Quantiferon-TB Gold Plus

Quantiferon-TB Gold Plus Verifiering av metoden, svarsrutiner, problem och fallgropar Torbjörn Kjerstadius 2017-03-14

Vad är Quantiferon-TB Gold Plus? Quantiferon TB-Gold Plus (QFT) är en Interferon Gamma Release Assay (IGRA-test). Det innebär att testen innehåller rör med tuberkulosantigen som stimulerar T-lymfocyter att producera interferon-γ om de tidigare stött på Mycobacterium tuberculosis personen har tidigare blivit smittad. Den är i första hand avsedd att påvisa latent tuberkulos, dvs vilande sjukdom, men påvisar också 85-95% av fallen med aktiv tuberkulos Den ersätter eller kompletterar tuberkulintestet (PPD). QFT korsreagerar inte med i BCG-vaccinet förekommande antigener och ej heller med de flesta andra mykobakterier, undantaget M. marinum, M. kansasii och M. szulgai. 2

Hur fungerar testen? Provtagning sker med 4 olika rör: Nil-rör (neg kontroll) som mäter bakgrundproduktionen av IFN-γ, TB1-rör med rekombinanta tb-antigen som liknar ESAT-6- och CFP-10- peptider. Dessa stimulerar i huvudsak CD4-lymfocyter att producera IFN-γ. TB2-rör med peptider från samma antigen som sägs stimulera i huvudsak CD8-lymfocyter till IFN-γ-produktion Mitogen-rör (pos kontroll) där lymfocyter i provet stimuleras med ett kemiskt ämne för att inducera IFN-γ -produktion (kontroll av att provhanteringen utförts korrekt samt test på att personens lymfocyter klarar av att producera IFN-γ överhuvudtaget). I röret med tb-antigenen kommer lymfocyterna i blodet under inkubationsfasen att producera bland annat interferon-γ, men bara om de tidigare har exponerats för tb-antigener. Även kontrollrören inkuberas. Efter inkubation centrifugeras rören för att separera blodkroppar från plasma. Plasma analyseras sedan med en enzyme immuno assay (EIA) avseende IFN-γ-nivån. 3

Verifiering av testen Jämförelse med den äldre 3-rörsmetoden Material: 271 patientprov var 205 konsekutiva och 66 selekterade (positiva, lågt positiva, högt negativa och indeterminanta i 3- rörstesten). Prov togs i litiumheparinrör samtidigt som prov tagits för Quantiferon Tb Gold in tube (3-rörs) och överfördes manuellt till de 4 rören. 4 konstruerade prov (2 prov med Nil > 8,0 samt 2 prov med tb-ag Nil < 25 % av Nil). British Standard No 1 för IFN-γ (NIBSC 82/587) för spädningsserie. 4

IU/mL Resultat spädningsserie standard Tvåstegsspädning British standard 1 för Interferon-γ i duplikat 100 10 1 Körning 1: y = 24,036e -0,546x R² = 0,9933 Körning 2: y = 29,145e -0,634x R² = 0,9942 1/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200 1/6400 1/12800 1/25600 0,1 Spädning Förväntat IU/mL Beräknat IU/mL 1 Beräknat IU/mL 2 5

Resultat: Sammanfattande tabell Quantiferon Tb Gold Plus (4-rörs) Quantiferon Tb Gold in-tube (3-rörs) Positiv 1 Positiv 0,35 - < 1 Negativ > 0,20 - <0,35 Negativ 0,20 Indeterminant Positiv 53 3 1 Positiv 0,35 - < 1 2 14 1 Negativ 2 6 1 > 0,20 - <0,35 Negativ 1 4 174 5 0,20 Indeterminant 2 6 Avvikande prov 5 prov som blir indeterminanta i 3-rörsvarianten blir negativa i 4-rörsvarianten. Samtliga dessa beror på att mitogenröret får ett värde över 0,5 i 4-rörstesten. 12 prov med mindre skillnader (negativ högt negativ, lågt positiv högt negativ, lågt positiv positiv) ligger oftast värdet nära cut off-gränserna mellan kategorierna. 2 prov uppvisar större skillnad. 1 prov blir lågpositivt i 3-rörs (0,53 IU/mL) men negativt (< 0,20) i både Tb1och Tb2 i 4-rörs. Ett prov är negativt (0,14 IU/mL) i 3-rörs men lågpositivt i 4-rörs (tb1 0,18, Tb 2 0,35 IU/mL)

Resultat- detektionsgräns, sensitivitet och specificitet Detektionsgräns Tillverkaren anger den analytiska detektionsnivån till 0,05 IU/mL. Utifrån spädningsserier är detektionsgränsen < 0,20 IU/mL. Sensitivitet Sensitiviteten (diagnostisk) anges av tillverkaren till 95,3 % i ett material med prov från patienter med odlingspositiv aktiv tuberkulos. Någon redovisning för latent tuberkulos görs inte eftersom referensmetod saknas. I eget material omfattande 75 positiva prov i 3-rörsvarienten blir 72 positiva med 4-rörsvarianten vilket ger en sensitivitet (analytisk) om 96 % om 3-rörs betraktas som gold standard. Specificitet Tillverkaren har testat specificiteten i ett material omfattande ca 400 prov och redovisar en specificitet om 97,6 %. I ett eget material omfattande 271 prov beräknas specificiteten till 99,5 %. 7

Resultat - samstämmighet (concordance) och precision Samstämmighet Samstämmigheten i kategorierna positiv, lågt positiv, högt negativ, negativ och indeterminant blir 91,9 % och i kategorierna positiv, negativ, indeterminant 95,6 %. Precision Kitkontroller i 3 nivåer K S1 S2 S3 Medelvärde 1,02 0,49 0,19 OD CV ms % 6,2 5,7 8,8 Kitoberoende kontroller låg/hög Låg Hög Medelvärde 0,26 1,14 OD CV ms % 10,1 10,7 8

Svarsrutiner 1 Resultat Negativa värden < 0,20 IU/mL 2) Exempel med eventuella kommentarer P- IFNγ tuberkulos-antigen Tolkning: Negativ 1) P- IFNγ tuberkulos-antigen 1 0,19 IU/mL P- IFNγ tuberkulos-antigen 2 0,01 IU/mL Negativa värden 0,20 - < 0,35 IU/mL P - IFNγ tuberkulos-antigen Tolkning: Negativt gränsvärde 1) P - IFNγ tuberkulos-antigen 1 0,25 IU/mL P - IFNγ tuberkulos-antigen 2 0,33 IU/mL Kommentar: Negativ men nära detektionsgränsen. Resultat mellan 0,20 0,99 IU/mL skall tolkas med försiktighet och kliniska uppgifter tas med i slutbedömningen. Nytt prov bör övervägas. Negativt och positivt värde P- IFNγ tuberkulos-antigen Tolkning: Positivt gränsvärde 1) P- IFNγ tuberkulos-antigen 1 0,36 IU/mL P- IFNγ tuberkulos-antigen 2 0,25 IU/mL Positiva värden 0,35 - < 1,0 IU/mL Positiva värden 0,35 - < 1,0 IU/mL Kommentar: Positiv men nära detektionsgränsen. Resultat mellan 0,20 0,99 IU/mL skall tolkas med försiktighet och kliniska uppgifter tas med i slutbedömningen. Nytt prov bör övervägas. P- IFNγ tuberkulos-antigen Tolkning: Positivt gränsvärde 1) P- IFNγ tuberkulos-antigen 1 0,46 IU/mL P- IFNγ tuberkulos-antigen 2 0,54 IU/mL Kommentar: Positiv men nära detektionsgränsen. Resultat mellan 0,20 0,99 IU/mL skall tolkas med försiktighet och kliniska uppgifter tas med i slutbedömningen. Nytt prov bör övervägas. P- IFNγ tuberkulos-antigen Tolkning: Positiv 1) P- IFNγ tuberkulos-antigen 1 5,56 IU/mL P- IFNγ tuberkulos-antigen 2 6,23 IU/mL 9

Svarsrutiner 2 Resultat Ej bedömbar a) mitogenrör < 0,50 IU/mL * b) Nil-rör > 8 IU/mL ** Exempel med eventuella kommentarer P- IFNγ tuberkulos-antigen Tolkning: Ej bedömbar 1) P- IFNγ tuberkulos-antigen 1 (inget värde lämnas ut) P- IFNγ tuberkulos-antigen 2 (inget värde lämnas ut) Svarskommentar enligt * respektive ** * Ej bedömbar pga svag mitogen-stimulering ** Ej bedömbar pga hög bakgrundsnivå Ej bedömbart resultat kan förses med kommentaren: TB 1 eller TB 2 0,35 men < 25% av Nil. Andra röret negativt eller samma. TB 1 eller TB 2 0,35 men < 25% av Nil. Andra röret 0,35 och 25% av Nil. Låg Interferon-gamma-reaktivitet vid mitogenstimulering gör att provet inte kan bedömas. Detta beror oftast på otillräcklig blandning av provet efter provtagning eller på att patienten är immunsupprimerad. Nytt prov bör övervägas. Hög bakgrundsnivå av Interferon-gamma gör att provet inte kan bedömas. Detta kan bero på annan pågående infektion eller immunaktivering av annan orsak. Nytt prov kan ge bedömbart resultat om orsaken till immunaktiveringen åtgärdas. Vid ej bedömbart resultat kan analys med en alternativ test (T-spot.TB) övervägas. Denna utförs av Folkhälsomyndigheten respektive Sahlgrenska Universitetssjukhuset. T-spot.TB uppvisar få ej bedömbara resultat. P- IFNγ tuberkulos-antigen Tolkning: Negativ 1) P- IFNγ tuberkulos-antigen 1 (inget värde lämnas ut) P- IFNγ tuberkulos-antigen 2 (inget värde lämnas ut) P- IFNγ tuberkulos-antigen Tolkning: Positiv 1) P- IFNγ tuberkulos-antigen 1 # P- IFNγ tuberkulos-antigen 2 # # = värde lämnas om 25% av Nil, inget värde lämnas ut om < 25% av Nil. 10

Problem och fallgropar Testen mycket känslig för avvikelser i hantering Provtagning på höjd > 810 meter över havet. Felaktig mängd blod i röret. Ej adekvat skakning omedelbart efter provtagning. För lite skak medför att Tb-antigenen ej blandas med blodet. För mycket skak kan dels skada celler och dels ge hemolys som stör testen. Förvaring och transport i felaktig temperatur (ska ske i rumstemperatur). Kylfransport kan medföra att T-lymfocyterna ej fungerar. För lång tid mellan provtagning och inkubering (>16 timmar). Kan dels medföra att celler dör men också ge för hög IFN-γ-produktion. För lång inkubation (> 24 timmar). För hög IFN-γ-produktion. Otillräcklig tvätt av EIA-brunnar. Fibrinklumpar i plasman. EIA-plattan har utsatts för direkt solljus. Konjugatet felaktigt hanterat (för länge i rumstemperatur, utsatt för ljus). Kontamination av ingående lösningar (t ex bakteriell kontamination). 11

Vad vi är osäkra på TB1 och TB2-rören Är det någon skillnad mellan rören? Påvisar verkligen TB2-röret aktiv tuberkulos bättre an TB1-röret? Varför man i den nya varianten har uteslutit peptider från TB7.7- antigenet är oklart. Man kompletterade 3-rörsvarianten med detta antigen för att det skulle ge bättre prestanda, men nu säger tillverkaren att man får bättre prestanda genom att ta bort det. Cut off-gränsen Om det är olika antigenvarianter i rören kan man då ha samma cutoff? Varför har man inte angivit ett gränsvärdesintervall när metoden är så beroende av rätt handhavande och CVt är >10 %. I en svensk studie omfattande 4000 prov blev 50% av proverna från patienter med resultat i intervallet 0,20 < 1,0 IU/mL negativa (< 0,20 IU/mL) när ett uppföljande prov undersöktes. 12