Enzymkinetik. - En minskning i reaktantkoncentrationen per tidsenhet (v = - A/ t)

Transkript

1 Enzymkinetik Hastigheten för en reaktion A P kan uttryckas som: - En minskning i reaktantkoncentrationen per tidsenhet ( - A/ t - En ökning i produktkoncentrationen per tidsenhet ( P/ t Detta innebär att reaktionshastigheten är direkt proportionell mot [A] och [P] i.e. -k[a]; k[p] där kär hastighetskonstanten Om i kan detektera hur mycket A som försinner öer tid eller hur mycket P som bildas öer tid (t ex med en spektrofotometerom A och P absorberar ljus id olika åglängder så kan i beräkna k A loga P logp -k k tid tid tid tid

2 Enzymkatalyserad reaktion Varför går en enzymkatalyserad reaktion snabbare än en icke katalyserad reaktion? Reaktionen S P (exoterm G Gibbsfria energi G TS ΔG Utan katalys G aktieringsenergi för reaktionen Bestämmer hastigheten S ΔG ed katalys P ΔG för reaktionen Reaktionskoordinat Enzymet bidrar med katalytiska grupper (olika aminosyror och andra små molekyler/joner. I enzymet hålls substratet hålls rätt orienterad och i närheten a de katalytiska grupperna. När enzymet binder till substratet uppstår gynnsamma interaktioner som stabiliserar TS sänkning a ΔG # ökning a reaktionshastigheten

3 Enzymkatalyserad reaktion Hastigheten för en enzymkatalyserad reaktion S Pär beroende på [S] När [S] är tillräckligt högt nås en gräns för hastigheten i detta läge arbetar enzymet med sin imala hastighet ( så fort ett S omandlas till P så står nästa S och äntar!! är beroende a [S] är oberoende a [S]

4 Enzymkatalyserad reaktion Reaktionsformeln för en enzymkatalyserad reaktion: E + S k k - k 2 E + P Föreslagen 93 a Leonorichaelisand aud menten E binder till S och bildar med hastighetskonstanten k kan antingen dissociera till E + S med hastighetskonstanten k - eller så omandlas S till P och fritt E återbildas med hastighetskonstanten k 2 Reaktionen E + P är i det här fallet försumbart i.e. k -2 0 k -2 Hastigheten för reaktionen hastigheten armed P bildas ( k 2 [] Hur kan man beräkna hastigheten för oanstående enzymkatalyserande reaktion?

5 Enzymkatalyserad reaktion E + S k k - k 2 E + P Anänd steady state approximationen för att konstruera en ekation som ger hastigheten ed steadystate approximationen så antar man att [] är konstant öer en iss tid i.e. Grafen isar hur koncentrationen a P, S, och E (fritt enzym förändras öer tid.. Vi blandar E med S som ger 2. ängden fritt enzym E minskar snabbt i början i samband med att E binder in till S och ger 3. S omandlas till P 4. [S] minskar öer tid 5. [P] ökar öer tid oncentration E 0 ätområde [S] >> [E] E Tid P S [ ] d dt Under en iss tid i början på reaktionen kommer [] att ara oförändrad eftersom E binder in till S och bildar i ungefär samma takt som omandlas till E och P 0

6 Enzymkatalyserad reaktion E + S k k - k 2 E + P k [ E][ S] k [ ] [ ] k 2 den hastighet armed bildas då E binder till S den hastighet armed dissocierar till E + S den hastighet armed dissocierar till E + P (i.e. hastigheten armed P bildas ed steadystate approximationen gäller d [ ] dt [ E][ S] k [ ] + k [ ] 0 k 2

7 Enzymkatalyserad reaktion Härledning a ekationen för reaktionshastigheten ( k 2 [] E + S k k - k 2 E + P [ ] d dt [ E][ S] k [ ] + k [ ] 0 k 2 [ E][ S] k + k [ ] k ( 2 [ E][ S] [ ] k + k2 kallas för ichaeliskonstant och speglar interaktionen k mellan E och S; lågt ärde på innebär HÖGT[]! [ E] [ E] [ ] Antag att E är fritt eller bundet till S ; E är lika med obundet enzym Vi kan ersätta E med och då fås att tot ( [ E] tot [ ] [ E] tot [ ] [ S] [ ] ultiplicera in S och byt sida på ger : [ ] [ E] [ S] [ ][ S] tot

8 Enzymkatalyserad reaktion Härledning a ekationen för reaktionshastigheten ( k 2 [] E + S k k - k 2 E + P [ ] [ E] [ S] [ ][ S] kan skrias som [ E] [ S] [ ] [ ][ S] tot tot + [ E ] [ S ] ( + [ S ] [ ] [ ] Bryt ut [] ger: ilket kan skrias om som tot + [ E ] tot [ S ] ( + [ S] Hastigheten för reaktionen k 2 []; byt ut [] mot /k 2 ger k 2 [ E] tot[ S] ( + [ S] ultiplicera upp k 2 ger k [ E] tot [ S] ( + [ S] Vi har fått en ekation för 2 hastigheten som kallas för ichaelis-enten ekationen

9 Enzymkatalyserad reaktion k [ E] tot[ S] ( + [ S] E + S k k - k 2 E + P 2 Om i plottar en graf med mot S Ju högre [S] desto snabbare går reaktionen Vid tillräcklig hög [S] ([S] >> nås imal hastighet ( då gäller: Vid låga [S] ([S] << gäller: Om [S] gäller: ν k 2 ν [ E] tot[ S] 2[ S] k2 k 2 [ E] tot [ E] [ S] k tot [ E] 2 tot 2 2

10 Enzymkatalyserad reaktion E + S k k - k 2 k [ E] tot[ S] E + P ( 2 [ S] an äen skrias som: + [ S] ( [ S] + Gör om ekationen enligt Lineweaer-Burkeför att bestämma och ( + [ S] Inentering a ekationen ger: som kan skrias om: [ S ] [ S] + [ S] [ S] + [ S]

11 Enzymkatalyserad reaktion Lineweaer-Burkeför att bestämma och E + S k k - k 2 E + P + Jämför med: y kx + l [ S] y k x [ S] l Lutningen på linjen Vid skärning med y-axenär X 0 då fås: Vid skärning med x-axenär y 0 då fås: [ ] Vilket kan skrias som: S [ S ]

12 Enzymkatalyserad reaktion E + S k k - k 2 k2[ E] tot[ S] E + P ( + [ S] [ S] ( + [ S] ichaeliskonstanten med enheten ( motsarar den [S] som kräs för att reaktionen skall ske med hastigheten : 2 [ S] ( [ S] + Dsom så fås att: 2 [ S] 2[ S] + ilket innebär att: [S] /2 [S]

13 E + S k k - k k 2 Enzymkatalyserad reaktion E + P Från steady state approximationen gäller: [ E][ S] k + k [ ] k cat ( + k k 2 [ E][ S] [ ] Om k 2 << k - ds dissocierar till E + S mycket fortare an ad omandlas till E+P så gäller: k k [ E][ S] [ ] är dissociationskonstantenför HögaffinitetmellanE + S lågt ärde på Låg affinitet mellan E + S högt ärde på ichaeliskonstanten med enheten ( d [ ] dt [ E][ S] k [ ] + k [ ] 0 k 2 Om ett enzym har tå olika substrat Substrat S S2 Substrat 2 [S] Substrat binder bättre än substrat 2

14 Enzymkatalyserad reaktion E + S k k - k 2 k2[ E] tot[ S] E + P ( + [ S] [ S] ( + [ S] k 2 [E] tot V är den imala hastighet som en iss enzymkatalyserad reaktion kan uppnå. Uppnås när enzymet är mättat på substrat! k 2 kallas äen för k cat och är antalet mol substrat som bildar produkt per mol enzym och per tidsenhet (enhet s - k cat Beskrier enzymets effektiitet! [ E] tot Om uttrycks i enheten (mol/tidsenhetså måste enzymet uttryckas i mol Om uttrycks i enheten (/tidsenhetså måste enzymet uttryckas i Enheten för k cat är alltid tidsenhet - (ofta s -

15 Inhibering a enzymkatalyserade reaktioner INHIBITOR: Ämne som interfererar med ett enzyms enzymatiska aktiitet och minskar reaktionens hastighet. TVÅ TYPER: Reersibla enzymaktiiteten kan återfås Irreersibla enzymaktiiteten kan inte återfås! Olika typer a reersibla inhibitorer: ompetiti inhibitor: - Liknar substratet -Binder till aktia ytan Nonkompetiti inhibitor: - Binder till annan del a enzymet konformationsförändring id aktia ytan Unkompetitiunhibitor: -Binder bara till E då det bundit till S (berörs inte på denna kurs

16 Inhibering a enzymkatalyserade reaktioner

17 ompetiti inhibitor I E+S +I EI k cat E + P Det somobsereras I [ E][ I ] [ EI ] app ( ökarmed faktorn [ I ] ( + I Ju lägre ärde på I desto bättre inhibitor (och k cat påerkas inte då tillräckligt hög [S] konkurerar ut inhibitorn! app app

18 I E+S +I EI +I I +S k cat Nonkompetiti inhibitor app ( E + P Det somobsereras äroförändrat(gällerom I I I app Det som obsereras ( [ I minskarmed faktorn ( ] + eftersom inhibitorn inte kan konkureras ut a S I app app

19 Inhibering a enzymkatalyserade reaktioner E + S k k - k 2 E + P + [ S] ompetitiinhibitor : [ I] + + I [ S ] Nonkompetiti inhibitor: [ ] [ I] [ I] I S I

20 Öningsexempel Sphingosin--fosfat (SPP är en iktigt för cellöerlenad. SPP bildas från sphingosinoch ATP i en i en reaktion som katalyseras a ett kinas. Hastigheten för den enzymkatalyserade reaktionen mättes i frånaro respektie näraro a threo-sphingosin, en stereoisomer a sphingosin, som inhiberar enzymet [sphingosin](μ Hastighet i frånaro a inhibitor(mg/min Hastighet i näraro a inhibitor (mg/min Vad är respektie för enzymet? Vilken typ a inhibitor är threo-sphingosin(utöer grafen finns det något som ytterligare stödjer detta? Vad blir I om [threo-sphingosin] är 2m

21 Öningsexempel + Plotta mot [ S] [ S] Bestäm ekationen för den räta linjen I excel eller manuellt [ S] (min/g ( - (min/g (min/g 00 y x Utan inhibitor ed inhibitor Linear (Utan inhibitor Linear (ed inhibitor y 6E-05x ( - [ S] Grafen indikerar att i har en kompetiti inhibitor

22 Öningsexempel + Jämför med: y kx + l [ S] y k x [ S] l Beräkna utan inhibitor: Linjens ekation y 6*0-5 x g/min 00 mg/min Beräkna med inhibitor: Linjens ekation y 3*0-4 x g/min 00 mg/min Samma storleksordning är samma med och utan inhibitor

23 Öningsexempel + Jämför med: y kx + l [ S] y k x [ S] l Beräkna utan inhibitor: Linjens ekation y 6*0-5 x+ 8.06; 6*0-5 6*0-5 * * μ Beräkna med inhibitor: Linjens ekation y 3*0-4 x *0-4 3*0-4 * *0-5 28μ är 4 ggr större med inhibitor än utan inhibitor

24 Öningsexempel är oförändrad ökar med inhibitor ompetiti inhibitor Threosphingosinär en stereomera sphingosin molekylerna liknar arandra borde därför kunna binda till aktia ytan ompetiti inhibering Beräkning a I id [threo-sphingosin] 2 m ( [ ] app I Det somobsereras ökarmed faktorn + i.e. + app [ I ] I app [ I ] I ( I I app + [ I ] app ( [ I ] I m I (