Protein prediktion, homologi och protein engineering

Transkript

1 Protein prediktion, homologi och protein engineering

2 Alignment

3 Alignment D-E-A-L-V-S-V-A-F-T-S-I-V-G-G D-E-A F-T-S-I-V-G-G D-E-A-F-T-S-I-V-G-G-M-D-D-P-G

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16 Prediktion Prediktion av tertiärstruktur kräver kunskap om sekundärstrukturen Många olika sekvenser samma 3D struktur Prediktion av 3D strukturen från aminosyrasekvens ett (ännu!) olöst problem

17 Förutsäga 3D strukturen (CASP, Critical assessment of structure prediction, blindtester för utveckling av metoder) Inverse folding Vilka veckningssekvenser är kompatibla med känd veckningsstruktur (fold) Threading Vilka kända folds är kompatibla med specifik sekvens t.ex Eisenbergs metod

18 Eisenbergs metod Bygger på att man har ett bibliotek med kända 3D strukturer med olika folds Strukturerna karakteriseras på följande sätt: Area av sidokedja som göms av andra proteiner Andel (fraction) som göms av polära atomer Sekundärstruktur Indelas i sex olika klasser och totalt 18 olika klasser. Varje aa har olika poäng för dessa 18 klasser Normering av 3D info till 1D info

19

20

21 Design av Zink finger Modellstruktur Zink finger design

22 Paracelsus Challenge Pristävling instiftad 1994 Ändra protein fold men bibehålla 50% av sekvenshomologin. Tidigare ansett att mer än 30% sekvenshomologi medför att man har samma fold

23 Paracelsus Challenge Domän B1 från protein G 56 aa Dimer av Rop, 63 aa

24

25 Prediktion av loop strukturer

26 Reducera scaffold storlek Protein A Z-domäN reduceras i storlek från 59 till 33 aminosyror Agonister till epo receptor reducerades från 160 till 20 aa, ingen känd sekvenshomologi Slutsats: Många lösningar på problemet

27 Konstruktion av trunkerad Z-domän

28 Agonist till epo receptor, EMP1 dimer

29 Bindning av EMP1 till epo receptor

30 Varför stabilisera proteiner? Förhindra enzymer från nedbrytning Förhindra uppveckning i närvaro av detergent Öka termostabiliteten

31 Exempel på stabiliserade proteiner Enzymer i bakning Enzymer i tvättmedel

32 Riktad mutagenes

33 Vad menas med ett proteins stabilitet? Uppveckat protein Veckat protein

34

35 Hur mäter man protein stabiliteten? T m eller C m

36 Faktorer som påverkar den nativa strukturen Termodynamisk förklaring G = Η Τ Τ S G = - RT ln K K = [veckat protein] / [ uppveckat protein] För stabilisering krävs: H blir mindre eller S större

37 Strategier för att förändra proteinstabiliten Riktad mutagenes (rationell design) Slumpartad mutagenes (random design)

38 Modellproteiner T4 Lysozym Cold-shock protein

39 Ett av de mest välstuderade proteinerna om protein stabilitet T4 Lysozym Över 2000 mutanter och 400 kristallstrukturer Erhållit klara samband mellan struktur och funktion (stabilitet)

40 T4 Lysozym Förbättra helixpropensitet, t.ex mutant V131A Minska entropin i det uppveckade tillståndet, t.ex mutant A82P Optimera hydrofobinteraktion t.ex mutant I3L Stabilisering av positiva laddningar i helix, t.ex mutant S38D

41 Design av disulfidbrygga

42

43 Stabilisering av helix dipol

44 Design av stabilt protein Jämförelse mellan protein från mesofil och termofil organism Bs-Csp mesofil Bc-Csp termofil

45 Hur stabilisera mesofila Bs-Csp? Bs-Csp, mesofil, Tm=53.6 Bc-Csp, termofil, Tm= MLEGKVKWFNSEKGFGFIEVEGQDDVFVHFSAIQGEGFKTLEEGQAVSFEIVEGNRGPQAANVTKEA MQRGKVKWFNNEKGYGFIEVEGGSDVFVHFTAIQGEGFKTLEEGQEVSFEIVQGNRGPQAANVVK-L Ref: D.Perl & F.X Schmid, J.Mol.Biol. (2001), 313,

46 Resultat av rationell design E66L E3R Ref: D.Perl & F.X Schmid, J.Mol.Biol. (2001), 313,

47 Slumpartad design Förändra genen helt slumpartat Leta efter den gen som ger ett protein med hög stabilitet Selektionsproblem

48

49 DNA shuffling

50 Modelling av Cephalosporinase

51 (Error-prone) PCR C C C

52 Fagdisplay teknik Varianterna klonas in i virusvektor Genen uttrycks som fusionsprotein på ytan av viruset Selektera efter bindningsegenskaper vid olika [denaturant] Direkt koppling genotyp-fenotyp Ref: Introduction to protein structure, Bränden & Tooze

53 Fagdisplay av Kunitz domän

54

55 Fag display Cold shock protein Startsekvens Bs-Csp MLEGKVKWFNSEKGFGFIEVEGQDDVFVHFSAIQGEGFKTLEEGQAVSFEIVEGNRGPQAANVTKEA Mutera till alla 20 olika aminosyrorna i 6 positioner som skiljer, selektera fram den stabilaste varianten

56 Resultat av fag display Selekterad variant, Tm 82,2 0 C MRVGKVKWFNSEKGFGFIEVEGQDDVFVHFSAIQGEGFKTLEEGQLVSFEIVEGNRGPQAANVRKVG LG A T EA Jämför med Bc-Csp, Tm 76,9 0 C, Alla 6 positionerna skiljer sig åt MQRGKVKWFNNEKGYGFIEVEGGSDVFVHFTAIQGEGFKTLEEGQEVSFEIVQGNRGPQAANVVK-L Tm-Csp, Tm 82,0 0 C, 5 av 6 positioner skiljer sig åt MRGKVKWFDSKKGYGFITKDEGGDVFVHWSAIEMEGFKTLKEGQVVEFEIQEGKKGPQAAHVKVVE Slutsats: Proteiner kan stabiliseras med många olika kombinationer av mutationer

57