Typning av virulensfaktorer och lite om MALDI-TOF. Bo Nilson Klinisk mikrobiologi Laboratoriemedicin Skåne

Transkript

1 Typning av virulensfaktorer och lite om MALDI-TOF Bo Nilson Klinisk mikrobiologi Laboratoriemedicin Skåne

2 Proteinet Ag ak Identifiering Agglutination Elisa Immunokromatografi Array Nukleinsyra DNA mrna

3 Kliniskt bruk Kit Oxiod (Denka Seiken) TSST-1 Stafylokock Enterotoxin A, B, C, D Denka Seiken Exfoliatin A och B (SSSS)

4 Latexagglutination Uppodlade bakterier, 2 dygn Anrikning och rening Reaktion och avläsning Sensitivitet 0,5 2 ng/ml

5 ELISA Federal office for civil protection, Spiez Laboratory, Schweiz

6 Immunokromatografi 9/11 Bioterrorism Anthrax Ricin Botulinumtoxin A, B SEB Sens 15 ng/ml Yersinia pestis Tularemi Brucella BioThreat Alert, Tetracore

7 Nukleinsyradetektion PCR Single- eller multiplex Gelelektrofores Realtid med smältkurva Realtid med specifika prober Array Fast form Beads Kromatografiskt

8 PCR Singleplex + IAC Panton-Valentin leukocidin (PVL) luks-lukf Nekrotiserande pneumoni (indikator) TSST-1 tst-1

9 Spa-typning av S. aureus Sekvensanalys av spa-genen för Protein A F R S E D A B C X Repetitiva segment (RS) 1 19 Unik sekvens t

10 Fördelning av SAg gener, agr typer, and eta and etd gener för olika spa-typer Holtfreter S et al. J. Clin. Microbiol. 2007;45:

11 emm-typning av grupp A streptokocker Sekvensanalys av emm-genen för M protein Två isolat har samma emm-typ om deras sekvens är > 95% identiska F R

12 Multiplex Detektion av många gener Array Fast Chip Beads Luminex Kromatografisk Hain Lifescience m fl

13 Vad kommer Nanoteknik Mishra et al, Lab chip 2008, 8:

14 Gerdes et al, CLI 2008, 5:22-25 Point-of-care

15 En ny, snabb och generell metod för artbestämning av bakterier och svamp med masspektrometri MALDI-TOF ID mass fingerprint Bo Nilson, Klinisk mikrobiologi

16 Metoder som används för artbestämning idag 1 dag Övernattodling av bakterier på agarplattor Problem: Långtifrån alla prov artbestäms dag 1. Snabbare metoder behövs! Snabba metoder Morfologi (makro / mikroskopisk) Snabbtester (katalas, oxidas, pasturex etc) Selektiva och differentierande plattor (chromagar) Direkt antibiotika resistens MALDI-TOF Långsamma metoder Fenotypiska (API, Jäsningar ) Genotypiska (16S sekvensering) Bo Nilson, Klinisk mikrobiologi

17 Arbetsflöde MALDI Biotyper Plocka en koloni Okänd mikroorganism Preparera provet på MALDI-platta Identifierad art Databas sökning Automatiserad spektruminsamling Bo Nilson, Klinisk mikrobiologi

18 Provberedning MALDI target Överför celler till provplattan MALDI target Tillsätt matrixlösning (1 µl) Avdunstning av lösningsmedel vid rumstemperatur Automatiserad MS-analys Matrix: UV-absorberande protondonator Bo Nilson, Klinisk mikrobiologi

19 Arbetsflöde MALDI Biotyper Plocka en koloni Okänd Mikroorganism Preparera prov på MALDI-platta Identifierad art Databas sökning sek Automatiserad spektruminsamling sek Bo Nilson, Klinisk mikrobiologi

20 Principle of MALDI-TOF Mass Spectrometry Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization - Time Of Flight MS + 20 kv - UV-Laser Ion detector Vacuum Target plate Analyte in matrix crystals Acceleration Drift Time-of-Flight Desorption/ Ionization UV-Laser Intensity kv laser shots sec. per sample m/z

21 Bred tillämpning av MALDI-TOF MS profil Svamp, jäst, gram+ and gram- bakterier Aspergillus fumigatus Candida albicans Bacillus subtilis Escherichia coli m/z Bo Nilson, Klinisk mikrobiologi

22 Hur fungerar det? MALDI-TOF profil (rådata) Pinnspektrum (processad data) Okänt prov Stam från databasen med känd ID Det erhållna spektrat konverteras till ett pinnspektra och alignas sedan till det spektra Color i referensdatabasen coded som matchar bäst. identification Bo Nilson, Klinisk mikrobiologi

23 Bo Nilson, Klinisk mikrobiologi

24 Analyte Analyte Organism Score Organism Score Name ID (best match) Value (second best match) Value E1 ( +++ ) E2 ( +++ ) E3 ( +++ ) E4 ( +++ ) E5 ( +++ ) E6 ( ++ ) E7 ( +++ ) E8 ( + ) E9 ( +++ ) MALDI Biotyper 2.0 result table BAT Enterococcus faecium 2,468 Enterococcus faecium 2,466 BB107/09 Enterococcus faecalis 2,431 Enterococcus faecalis 2,319 BAT Enterobacter cloacae 2,362 Enterobacter cloacae 2,232 BAT Klebsiella pneumoniae 2,408 Klebsiella pneumoniae 2,17 BB2337/09 Clostridium perfringens 2,386 Clostridium perfringens 2,267 BS7547/09 Corynebacterium diphtheriae 2,15 Corynebacterium diphtheriae 2,096 BAT Corynebacterium striatum 2,365 Corynebacterium striatum 2,254 BAT Eikenella corrodens 1,937 not reliable identification 1,401 BNL1800/09 Legionella pneumophila 2,367 Legionella pneumophila 1,921 Bo Nilson, Klinisk mikrobiologi

25 Begränsningar Vissa närbesläktade arter kan ej särskilja Shigella-arter inte i databasen Identifieras som E. coli Streptococcus pneumonia och S. mitis-gruppen kan inte säkert separeras. Arter som ingår i Burkohlderia cepacia-komplexet kan inte särskiljas. och några andra Arter som inte finns i databasen kan inte identifieras

26 Två nya MS-system från Bruker Hårdvara: MALDI-TOF: Microflex MALDI-TOF-TOF: UltrafleXtreme Mjukvara: MALDI Biotyper Artidentifiering av mikroorganismer Bo Nilson, Klinisk mikrobiologi

27 Exempel på långsamma metoder Dagar Kortjäsning (KJ) 1 Kortjäsning OL (KJOL) 1 Långjäsning (LJ) 1 Shigellajäsning (SHIGJ) 1 Yersiniajäsning (YERSJ) 1 API 20 C AUX (20CAUX) >1 API svamp (ID32C) >1 API 20E (20E) 1 API CORYNE (CORYNE) 1 API NE (NE) 1 API STREP (20STRE) 1 API NH (NH) 2 Pseudplatta (PSE) 1 Tweenplatta (TW80) 1 XVplatta (XV) 1 Tellurit (TEL) 1 Camptest (CAMP) 1 Omvänd camp (OMCAMP) 1 Rörkoagulas (COA) 1 Optochin (OPTO) 1 Rapidana (RAPID) 1 Deferoxamine (DEFER) 1 Salmonella fag (FAG) 1 VA CO KA GALLA (VCKGA) 2 MALDI-TOF MALDI-TOF är en snabb och generell metod Man behöver inte välja vilken metod som ska användas 2 min 2 tim

28 Artidentifikation Fram till nu Biokemiska tester Antigenpåvisning Nukleinsyraanalys I framtiden MALDI-TOF Nukleinsyraanalys Antigenpåvisning Biokemiska tester MALDI-TOF Bo Nilson, Klinisk mikrobiologi

29 Snabb artidentifiering av positiva blododlingar med MALDI-TOF Två olika sätt antingen att odla ut på platta och plocka kolonier så fort de är synliga >5h eller att använda ett förprotokoll som tvättar bort blodprodukterna från bakterierna i provet och sedan använda standardprotokollet för MALDI <1h Bo Nilson, Klinisk mikrobiologi

30 Snabb artidentifiering av positiva blododlingar med MALDI-TOF Schubert et al., ECCMID 2010 Total tid för isolering av bakterier: ~5 min! Prestanda: >80% korrekt ID inga falskt-positiva ID Bo Nilson, Klinisk mikrobiologi

31 Kombinera snabb artidentifiering med MALDI-TOF med resistensbestämning med Phoenix eller Vitek 2 Phoenix (BD) MALDI-TOF, Bruker Vitek 2 (Biomerieux)

32 Identifiering av antibiotikaresistenta bakterier Ampicillin-resistenta E. coli Toppen m/z 29,000 är β-lactamase Analysera skillnader i massprofiler Detektion av resistensmarkörer Funktionell MALDI-assay där produkter from resistensenzymer detekteras Camara et al 2007 Bo Nilson, Klinisk mikrobiologi

33 Bestämning av antibiotikaresistens för Extended Spectrum Beta-Lactamase (ESBL) Funktionell MALDI-assay för detektion av hydrolyserat ampicillin Sparbier et al JCM 2012

34 Identifiering av virulenta bakterier Enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC) Påvisa Shiga-/verotoxiner stx1 och/eller stx2 Virulensgener eaea uida (O157) Stx2 Fagerqvist 2011

35 Samanfattning av MALDI-TOF Generell metod Identifierar de allra flesta kliniskt relevanta bakterier och svampar Kan detektera mixade kolonier Minimal och enkel provberedning Enkelt köra instrumentet Snabb analys till låg kostnad Miljövinster Ny plattform för utveckling och forskning Sabbare artbestämning med MALDI-TOF kommer att sänka svarstiderna betydligt Bo Nilson, Klinisk mikrobiologi