[ E][ S] Användning av bindningsenergi mellan E och S för katalys

Transkript

1 Användning av bindningsenergi mellan E och S för atalys Reation S P utan enzym ΔG S S (pos) = ativeringsenergin för S S ΔG 0 (neg) = Sillnad i Gibbs energi mellan S och P S ΔG S S Reation S P med enzym ΔG (pos) Ativeringsenergi för. Består av den energi som går åt för att bilda eller lyva bindningar från ΔG s (neg) Består av den energi som frigörs då bindningar bryts och formas från G ΔG Reationsoordinat ΔG s E+P ΔG 0 (ativeringsenergin för ) = ΔG + ΔG s Bindningsenergin ΔG s säner ativeringsenergin = [ ] Lågt värde på - mer bindningsenergi frigörs - högt värde på ΔG s lägre värde på ΔG s produt ΔG

2 Från steady state approximationen gäller: = [ ] + [ ] 1 1 dp/dt = v = [ ] ν / = + 1 = [ ] [ ] 1 ν = = [ ] = Visar att reationshastigheten är relaterat till fritt enzyme [E] / är en andra ordningens hastighetsonstant för fritt E som reagerar med S för att bilda en produt i.e. S / G ΔG ΔG S S ΔG s E+P ΔG 0 Reationsoordinat

3 S 1. Härled evation 12.4 och förlara de olia stegen ΔG S S Från transition state theory gäller: G ΔG 1 = T h e G RT 1 = Första ordningens hastighetsonstant för S S Byt ut 1 mot / samt ΔG mot Reationsoordinat ΔG s E+P ΔG 0 = T h e G RT T Ersätt med ΔG + ΔG s = T h e G G RT S Naturliga logaritmen: ln = ln T h e G G RT S RT ln = RT ln T h G G S Bindningsenergin (ΔG s ) säner ativeringsenergin för /

4 Energidiagram för ett system där [S] > Om ett substrat modifieras ΔG 2. Vad blir den atalytisa onsevensen vid G a) en uniform energy binding effet: Stabilisering av och Reationsoordinat b) när enzymet endast är omplementärt till ursprungssubstratet: Stabilisering av c) när enzymet endast är omplementärt till substratet i TS: Stabilisering av Disutera hur och samt / påveras i de olia fallen. a) Stabilisering av och energin säns energin säns [] öar minsar minsar / öar ΔG påveras ej påveras ej v påveras ej a) odifiering av substratet ger ingen atalytis påveran! b) Endast stabilisering av energin säns energin påveras ej [] öar minsar påveras ej / påveras ej ΔG öar minsar v minsar b) odifiering av substratet ger en atalytis nacdel! c) Endast stabilisering av energin påveras ej energin säns [] påveras ej påveras ej minsar / öar ΔG minsar öar v öar c) odifiering av substratet ger en atalytis fördel!

5 Energidiagram för ett system där [S] < Om ett substrat modifieras ΔG 3. Vad blir den atalytisa onsevensen vid G a) en uniform energy binding effet: Stabilisering av och b) när enzymet endast är omplementärt till ursprungssubstratet: Stabilisering av Reationsoordinat c) när enzymet endast är omplementärt till substratet i TS: Stabilisering av Disutera hur och samt / påveras i de olia fallen. a) Stabilisering av och energin säns energin säns ΔG förändras ej förändras ej [] öar minsar minsar / öar v öar a) odifiering av substratet ger en atalytis fördel! b) Endast stabilisering av energin säns energin påveras ej ΔG öar minsar [] öar minsar påveras ej / påveras ej v påveras ej b) odifiering av substratet ger ingen atalytis påveran! c) Endast stabilisering av energin påveras ej energin säns ΔG minsar öar [] påveras ej påveras ej minsar / öar v öar c) odifiering av substratet ger en atalytis fördel!

6 Visa i graf hur urvan för reationshastigheten vid olia [S] förändras vid situationen a), b) samt c). v [S] < v= / [E] 0 [S] [E] 0 [E] [S] >> v= [E] 0 Stabilisering av Stabilisering av och Stabilisering av [S] Enzymer behöver inte vara lia specifia vid [S] < (låga substratoncentrationer) då stabilisering av både och eller bara stabilisering av leder till en öning av reationshastigheten. Vid höga [S] leder endast stabilisering av till en öad hastighet och en minsning i hastigheten får om bara stabiliseras

7 ΔG b = ΔG s i slide 1! 4. Förlara mha Figure 12.4 hur värdet på / (uttryc i energitermer) siljer sig mellan en situation där enzymet är omplementärt till ursprungssubstratet och en situation där enzymet är omplementärt till substratet i TS G ΔG 0 ΔG R G 0: (pos) - ativeringsenergi vid formation och brytning av bindningar från G b : (neg) - maximal bindningsenergi som an realiseras från (vi maxar inbindningen av S till E) GG R : (pos) Sillnaden i energi mellan en mindre gynnsam inbindning av E till S () och maximal inbindning av E till S (). ΔG b ΔG R Reationsoordinat G R : (pos) - Sillnaden i energi mellan en mindre gynnsam inbindning av E till S ( ) och en maximal inbindning av E till S ( ). E omplementärt till S (maximal bindingsenergi realiseras i ) Ativeringsenergin för / = G T = G 0 + G b + G R E omplementärt till S (maximal bindingsenergi realisears i ) Ativeringsenergin för / = G T = G 0 - G R + G b + G R

8 aximal bindningsenergi inträffar när varje bindande grupp på substratet matchas av ett bindningsställe på enzymet ax i eller ax i G R = G R G ΔG 0 ΔG R ΔG b ΔG R Då fås: G T - G T = G R Reationsoordinat - T G T = RT = G T G G T T T RT RT RT h e - - e = e e h e RT G R / är högre med fatorn e RT G R när enzymet är omplementärt till S jmf med S Då enzymet är omplementärt till S erhålls maximalt värde på /

9 Experimentella bevis för att bindningsenergi utnyttjas för bättre passning i TS 5. Disutera jämförande exempel ur Tabell 12.1 hur bindningsenergi an utnyttjas för att öa / Hydrolys av peptidbindning med ymotrypsin Enzymet ymotrypsin har ett antal olia bindningsficor(s). lyvning av peptiden ser mellan S 1 och S 1

10 G ΔG Ac-Tyr-NH 2 =32m = 0.17 s -1 / = 5 s -1-1 ΔGs G ΔG Ac-Tyr-Gly-NH 2 =23m = 0.64 s -1 / = 28 s -1-1 ΔGs Ac-Tyr-Ala-NH 2 =17m = 7.5 s -1 / = 440 s -1-1 G ΔG ΔGs Reationsoordinat Då större grupper ocuperar sätet för lämnande gruppen (NH 2 Gly Ala) används inte bindningsenergin för att minsa men istället för att öa öar /.

11 Bättre med star bindning till TS och svag bindning till S för att uppnå max hastighet Då enzymet är omplementärt till S # erhålls maximalt värde på / en detta är inte ett tillräcligt riterium för maximering av den övergripande reationshastigheten. Tabell 12.3 visar att om / hålls onstant vid onstant [S] så erhålls maximala reationshastigheten då >> [S] i.e. vid en svag inbindning mellan E & S [S] ( -1 ) (10-3 ) / (s -1-1 ) (10 6 ) Vid steady state ν = v = 10 3 [E] fri Beror på v = 1 [E] fri = 10-3 vid = 10-6 v = 999 [E] fri 1 vid = 1 Högre värde på större tillgång till fritt E högre reationshastighet!

12 7. Förlara och disutera fördelen av ett högt värde på (vid onstant / ) med a) grafis illustrering och b) ichaelis-enten evationen. Grafis illustrering! ΔG Två fall av där enzyminbindning till TS är lia bra och [S] är onstant! a) Energinivån för är lägre än for E + S [] > [E] Ativeringsenergin för reationen = ΔG = + ΔG b (ativeringsenergin för ). = [ ] ΔG b Ju lägre värde på desto högre värde på ΔG b högre värde på ΔG reationen går långsammare. b) Energinivån för är högre än for E + S [] < [E] = Högt värde på leder till att ativeringsenergin för reationen blir lägre och = (ativeringsenergin för / ). [ ] Högt leder till att -omplexet tar ett steg upp på den termodynamisa stegen. Ativeringsenergin blir endast jämfört med + ΔG b vid lågt där -omplexet befinner sig i en termodynamis säna!

13 [ ] evationen! Från steady state: ν = Vid onstant [S]: = [E] maximeras av ett högt värde på - hög [E] innebär att [E] >> [] Visar att reationshastigheten är relaterat till fritt enzym [E] För optimal atalys så finns ett tryc att öa vilet i sin tur leder till ett högre värde på När = [S] ν = [ ] ; Då = [S] Då = 5[S] [ E ][ S ] [ ] = [S] [E] = []; [E] 0 = [E] + [] =2[E]; [E] = [E] 0 /2 ν = [ E ] 2 0 = ν max 2 i.e. hastigheten är 50 % av max [ E ] [ E] [ ] 5 = 5[S] = 5; vi har 5 ggr mer E än dvs [] = [E] 0 = [E] + [] = [E] + [E]/5 [E] 0 = 5/5[E] + [E]/5 = 6/5[E]; [E] = 5/6 [E] 0 = 83% [E] 0 i.e. 83 % av enzymet är i fri form så hastigheten blir 83 % av den max hastigheten. Det finns en gräns för hur mt an öa och slutligen nås en punt då en öning av leder till en försvagning i inbindningen till TS.

14 Experimentella observationer av s Den bindningsenergi som sulle unna förverligas mellan E + S är potentiellt hög men trots detta är observerade -värden oftast relativt höga. Exempelvis NAD + : 2 ribosenheter, 1 adeninenhet, 1 Niotinamidenhet och 1 pyrofosfatlin Om all möjlig bidningsenergi sulle realiseras när NAD + bindet till E så sulle s = i.e. E + NAD + E NAD + /bcmb8010/structure.html + [ E][ NAD ] + [ E NAD ] en i många fall ligger s och s för E + NAD + = 0.1-1m (E = dehydrogenaser) = Histogram över för olia enzymer i glyolysen (i förhållande till [S]) s tenderar att ligga mellan ggr över [S]

15 8. Vad innebär det att ett enzym är perfect evolved! A + B C ν = [ A][ B] Reationen är snabbast då = diffusionsonstanten för A och B 1-1 E + P ν = Då / = diffusionsonstanten för så fås högsta möjliga hastighet för reationen. Hastighetsonstanten för diffusionsontrollerad ollision mellan E & S är ca s -1-1 ν = För ett optimerat enzym gäller! Värdet på / maximerats av att enzymet är omplementärt till TS [E] maximerats av ett högt värde på vilet innebär god tillgång på fritt E (i.e >> [S] [E] >> [] ) Ett optimalt enzym sall ha ett / i området s -1-1 och ett som är större än [S]

16 För en termodynamis ofördelatig reation En termodynamis ofördelatig reation P S an inte vara diffusionsontrollerad eftersom / för den omvända och fördelatiga reationen S P ( / ) s då bli större än den diffusionsontrollerade gränsen för att balansera Haldane ev ( eq > 1) P S P = S eq Briggs-Haldane inetien gäller för optimerade enzymer I ineti görs antagandet att < < -1 men detta antagandet an inte göras för ett optimerat enzym som maxat hastigheten I Briggs-Haldane inetien görs inga antaganden så här gäller > ( + 1) s 1 > 1 1 Ju mer ett enzym avancerar mot maximal hastighet desto mer gäller Briggs Haldane inetien

17 Briggs-Haldane inetien 1-1 E + P Då >> -1 = v 1 ν = Hastigheten på reationen är diffusionsontrollerad Då 1 är större eller lia med diffusionsonstanten för ( s -1-1 ) reationshastigheten begränsas enbart av diffusionen mellan E o S 1 Då << -1 ( meanism) v = 1 Jämvitsonstanten Hastigheten på reationen är reationsontrollerad

18 oleylär meanism för användning av bindningsenergi Vi har disuterat att det är en atalytis fördel med TS omplementaritet samt högt Enzymer an använda induced fit eller induced strain för att uppnå detta! Induced fit: E är omplementärt till TS endast efter inbindning av S öar genom den bindningsenergi som rävs för att modulera E När ett substrat binder till ativa ytan används bindningsrafterna mellan E och S för att drive E mot en mindre energigynnsam onformation som är atalytis ativ ( ). Induced strain: E är omplementärt till TS även utan inbindning av S öar genom den bindningsenergi som rävs för att binda in S När S binder in måste enzymet genomgå en onformationsförändring som ostar energi därför finns en drivande raft i att återgå till den mest energigynnsamma onformationen och med detta följs en modulering av substratet mot TS

19 6. Redogör för varför och hur man an tillvera atalytisa antiroppar Antiroppar är proteiner som produceras av immmunförsvaret och som an binda till en antigen Ett enzym an ses som en antiropp som specifit an binda in till TS i en reation an vill få fram en antiropp som an atalysera och därmed påsynda en viss reation atalytisa antiroppar (s abzymer) har onstruerats till att binda till TS analoger, genom att immunisera med TS analoger an har inte unnat öa reationshastigheter med abzymer med samma fator som ett naturligt enzym Hastigheten har unnat öas med (10 6 ) ggr med abzymer att jämföra med enzymer som an ge ggr högre hastighet En öning av reationshastigheten med är ändå en raftig öning jmf med ice atalyserad reation och abzymet är väldigt specifit och ger färre biproduter jmf med spontana reationer

20 Varför är abzymer inte lia effetiva som enzymer? TS analogen måste vara stabil och lina TS både struturellt och emist men eftersom det är en analog så binder den inte lia start som det verliga TS tillståndet. Immunsystem är ett ombinatorist system ger moleyler med bäst inbindning till TS analogen seleterat från en stor massa. Sillnad på bindande grupper och atalytisa grupper - Ibland är inbindningen den atalytisa effeten men oftast använder enzymet en eller flera specifia atalyseringsstrategier så som allmän syra/bas atalys och ovalent atalys mm. I de allra flesta fall hittas inga atalytisa grupper i abzymet Bindningsytorna är rat ut mot lösningen - svårt sapa omgivning för en atalytis miljö som finns i enzymer Enzymer är mt sofistierade atalysatorer som ofta utnyttjar bindningsenergi på subställen som ligger långt ifrån stället där reationen ser och då använder aminosyror som är vida spridda runt den ativa ytan och ibland används induce-fit eller induced strain processen - därför är det svårt att härma den ombinerade effeten av enzymernas samtliga trics

21 Tillämpning av atalysisa antiroppar för behandling av oainmissbru oain är en alaloid som finns i bladen hos oabusen (Erythroxylon coca) oain blocerar återupptaget av dopamin, serotonin och noradrenalin från hjärnans synapser vilet tillfälligt ger en öad tillfredsställelse Upprepad användning leder till toxisa effeter t ex hjärtproblem och psyisa störningar Ett flertal olia receptorer påveras av oain därför är det svårt att blocera effeten av oain genom att förhindra dess påveran på en specifi receptor (det finns ju flera) En sätt att motvera oainets effet är att tillvera atalytisa antiroppar som an hydrolysera oainmoleylen innan den passerar från blodet till hjärnan Deng et al 2002

22 Syntetisera en fostat-mono-ester transitions state analog (TSA) Eftersom små moleyler inte ger någon immunrespons opplades fritt TSA till ett bärarprotein och för detta ändamål onstruerades 3 olia TSA (TSA-1, TSA-2 samt TSA-3) där en liner sitter på tre olia ställen i moleylen. I änden på varje liner oppas ett bärarprotein. inetisa parametrar för den bäst atalytisa antiroppen 15A10 = 220 μ, = 2.3 min -1 In vivo studier De Prada et al 2006 Blocera toxis effet på blodärl hos möss som injicerats med oain Reducera dödlighet hos råttor som injicerats med oain