Alternativa metoder för att påvisa antibiotikaresistens. Håkan Janson

Transkript

1 Alternativa metoder för att påvisa antibiotikaresistens Håkan Janson

2 Traditionell resistensbestämning Fenotypisk testning Lappdiffusion Buljongspädning Detektion med utodling (Golden standard) Detektion med fotometri Detektion med fluorofotometri Detektion med turbidometri (VITEK) Detektion med kalorimetri Agarspädning

3 Begränsningar med fenotypisk testning Ett stort inokulat i renkultur krävs Komplicerad preanalytisk process Begränsat organism-spektrum Analytisk variabilitet Lång tidsåtgång Relativt hög kostnad (om man inkluderar alla steg)

4 Molekylär resistensbestämning PCR för enstaka kända resistensgener Makrolider (erytromycin, klaritromycin etc) Meticillinresistens (meca, mecc) Vancomycinresistens (vana, vanb) Enstaka betalaktamaser (tex utbrott av ESBL) Multiplex-PCR ev medmicro-array om man letar efter flera Aminoglykosider, tetracyklin, betalaktamer, kloramfenikol, erytromycin, kinoloner, sulfa, trimetoprim, rifampicin, isoniazid ESBL av olika slag ESBL-CARBA av olika slag

5 Begränsningar med molekylär resistensbestämning Vissa analyser är enkla meca, vana, vanb, Andra är mer avancerade (ESBL mm) Somliga är mycket svårtolkade (porin-mutationer etc) Ofta måste man sekvensera PCR produkter Det är svårt att avgöra om genen uttrycks eller ej Kan inte detektera alla resistensmarkörer Hög kostnad Inte allmänt accepterade

6 Resistensbestämning av bakterier vi inte odlar Antalet agens vi detekterar med molekylärbiologiska metoder ökar Chlamydia trachomatis Neisseria gonorrhoeae Mycoplasma genitalium Mycoplasma pneumoniae Chlamydophila pneumoniae Legionella pneumophila Clostridium difficile MRSA, Salmonella, Campylobacter, Yersinia, EHEC Hur hanterar vi resistensbestämningen av dem?

7 Makrolidresistens är ett icke försumbart problem I arter som Mycoplasma genitalium Mycoplasma pneumoniae Helicobacter pylori Chlamydia trachomatis Arterna är svåra att odla men lätta att detektera med PCR Makrolidresistens kan detekteras med PCR med hög känslighet och specificitet

8 Traditionell Helicobacter pylori detektion och resistensbestämning Relevant när man misstänker terapisvikt Odling av biopsi från magslemhinnan Resistensbestämning mot Claritromycin, Metronidazol och Amoxicillin Resistensen är ibland svår att läsa av Bl a pga mögelöverväxt

9 Helicobacter pylori detektion och claritromycin resistensbestämning 23S rrna genen Realtids-PCR detektion Smältpunktsanalys avgör claritromycinkänsligheten Mutationer

10 Funderingar kring gonokocker (enligt Cathy Ison) Hur ska man kombinera resistensbestämning och molekylärbiologi för gonokocker? Endast 54% av PCR-fynd kunde konfirmeras med odling 72% av de med symptom kunde konfirmeras med odling Patientnära test på inmarsch GeneXpert för GC/CT har bra känslighet (Tabrizi J Clin Micro 2013) Man måste behålla odlingsexpertisen för att kunna övervaka resistensutvecklingen. Sentinelprovtagning för odling under 3 mån/år kan vara en lösning För bedömning av behandlingssvikt fungerar inte PCR utan där måste man odla och resistensbestämma

11 Andel MRSA 2011 Källa: Annual report of the European Antimicrobial Resistance Surveillance Network (EARS-Net)

12 MRSA-förekomst i Sverige Antal MRSA i Sverige (från SMI:s hemsida)

13 MRSA-screening i realtid Halmstadsmodellen Anrikning i selektiv buljong DNA-extraktion Kvantifiering av S. aureus-specifik gen På vissa lab även meca-gen På andra MRSA med SCCmec Besvaring av PCR-negativa prov efter 1 dygn Utodling av PCR-positiva prov

14 MRSA screening i Skåne mecc (LGA251) = en ny variant av mec gen som vi fn inte hittar i molbiol screening. Därför odlas alla buljonger med mycket S. aureus ut

15 Måste vi överhuvudtaget odla MRSA? Med mec och nuc metod JA meca finns även i andra stafylokockarter -> blandningar av MRSE och MSSA blir falskt positiva Med Huletsky-metoden dvs SCCmec JA

16 SCCmec fallgropar Nya SCCmec-varianter kommer att bli falskt negativa Kända MRSA-stammar kan mutera och bli methicillin-känsliga men ändå förbli PCR-positiva

17 Snabbare MRSAscreening som kan utföras lokalt Cepheid GeneXpert eller motsvarande Låg sensitivitet (61%) och PPV (38%) enligt Roisin 2012 Eur J Clin Microbiol

18 Vancomycinresistenta Enterokocker (VRE) Källa: Annual report of the European Antimicrobial Resistance Surveillance Network (EARS-Net)

19 Vancomycinresistenta enterokocker (E. faecium och E. faecalis) Två olika resistensgener vana Resistent mot både Vancomycin och Teicoplanin vanb Resistent mot Vancomycin men känsligt för Teicoplanin vana/b gener kan bäras av många andra bakteriearter (Clostridium, Bacillus, Eggerthella m fl) Dessa är ej anmälningspliktiga enligt smittskyddslagen

20 Antal VRE i Sverige Specifika kloner orsakar då och då stora utbrott Antal VRE i Sverige

21 VRE - buljonganrikning

22 Andel E. coli som har nedsatt känslighet för 3:e generationens cefalosporiner 2004

23 Andel E. coli som har nedsatt känslighet för 3:e generationens cefalosporiner 2011

24 Kan man detektera ESBL (Extended Spectrum BetaLactamases) med PCR? ESBL A Klassisk ESBL som hämmas av betalaktamasinhibitor (> 100 varianter av t ex CTX-M, SHV, TEM-typ) ESBL M Betalaktamas av AmpC- eller OXA-typ. Många varianter. Hämmas av oxacillin men inte av betalaktamasinhibitorer ESBL - Carba Den värsta sorten eftersom dessa även är bryter ned karbapenemer (imipenem, meropenem)

25 ESBL-CARBA Icke metallobetalaktamaser Klass A KPC (USA, Israel, Grekland), SME, IMI, NMC, GPC Klass D (OXA-enzymer) OXA-48 (Turkiet, mellanöstern, nordafrika), OXA-23, OXA-24/40, OXA-51, OXA-58 Metallobetalaktamaser (Klass B) NDM (Indien, Pakistan) VIM (endemisk i Grekland, spridd i världen) IMP (19 varianter spridda i världen), GIM, SPM, SIM Många ESBL-stammar är multiresistenta Vissa ESBL-Carba är totalresistenta

26 Andel Klebsiella pneumoniae som har nedsatt känslighet för karbapenemer 2011

27 Andel Klebsiella pneumoniae som är resistenta mot 3:e generationens cefalosporiner 2011

28 ESBL screening direkt från rektal-swab med multiplex PCR Fungerar rent tekniskt bra Anrikning behövs ej men bör DNA extraheras Färgad pinne bättre än faeces Hittar bara de varianter man letar efter Hittar inte nya varianter Bra vid utbrott av en given klon Detekteras med specifik PCR mot just den ESBLvarianten

29 Fenotypisk resistensbestämning Metod Princip < 10 5 Agarspädning Automatisk resistenstest Icke-växt på media innehållande olika abkoncentrationer Buljongspädning Optisk mätning av tillväxt i substrat Växtinhibition i buljong innehållande olika abkoncentrationer cfu Billig Autom atisk Hetero gen res Äkta MIC Snabb Nej Ja Nej Ja Ja Nej Nej Ja Ja Ja/Nej Ja/Nej Ja/Nej Nej Ja Ja/Nej Ja/Nej Ja Nej Diskdiffusion Inhibition runt en ab-disk Nej Ja Ja/Nej Ja Nej Nej E-test Inhibition runt en remsa med ab-gradient Nej Ja Ja/Nej Ja Ja Nej

30 Annan befintlig resistensbestämning Metod Princip < 10 5 Kromogena agarsubstrat Fluoroscerande färgning PCR Realtids mikroskopi Färgomslag när en produkt bryts ner Mikroskopi av levande/döda celler i närvaro av fluroforer DNA amplifiering av resiistensgener Filmande av bakteriers delning cfu Billig Autom atisk Hetero res Äkta MIC Snabb Nej Ja/Nej Nej Ja Nej Nej Ja Ja Nej Nej Nej Ja Ja Ja/Nej Ja/Nej Nej Nej Ja Ja Ja Nej Nej Nej Ja

31 Nära förestående resistensbestämning Metod Princip < 10 5 Cantilever teknologi Mikrokalorimetri Flödescytometri Spinn av magnetiska kulor MALDI-TOF MS Mikrodroppar Helgenomsekvensering Detektion av värmeproduktion Vägande av bakterier med cantilever vibrationer Detektion av levande/döda celler Olika spinn beroende på hur många bakterier som fastnat Detektion av abdegradering + mönster Tillväxt eller substratkonversion i nl droppar Sekvensering av hela genom cfu Billig Autom atisk Hetero res Äkta MIC Snabb Ja? Ja Nej Ja Ja/Nej Ja? Ja Ja/Nej Ja Ja/Nej Ja Ja/Nej Ja Nej Ja/Nej Ja/Nej Nej? Ja Nej Nej Ja/Nej Nej Ja Ja Nej Nej Ja/Nej Ja? Ja Ja/Nej Ja/Nej Ja/Nej Ja Nej Ja Nej Nej Nej

32 Isoterm mikrokalorimetri Man mäter värmeproduktionen/reduktion över tid (t ex när bakterier tillväxer) Tekniken beskrevs 1780 (is i ett utrymme smälte snabbare ju större djur man lade i) Första artikeln är från 1918 (Hill) Svenskar bakom den moderna designen (Wadsö 1968) Torvald Ripa använde mikrokalorimetri för att mäta vilka tillsatser som var bäst för blododlingar (1977)

33 Design

34 Man mäter: Värmeflöde i mw Energi i Joule (W x s) P = E / t W = J / s

35 Exempel på resultat

36 Mycket bra korrelation med buljongspädning dock ej mycket snabbare Von Ah et al, BMC Microbiology 2009, 9:106

37 Helgenomssekvensensering av framvuxna bakteriestammar Billigt, enkelt och snabbt Det kostar idag ca 60 euro för ett bakteriegenom Kan göras på små bordsinstrument Resultat inom 24 timmar Resultat kan användas till Typning och resistensbestämning (se Eyre 2012 BMJ Open) 95% sensitivitet och 95% specificitet på ab-bestämning 99,7% konkordans mellan fenotypisk AST och WGS AST (Zankari JAC 2013 på 200 stammar och 3051 tester) Utesluta släktskap hos fenotypiskt lika stammar (se Köser 2012 NEJM) Fastställa spridningsvägar både lokalt och globalt

38 Problem med helgenomssekvensering Avancerade förberedelser Dyrt om man kör få prov Genererar enorma mängder data Svårt för lekmän att analysera resultat Automation är nödvändig

39 ResFinder - Gratisverktyg för analys Databas med kända resistensgener On-line mjukvara som gör en BLAST sökning gentemot databasen Färdiga helgenom Ofärdiga helgenom Korta eller långa sekvenser

40 ResFinder hittar vad den skall bland redan sekvenserade bakteriegenom

41 Test av ResFinder (och MLST) 200 isolat (50 var av E. coli, S typhimurium, E. faecalis, E. faecium) isolerade från danska grisar 3051 fenotypiska test gjordes 482 blev resistenta 2569 blev känsliga Konkordans 99,74% 7 skilde sig mellan fenotyp och genotyp (6 st var streptomycin i E. coli) MLST och resistensprofil korrelerade dåligt (förutom för Salmonella typhimurium). Resistensmönster är alltså inget särskilt bra epidemiologiskt verktyg Zankari et al. J Antimicrob Chemother 2013; 68:

42 Resistensbestämning som kan komma Metod Princip < 10 5 Bakteriefag amplifiering Apoptosmarkörer Flödescytometri Kolorimetrisk detektion av respiration Elektroniska näsor Impedans Infraröd spektroskopi Detektion av apoptosmarkörer Detektion av fagreplikering i levande celler Detektion av levande/döda celler Optisk detektion av cell respiration Detektion av flyktiga organiska ämnen Elektrisk skillnad mellan levande och döda celler Absorptionsspektrum av bakterier under IR-ljus cfu Billig Autom atisk Hetero res Äkta MIC Nej Ja/Nej Ja/Nej Nej Nej Ja Snabb Ja Ja/Nej Nej Nej Nej Nej Ja Ja/Nej Ja Nej Ja/Nej Ja/Nej Ja Ja Ja Nej Nej Ja Nej Ja Ja Nej Ja Ja Nej? Ja Nej Nej Ja/Nej Ja Ja/Nej Ja Ja/Nej Nej Ja/Nej

43 Resistensbestämning som kan komma 2 Metod Princip < 10 5 LC-ESI MS Metabolomics (inkl ROS) Mätning av mikroljud NMR Raman spektroskopi RNA sekvensering Proteomics av levande döda celler samt resistensmarkörer Förändringar i intracellulära molekyler Skillnader i vibrationer mellan levande och döda bakterier Molekylär uppsättning med magnetresonans Absorption hos laserstrålade bakterier cfu Billig Autom atisk Hetero res Äkta MIC Snabb Nej Nej Ja Nej Nej Ja/Nej Nej? Ja Nej Nej Ja Ja? Ja Nej Nej Ja/Nej Nej? Ja Nej Nej Nej Ja Ja Ja Ja/Nej Nej Ja/Nej Skillnader i genexpression Ja Nej Ja Nej Nej Nej

44 Konklusion ett Fenotypisk antibiotikaresistenbestämning kommer att förbi essentiellt för att: Hitta nya resistensmekanismer Detektera kombinationer av icke resistensgener som leder till fenotypisk resistens (efflux, poriner) Hitta känsliga stammar hos de som bär på resistensmarkörer

45 Konklusion två Molekylära resistensmetoder är ett viktigt komplement För enkel detektion av vissa markörer/kloner För potentialen i helgenomsekvensering Många nya spännande alternativa metoder är på gång Det kan dock ta flera år innan de är i rutinbruk på lab Ett undantag är MALDI-TOF