugat för HBe Ag-test kan förvaras 8 timmar i rumstemperatur (18-30 C). Aktiv konjugatlösning skyddas från ljus vid rumstemperatur (18-30 C). R8 + R9 : Efter rekonstitutionen kan reagensen förvarad i mörker användas i 6 timmar vid rumstemperatur (18-30 C) PROVER Ta ett blodprov enligt de normala rutinerna. Testet ska utföras på outspätt serum eller plasma (insamlat i EDTA-, citrat- och ACD-baserade antikoagulantia). Extrahera så fort som möjligt för att undvika hemolys. Prover som innehåller aggregat måste klaras genom centrifugering innan testet utförs. Suspenderade fibrinaggregat eller fibrinpartiklar kan ge falskt positiva resultat. Proverna bör förvaras vid +2-8 C om screeningen utförs inom 7 dagar, eller djupfrysas vid -20 C. Undvik upprepad nedfrysning/upptining. Om proverna ska skickas bör de förpackas i enlighet med föreskrifterna om transport av etiologiska agenser. Transportera dem helst frysta. ANVÄND INTE KONTAMINERADE, HYPERLIPEMISKA ELLER HYPERHEMOLYSERADE SERA. KOMMENTAR : Prover som innehåller upp till 100 mg/l bilirubin, lipemiska prover som innehåller upp till motsvarande 36 g/l triolein och hemolyserade prover som innehåller upp till 2,5 mg/ml hemoglobin påverkar inte resultaten. En minskning av kvoterna för negativa prover spikade med 45 mg/ml albumin observerades. 63

8 11 - TESTFÖRFARANDE Förfarande vid parallellt anti-hbe- och HBe Ag-test på samma platta, följ den rekommenderade schemaplattan : Anti-HBe-test : raderna 1 till 6 HBe Ag-test : raderna 7 till 12 a) Förfarande vid Anti-HBe-test 1. Bered tvättlösningen. 2. Ta ut en eller flera remsor och brickan ur förpackningen. Lägg tillbaka oanvända remsor i förpackningen och förslut den. 3. Fördela följande i brunnarna : A1, B1, C1 : 100 µl av den negativa kontrollen (R3). D1 : 100 µl av den positiva kontrollen (R4). E1, F1, G1 : 100 µl av provet. Beroende på systemet som används kan man ändra kontrollernas position eller distributionsordningen. OBS! Det finns en klar färgskillnad mellan de tomma brunnarna och brunnar med prov (gula). Det är möjligt att verifiera förekomsten av prov i brunnarna genom en spektrofotometrisk avläsning vid 490 nm (enstaka våglängd). Se avsnitt 13: SPEKTROFOTOMETRISK VERIFIERING AV PROV- OCH REAGENSPIPETTERING. 4. Tillsätt snabbt 50 µl neutraliserande HBe-antigen (R6) per brunn. Homogenisera. Täck med självhäftande film och inkubera i 3 timmar ± 10 minuter i 37 C ± 1 C. OBSERVERA : Fördelningen av neutraliserande HBe-antigen (R6), som är rosafärgad, kan kontrolleras visuellt i denna fas av hanteringen. Det är möjligt att verifiera förekomsten av neutraliserande HBe-antigen i brunnarna genom en spektrofotometrisk avläsning vid 490 nm (enstaka våglängd). Se avsnitt 13 : SPEKTROFOTOMETRISK VERIFIERING AV PROV- OCH REAGENSPIPETTERING. 5. Bered den utspädda konjugatlösningen R7a medan inkuberingen (steg 4) pågår. 6. Ta bort den självhäftande filmen. Sug upp innehållet i varje brunn i en behållare för biologiskt riskavfall. Tvätta därefter fyra gånger. 7. Fördela snabbt 100 µl utspädd konjugatlösning (R7a) (se avsnitt 8 : REKONSTITUERING AV REAGENSERNA) i varje brunn eller använd R7a-konjugatet som det är med följande rekommenderade procedur: Fördela först 80 µl utspädd tvättlösning (R2) i varje brunn, sedan 20 µl anti-hbe-konjugatet R7a (5X). Homogenisera. Täck med självhäftande film och inkubera i 30 minuter i 37 C ± 1 C (minst 25 minuter, högst 40 minuter). Ta bort den självhäftande filmen, sug upp innehållet i varje brunn till avfallsbehållaren och tvätta därefter fem gånger. OBSERVERA : Fördelningen av den utspädda konjugatlösningen R7a, som är violettfärgad, kan kontrolleras visuellt i denna fas av hanteringen. Det är möjligt att verifiera förekomsten av den utspädda konjugatlösningen R7a i brunnarna genom en spektrofotometrisk avläsning vid 620 nm (enstaka våglängd). Se avsnitt 13 : SPEKTROFOTOMETRISK VERIFIERING AV PROV- OCH REAGENSPIPETTERING. 8. Bered färgframkallningslösningen (R8 + R9) strax innan den används. Se avsnitt 8 : REKONSTITUERING AV REAGENSER. 9. Fördela snabbt 80 µl färgframkallningslösning i varje brunn. Ställ plattan mörkt i 30 minuter ± 5 minuter i rumstemperatur ( C). OBSERVERA : Fördelningen av framkallningslösningen, som är rosafärgad, kan kontrolleras visuellt i den här fasen. Det finns en klar färgskillnad mellan tomma brunnar och brunnar med den rosafärgade lösningen. Se avsnitt 13 : SPEKTROFOTOMETRISK VERIFIERING AV PROV- OCH REAGENSPIPETTERING. 10.Tillsätt snabbt 100 µl stopplösning (R10) i varje brunn. OBS! Fördelningen av stopplösningen, som är färglös, kan kontrolleras visuellt i den här fasen. Efter tillsättningen av stopplösning blir det rosafärgade substratet ofärgat för negativa prover och 64 de blåfärgade substraten blir gula för positiva prover.

9 11.Torka noggrant av mikroplattans botten. Avläs den optiska densiteten vid 450/620 nm med hjälp av en plattavläsare minst 4 minuter efter tillsatsen av stopplösningen och inom 30 minuter efter att reaktionen har avbrutits. b) Förfarande vid HBe Ag-test 1. Bered tvättlösningen. 2. Ta ut en eller flera remsor och brickan ur förpackningen. Lägg tillbaka oanvända remsor i förpackningen och förslut den. 3. Fördela följande i brunnarna: A1, B1, C1: 100 µl av den negativa kontrollen (R3). D1: 100 µl av den positiva kontrollen (R5). E1, F1, G1: 100 µl av provet. Beroende på systemet som används kan man ändra kontrollernas position eller distributionsordningen. OBS! Det finns en klar färgskillnad mellan de tomma brunnarna och brunnar med prov (gula). Det är möjligt att verifiera förekomsten av prov i brunnarna genom en spektrofotometrisk avläsning vid 490 nm (enstaka våglängd). Se avsnitt 13: SPEKTROFOTOMETRISK VERIFIERING AV PROV- OCH REAGENSPIPETTERING. 4. Täck med självhäftande film och inkubera i 3 timmar ± 10 minuter i 37 C ± 1 C. 5. Bered konjugatlösningen R7b medan inkuberingen (steg 4) pågår. 6. Ta bort den självhäftande filmen. Sug upp innehållet i varje brunn i en behållare för biologiskt riskavfall. Tvätta därefter fyra gånger. 7. Fördela snabbt 100 µl utspädd konjugatlösning (R7b) i varje brunn eller använd R7b-konjugatet som det är med följande rekommenderade procedur : Fördela först 80 µl utspädd tvättlösning (R2) i varje brunn, sedan 20 µl anti-hbe-konjugat R7b (5X). Homogenisera. Täck med självhäftande film och inkubera i 30 minuter i 37 C ± 1 C (minst 25 minuter, högst 40 minuter). Ta bort den självhäftande folien, sug upp innehållet i varje brunn till avfallsbehållaren och tvätta därefter fem gånger. OBSERVERA : Fördelningen av den utspädda konjugatlösningen R7b, som är turkosfärgad, kan kontrolleras visuellt i denna fas av hanteringen. Det är möjligt att verifiera förekomsten av den utspädda konjugatlösningen R7a i brunnarna genom en spektrofotometrisk avläsning vid 620 nm (enstaka våglängd). Se avsnitt 13 : SPEKTROFOTOMETRISK VERIFIERING AV PROV- OCH REAGENSPIPETTERING. 8. Bered färgframkallningslösningen (R8 + R9) strax innan den används. 9. Fördela snabbt 80 µl färgframkallningslösning (R8 + R9) i varje brunn. Ställ plattan mörkt i 30 minuter ± 5 i rumstemperatur ( C). OBSERVERA : Fördelningen av framkallningslösningen, som är rosafärgad, kan kontrolleras visuellt i den här fasen. Det finns en klar färgskillnad mellan tomma brunnar och brunnar med den rosafärgade lösningen. Se avsnitt 13 : SPEKTROFOTOMETRISK VERIFIERING AV PROV- OCH REAGENSPIPETTERING. 10.Tillsätt snabbt 100 µl stopplösning (R10) i varje brunn. Obs! Fördelningen av stopplösningen, som är färglös, kan kontrolleras visuellt i den här fasen. Efter tillsättningen av stopplösning blir det rosafärgade substratet ofärgat för negativa prover och de blåfärgade substraten blir gula för positiva prover. 11.Torka noggrant av mikroplattans botten. Avläs den optiska densiteten vid 450/620 nm med hjälp av en plattavläsare minst 4 minuter efter tillsatsen av stopplösningen och inom 30 minuter efter att reaktionen har avbrutits. c) Förfarande vid parallellt anti-hbe- och HBe Ag-test (på samma platta) Tillvägagångssättet är detsamma som det som beskrivs ovan. Den enda skillnaden är provfördelningsschemat, som ser ut på följande sätt: Anti-HBe-test : raderna 1 till 6 HBe Ag-test : raderna 7 till 12 65

10 12 - BERÄKNING OCH UTVÄRDERING AV RESULTATEN a) Anti HBe-test 1. Beräkna medelvärdet för absorbans (= optisk densitet O.D.) i de negativa kontrollreplikaten : medelvärde för OD R3 Exempel : R3 negativ kontroll OD 1 1, , ,552 Total OD = 4,569 Medelvärde (OD R3) = total OD/3 = 4,569/3 = 1,523 Högst ett R3-absorbansvärde kan elimineras om det avviker med mer än 25% från medelvärdet. Beräkna därefter medelvärdet för absorbans på nytt med de två andra värdena. 2. Beräkning av cutoff-värde För varje platta beräknas cutoff-värdet enligt formeln : Cutoff-värde = medelvärde (OD R3) x 0,4 Exempel : Medelvärde (OD R3) = 1,523 Cutoff-värde = 1,523 x 0,4 = 0, Analysvalidering för anti-hbe-test Medelvärde (OD R3) > 0,900 OD R4 < 0, Beräkning av kvot För varje prov beräknas kvoten enligt formeln: Kvot = OD-prov / cutoff-värde 5. Utvärdering av resultaten Proverna anses som : positiva om kvotvärdet är lägre än eller lika med 0,9 (kvot 0,9) negativa om kvotvärdet är större än 1,1 (kvot > 1,1) Ligger resultatet däremot mellan 0,9 och 1,1 bör en ny anti-hbe-sökning göras i en efterföljande provtagning. Vi rekommenderar att positiva prover testas på nytt i duplikat. Efter omtest anses provet positivt om minst ett värde är positivt. b) HBe Ag-test 1. Beräkna medelvärdet för absorbans (= optisk densitet O.D.) i de negativa kontrollreplikaten : medelvärde för OD R3 Exempel : R3 negativ kontroll OD 1 0, , ,026 Total OD = 0,071 Medelvärde (OD R3) = total OD/3 = 0,071/3 = 0,024 Högst ett R3-absorbansvärde kan elimineras om det avviker med mer än 25 % från medelvärdet. Beräkna därefter medelvärdet för absorbans på nytt med de två andra värdena. 2. Beräkning av cutoff-värde För varje platta beräknas cutoff-värdet enligt formeln : Cutoff-värde = medelvärde (OD R3) + 0,025 Exempel : Medelvärde (OD R3) = 0,024 Cutoff-värde = 0, ,025 = 0, Analysvalidering för Ag HBe-test Medelvärde (OD R3) < 0,060 OD R5 > 0, Beräkning av kvot För varje prov beräknas kvoten enligt formeln : 66

11 Kvot = OD-prov / cutoff-värde 5. Utvärdering av resultaten Proverna anses som : negativa om kvotvärdet är mindre än 1 (kvot < 1) positiva om kvotvärdet är större än eller lika med 1 (kvot 1) Vi rekommenderar att positiva prover testas på nytt i duplikat. Efter omtest anses provet positivt om minst ett värde är positivt SPEKTROFOTOMETRISK VERIFIERING AV PROV- OCH REAGENSPIPETTERING 1 - Anti-HBe-TEST Förekomst av prov och kontroll Förekomsten av prov och kontroll i brunnarna kan verifieras med automatisk avläsning vid 490 nm. Varje brunn som innehåller en provkontroll måste ha en OD större än 0,050. Förekomsten av neutraliserande HBe-antigen (R6) Förekomsten av neutraliserande HBe-antigen i brunnarna kan verifieras med automatisk avläsning vid 490 nm med en OD delta-beräkning. OD delta = (OD490 prov (eller kontroll) med R6) (OD490 prov (eller kontroll) enbart) OD delta måste vara större än 0,150. Förekomst av koncentrerat Anti HBe-konjugattest (R7a) Förekomsten av utspätt konjugat R7a i brunnen kan verifieras med automatisk avläsning vid 620 nm. OD-värdet i varje brunn måste vara större än eller lika med 0,070 och mindre än eller lika med 0,200. Förekomst av framkallningslösning (R8 + R9) Förekomsten av framkallningslösning i brunnen kan verifieras med automatisk avläsning vid 490 nm. OD-värdet i varje brunn måste vara större än 0, HBe Ag-TEST Förekomst av prov och kontroll Förekomsten av prov och kontroll i brunnarna kan verifieras med automatisk avläsning vid 490 nm. Varje brunn som innehåller en provkontroll måste ha en OD större än 0,050. Förekomst av koncentrerat Ag HBe-konjugat (R7b) Förekomsten av utspätt konjugat R7b i brunnen kan verifieras med automatisk avläsning vid 620 nm. OD-värdet i varje brunn måste vara större än 0,210. Förekomst av framkallningslösning (R8 + R9) Förekomsten av framkallningslösning i brunnen kan verifieras med automatisk avläsning vid 490 nm. OD-värdet i varje brunn måste vara större än 0, TESTRESULTAT Testresultaten för Monolisa HBe Ag-Ab PLUS, sammanfattade nedan, har utvärderats på 2 ställen med prover från blodgivare, patienter och serokonversionspaneler. 1 - HBe Ag-test Specificitet Specificitet baserat på totalt 200 slumpvis utvalda blodgivare befanns vara 100% [98,51 100%], (IC95). Dessutom, utvärderades specificiteten på patientprover och befanns vara 100% [99,28 100%] (IC95, 416/416 prover). Analysen av 195 patienter som uppvisade andra sjukdomar eller tillstånd som inte var relaterade till hepatit B (gravida kvinnor, reumafaktor, antinukleära antikroppar, anti-mus-ig eller andra virus- eller bakterieinfektioner) gav en specificitet på 99,49% [97,18 99,99%] (IC 95, 194/195 negativa prover). Analytisk känslighet Testets känslighetsgräns har uppskattats vara 0,64 IU/ml [0,49 0,84] (IC 95) under utvärdering med PEI-standard. Känslighet Känsligheten testades på 203 positiva prover från uppföljning av patienter med kronisk HBV-infektion och kommersiella serokonversionspaneler. Känsligheten för dessa prover befanns vara 99,51% [97,29 99,99%] (IC 95, 202/203 prover). 67

12 Reproducerbarhet för testet Reproducerbarheten för testet Monolisa HBe Ag-Ab PLUS (HBe Ag) har bestämts genom analys av 4 prover : 1 negativt prov, 1 låg-hbe Ag-positivt prov, 1 hög-hbe Ag-positivt prov och 1 intermediärt HBe Ag-positivt prov. Reproducerbarheten inom testet har uppskattats genom testning av dessa 4 prover 30 gånger under samma körning. Reproducerbarheten mellan testen har uppskattats genom testning av dessa 4 prover i duplikat under 20 dagar med 2 test per dag. Resultaten visas i följande tabeller : Tabell 1 : Reproducerbarhet inom testet n = 30 prov 1 prov 2 prov 3 prov 4 medelvärde av kvoterna 3,56 5,29 27,24 45,56 standard-avvikelse (SD) 0,05 0,35 0,63 2,88 CV (%) 14,20 6,53 2,31 6,33 Tabell 2 : Reproducerbarhet mellan test n = 80 prov 1 prov 2 prov 3 prov 4 medelvärde av kvoterna 0,51 8,19 27,33 46,35 standard-avvikelse (SD) 0,12 1,17 3,26 4,98 CV (%) 23,86 14,27 11,92 10, HBe Ab-test Specificitet Specificitet baserat på totalt 200 slumpvis utvalda blodgivare befanns vara 100% [98,51 100%], (IC95). Dessutom utvärderades specificiteten på 206 patientprover och befanns vara 98,54% [95,80-99,70%] (IC95, 203/206). 198 patienter som uppvisade andra sjukdomar eller tillstånd som inte var relaterade till hepatit B (gravida kvinnor, reumafaktor, antinukleära antikroppar, anti-mus-ig eller andra virus- eller bakterieinfektioner) testades. 3 prover befanns vara positiva (2 HCV-prover och 1 reumafaktorprov). Populationens specificitet är 98,48% [95,64 99,69%] (IC 95, 195/198 negativa prover). Dessa prover har testats om, reumafaktorprovet befanns upprepat reaktivt. De två HCV-proverna befanns antingen negativa eller tveksamma. Känslighet Känslighetsstudier har utförts på 220 positiva prover från uppföljning av patienter med kronisk HBVinfektion och kommersiella paneler. Känsligheten befanns vara 98,64% [96,07 99,72%] (IC 95, 217/220 prover). Reproducerbarhet för testet Reproducerbarheten för testet Monolisa HBe Ag-Ab PLUS (anti-hbe Ac) har bestämts genom analys av 4 prover : 1 negativt prov, 1 låg-hbe Ac-positivt prov, 1 hög-hbe Ac-positivt prov och 1 intermediärt HBe Ac-positivt prov. Reproducerbarheten inom testet har uppskattats genom testning av dessa 4 prover 30 gånger under samma körning. Reproducerbarheten mellan testen har uppskattats genom testning av dessa 4 prover i duplikat under 20 dagar med 2 test per dag. Resultaten visas i följande tabeller : Tabell 1 : Reproducerbarhet inom testet n = 30 prov 1 prov 2 prov 3 prov 4 medelvärde av kvoterna 3,15 0,69 0,42 0,03 standard-avvikelse (SD) 0,05 0,04 0,04 0,00 CV (%) 1,7 5,7 10,5 6,6 Tabell 2 : Reproducerbarhet mellan test n = 80 prov 1 prov 2 prov 3 prov 4 medelvärde av kvoterna 2,39 0,81 0,59 0,3 standard-avvikelse (SD) 0,23 0,077 0,09 0,01 CV (%) 9,6 9,5 14,5 39,3 68

13 15 - REFERENSER 1-MIYAKAWA Y.; MAYUMI M.; (1985) Hepatitis Be antigen and antibody (HBe Ag/Anti-HBe) in Hepatitis B. Academic Press., chap. 4: KANNO A.; OHORI H., MATSUDA K.; NAKAYAMA H.; MIYAZAKI Y.; ISHIIM.; SUZUKI H.; OHTSUKI M.; GOTO Y. (1987) Virological significance of HBe Ag subtypes (HBe Ag/1 and HBe Ag/2) in patients with type B hepatitis. Hepatology; 7 (1) BRECHOT C.; (1987) Les marqueurs et la prévention des infections par le virus de l hépatite B en Encyclopédie Médicochirurgicale; Instantanés Médicaux, 4; THIERS V.; BOUCHARDEAU F.; COUROUCE A.M.; TIOLLAIS P.; BRECHOT C., (1986) L ADN du virus de l hépatite B comme marqueur de multiplication virale: comparaison avec l antigène HBe et l anticorps anti Hbe. La Presse Médicale: 15: LAROUZE B., PENALBA C., DAZZA M.C. (1983) Signification des marqueurs sériques du virus de l hépatite B. Biologiste et praticien; 56; ALDERSHVILE J., FROSNER G.G.; NIELSEN J.O.; HARDT F. DEINHARTD F.; SKINHOJ P., (1980) Hepatitis Be antigen and antibody measured by radioimmuno-assay in acute hepatitis B surface antigen positive hepatitis. J. Infect. dis.: 141 (3), TAKAHASHI K.; IMAI M., TSUDA F., TAKAHASHI T., MIYAKAWA Y. MAYUMI M. (1976) Association of Dane particles with e antigen in the serum of asymptomatic carriers of hepatitis B surface antigen. J. of Immunol. 117 (1);

14 IVD (GB) - CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices) (FR) - Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnostic in vitro) (ES) - Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro) (IT) - Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro) (DE) - CE Konformitätskennzeichnung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika) (PT) - Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnóstico in vitro) (SE) - CE-märkning (Europeiskt direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter för in vitro-diagnostik) (DK) - CE-mærkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik) (GR) - CE ( 98/79/CE in vitro ) (PL) - CE oznaczenie (Dyrektywa unijna 98/79/CE dotycząca produktów medycznych do badań in vitro) (LT) - CE ženklas (Europos sąjungos direktyva 98/79/CE dėl in vitro diagnostikos medicinos prietaisų) (HU) - CE jelzés (98/79/CE Európai Irányelv az in vitro orvosi diagnosztikai eszközökről) (EE) - CE märgistus (Euroopa direktiiv 98/79/CE in vitro diagnostikameditsiiniseadmete kohta) (SK) - CE označenie o zhode (Európska direktíva 98/79/CE pre in vitro diagnostické zdravotnícke postupy) (CZ) - CE značka (Evropská direktiva 98/79/CE o diagnostických zdravotnických prostředcích in vitro) (NO) - CE-merking (EU-direktiv 98/79/CE om medisinsk utstyr til in vitro-diagnostikk) (RO) - Marca CE (Directiva europeana 98/79/CE pentru dispozitive medicale de diagnostic in vitro) (BG) - СЕ маркировка (Европейска директива 98/79/CE за ин витро диагностичните медицински изделия) (GB) - For in vitro diagnostic use (GB) - Catalogue number (FR) - Pour diagnostic in vitro (FR) - Référence catalogue (ES) - Para diagnóstico in vitro (ES) - Número de catálogo (IT) - Per uso diagnostico in vitro (IT) - Numero di catalogo (DE) - In-vitro-Diagnostikum (DE) - Bestellnummer (PT) - Para uso em diagnóstico in vitro (PT) - Número de catálogo (SE) - In vitro-diagnostik (SE) - Katalognummer (DK) - In vitro diagnose (DK) - Katalognummer (GR) - in vitro (GR) - (PL) - Do stosowania in vitro (PL) - Numer katalogu (LT) - in vitro diagnostikai (LT) - Katalogo numeris (HU) - Csak in vitro diagnosztikai alkalmazásra (HU) - Cikkszám (EE) - In vitro diagnostiliseks kasutamiseks (EE) - Katalooginumber (SK) - Na diagnostiku in vitro (SK) - Katalógové číslo (CZ) - Pro diagnostiku in vitro (CZ) - Katalogové číslo (NO) - Til in vitro-diagnostikk (NO) - Katalognummer (RO) - Pentru diagnostic in vitro (RO) - Număr de catalog (BG) - За ин витро диагностика (BG) - Каталожен номер (GB) - Manufacturer (GB) - Authorised Representative (FR) - Fabricant (FR) - Représentant agréé (ES) - Fabricante (ES) - Representante autorizado (IT) - Produttore (IT) - Distributore autorizzato (DE) - Hersteller (DE) - Bevollmächtigter (PT) - Fabricante (PT) - Representante Autorizado (SE) - Tillverkad av (SE) - Auktoriserad representant (DK) - Fremstillet af (DK) - Autoriseret repræsentant (GR) - (GR) - (PL) - Producent (PL) - Upoważniony Przedstawiciel (LT) - Gamintojas (LT) - Įgaliotasis atstovas (HU) - Gyártó (HU) - Meghatalmazott Képviselő (EE) - Tootja (EE) - Volitatud esindaja (SK) - Výrobca (SK) - Autorizovaný zástupca (CZ) - Výrobce (CZ) - Zplnomocněný zástupce (NO) - Produsent (NO) - Autorisert representant (RO) - Producător (RO) - Reprezentant autorizat (BG) - Производител (BG) - Упълномощен представител (GB) - Batch code (GB) - Expiry date YYYY/MM/DD (FR) - Code du lot (FR) - Date de peremption AAAA/MM/JJ (ES) - Código de lote (ES) - Estable hasta AAAA/MM/DD (IT) - Codice del lotto (IT) - Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG (DE) - Chargen-Bezeichnung (DE) - Verwendbar bis JJJJ/MM/TT (PT) - Código do lote (PT) - Data de expiração AAAA/MM/DD (SE) - Batchnr (SE) - Utgångsdatum ÅÅÅÅ/MM/DD (DK) - Batchkoden (DK) - Anvendes før ÅÅÅÅ/MM/DD (GR) - (GR) - YYYY/MM/DD (PL) - Numer serii (PL) - Data ważności YYYY/MM/DD (LT) - Serijos numeris (LT) - Galioja iki YYYY/MM/DD (HU) - Gyártási szám (HU) - Szavatossági idő ÉÉÉÉ/HH/NN (EE) - Partii kood (EE) - Aegumistähtaeg AAAA/KK/PP (SK) - Číslo šarže (SK) - Použiteľné do RRRR/MM/DD (CZ) - Číslo šarže (CZ) - Datum exspirace RRRR/MM/DD (NO) - Partikode (NO) - Utløpsdato ÅÅÅÅ/MM/DD (RO) - Număr de lot (RO) - Data expirarii AAAA/LL/ZZ (BG) - Партиден номер (BG) - Срок на годност година/месец/ден

15 (GB) - Storage temperature limitation (FR) - Limites de températures de stockage (ES) - Temperatura límite (IT) - Limiti di temperatura di conservazione (DE) - Lagertemperatur (PT) - Limites de temperatura de armazenamento (SE) - Temperaturbegränsning (DK) - Temperaturbegrænsning (GR) - (PL) - Temperatura przechowywania (LT) - Saugojimo temperatūriniai apribojimai (HU) - Tárolási hőmérsékleti határok (EE) - Piirangud säilitustemperatuurile (SK) - Skladovacia teplota od do (CZ) - Teplotní rozmezí od do (NO) - Oppbevaringstemperatur (RO) - Limitele de temperatură la stocare (BG) - Температурни граници на съхранение (GB) - Consult Instruction for use (FR) - Consulter le mode d'emploi (ES) - Consulte las instrucciones de uso (IT) - Consultare le istruzioni per uso (DE) - Siehe Gebrauchsanweisung (PT) - Consulte o folheto informativo (SE) - Se bruksanvisningen (DK) - Se instruktion før brug (GR) - (PL) - Sprawdź instrukcję (LT) - Ieškokite informacijos vartojimo instrukcijoje (HU) - Olvassa el a használati utasítást (EE) - Kasutamisel vaata instruktsiooni (SK) - Katalógové číslo (CZ) - Viz návod k použití (NO) - Se bruksanvisninger (RO) - Consultati prospectul de utilizare (BG) - Виж инструкцията за употреба

16 Bio-Rad 3, bd Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette - France Tél.: /2009 Fax.: Code: