Maria Nyström Jessica Leander Louise Danielsson. G-proteinet Ras. 3 juni Handledare: Hans Eklund

Transkript

1 Maria Nyström Jessica Leander Louise Danielsson G-proteinet Ras 3 juni 2003 Handledare: Hans Eklund

2 Inledning Detta projektarbete behandlar en del av den signalväg som initieras av tillväxthormon och avslutas av celltillväxt. Vad som här tas upp är det intracellulära samspelet mellan den nukleotida utbytesfaktorn SOS och det lilla G-proteinet Ras samt deras struktur och mechanism. G-proteiner är i vanliga fall trimerer. Ras tillhör en liten grupp av G- proteiner som består enbart av en domän men ändå har samma aktiva yta. SOS binder till Grb-2 vilket i sin tur binder till den fosforylerande receptorn. I denna position påverkar SOS Ras till att hydrolysra GTP vilket i sin tur leder vidare till celltillväxt. G-protein. G-protein binder guanin- nukleotider och fungerar som en molekylär växlare. G- proteinet aktiveras genom att binda GTP och inaktiveras då GTP är hydrolyserat till GDP. Hydrolysen av GTP katalyseras genom G-proteinet själv, men G-protein är väldigt långsamma GTPaser, och avstängningen av G-proteinet accelereras normalt med hjälp av molekyler vid namn RGS (regulators of GTP hydrolysis) RGS binder till det aktiva G-proteinet och ökar hastigheten på GTP- hydrolysen. Väl i det aktiva GTP- bindningsstadiet kan G-proteinet aktivera många effektorer som förstärker signalen innan RGS binder och signalen stängs av. De flesta G-protein är heterotrimera och består av en _- enhet (45kDa), en _- enhet (35kDa) och en _- enhet (8kDa). _- enheten är den enhet som innehåller GTPas- aktiviteten. b-enheten har en sjubladig propellerstruktur och g-enheten består av ett par a-helixar som omsluter b-enheten. Då G-proteinet är aktiverat, genom att binda GTP, dissocierar heterotrimeren till en _- subenhet och en heterodimer. Både _-subenheten och heterodimer kan oberoende av varandra överföra signaler från receptorn till olika effektorproteiner. Adenylat cyklas enzymet som aktiveras av epineprine- _-adrenergic receptorkomplexet är ett membranprotein som innehåller 12 helixar som antas gå igenom hela membranet. Den aktiva enzymdelen av proteinet är formad från två stora intracellulära domäner. En sitter mellan transmembranhelix 6 och 7 och den andra sitter efter den sista transmembranhelixen. G-protein binder till adenylat cyklas genom ytan som bundit dimeren då G-proteinet var i sin GDP form. Aktiveringen av G-proteinet exponeras denna yta och ändrar den hårfint så att den nu binder till ytan av adenylat cyklase med företräde för G. Förmågan att avbryta signaltransduktionen är minst lika svårt som att starta den.

3 Mekanism G-protein är membranproteiner som i ostimulerat tillstånd binder GDP, guanosin difosfat. I en hormonrespons som leder till stimulering av adenylat cyklas så kommer bindingarna av extracellulärt hormon till den receptor (vanligtvis en beta- adrenergik receptor) orsaka en konformationsändring som stimulerar receptorn att interagera med en närliggande G s molekyl. Detta i sin tur stimulerar dissociering av bundet GDP från G s att ersättas av GTP. G s är en grupp av G-proteiner som är involverade i stimulering av adenylat cyklas. Då GTP är bundet konverterar G s till att bli ett protein som interagerar med adenylat cyklas, aktiverar målenzymet och producerar cykliskt AMP från ATP. Fortsatt aktivering beror på hur mycket bundet GTP som är närvarande. Den hormonella responsen är begränsad och kontrollerad av närvaron av långsam GTPas aktivitet på G- proteinet. G i proteinet är nära släkt med G s och fungerar på liknande sätt, men då som svar på extracellulära signaler, vars funktion är att inhibera adenylat cyklas. RAS Ras tillhör en stor familj av monomera G-protein sk små GTPaser. Dessa spelar en betydande roll när det gäller flera olika cellreaktioner, däribland stimulering av tillväxt och differentiering som i Ras fall. Precis som sina släktingar, de heterotrimera G-proteinerna, växlar de mellan att vara bundna till GDP (inaktiv) och till GTP (aktiv). De skiljer sig från heterotrimererna på så sätt att de har en molekylvikt på kda vs kda och är monomerer. _-subenheten hos G-proteinet är mycket lik Ras enda enhet, vad gäller aktiv yta m.m. Ras aktiveras av EGF-signalen via SOS*, när denna binds i den nukleotidbindande fickan och GDP släpper och ger plats åt GTP. Gaps (GTPas aktivating protein) fungerar som hjälparprotein och ser till att hydrolysaktiviteten ökar. Om Ras inte kan inaktiveras genom GTP-hydrolys leder det till ohämmad celltillväxt ( tumörer). Struktur Ras har en _/_-typ av struktur, med ett _-flak innehållande sex _-strängar, varav fem är parallella. Fem _-helixar sitter på båda sidor om _-flaket. GTP binds i en ficka vid karboxyl-änden av _-strängarna. Loopregioner binder samman _-strängarna med _-helixarna och bildar fickan. Fem av dessa totalt sex loopregioner, deltar i den GTP-bindande ytan. Tre av dessa innehåller regioner av konserverade aminosyror som också ses hos trimererna. Loop G1, den sk difosfatbindande loopen eller p-loopen, binder samman den första _- strängen med den första _-helixen och är viktig för att fosfatgruppen ska sitta rätt vid bindning.

4 Loop G2 består av en threonindel som är konserverad i både Ras och G_-proteiner, som binder magnesiumjoner, är viktig vad gäller både strukturella förändringar och GTPhydrolys. Loop G3 utgör en länk mellan de aktiva ytor som binder magnesiumjoner och _-fosfatet från GTP. Loop G4 och G5 är inblandade i identifiering och bindning av guanin basen från nukleotiden. Två regioner går igenom en stor konformationsförändring när molekylen byter från den aktiva, GTP-bundna formen till den inaktiva GDP-bundna formen. Dessa kallas switch regioner och finns i loop G2 (I) och i loop G3 och helix _2 (II). Mekanism Switch I och II ändrar läge när Ras växlar mellan inaktiv och aktiv form, som nämndes tidigare. Det som utlöser denna konformationsförändring tycks vara bildandet av vätebindningar mellan proteinet och _-fosfatet från GTP. I båda formerna är en magnesiumjon koordinerad till sex ligander i oktahedrisk form. Fyra vattenmolekyler, sidokedjans syreatom från serin (P-loop) och en syreatom från _- fosfat binder till magnesiumjonen i GDP-formen. Två av vattenmolekylerna är utbytta i GTP-formen mot en threonin från switch I och en syreatom från _-fosfatet. Strukturella förändringar i switch I - regionen induceras av vätebindningar till _-fosfatet från peptidkvävet och hydroxylgruppen på threonin, vars syre också är bundet till magnesiumjonen. Efter utbyte av GDP mot GTP, dras switch I mot _-fosfatet, samt mot magnesiumjonen, där det tar platsen för de vattenmolekyler som är bundna vid GDP-formen. Förändringar i switch II initieras av bildandet av vätebindningar mellan peptidkvävet på glycin och _-fosfatet på GTP, åtföljt av ytterligare konformationsförändringar i form av rotationer, i förhållande till den inaktiva formen.

5 Den mest troliga mekanismen när det gäller hydrolys av GTP till GDP och fosfat, är direkt överföring av _-fosfatet till vatten, utan att bilda kovalenta bindningar med proteinet. Denna mekanism kräver att GTPaser har en katalytisk bas för att kunna ta en proton från vatten, så att man får en stark nukleofil som kan attackera fosforatomen på _-fosfatet. GTP hydrolyseras inte i lösning i frånvaro av GTPas eftersom fosfatgruppen är negativt laddad liksom OH-gruppen. GTPas måste alltså reducera den negativa laddningen på fosfatet för att kunna katalysera hydrolys av GTP. En Glutamin på switch II fungerar som denna bas när dess syreatom tar emot en proton från vatten, och peptidkvävet donerar ett väte till _-fosfatet. Detta, tillsammans med arginin och threonin från switch I reducerar fosfatets negativa laddning genom att bilda vätebindningar med denna, på detta sätt stabiliseras transition state komplexet. Ras saknar dock arginin och stabiliserar därför inte TS på detta sätt, och hydrolyserar därför i en lägre hastighet. Speciella GAP proteiner accelererar denna reaktion nära på hundratusen gånger. GAP bildar ett komplex med Ras som stabiliserar på samma sätt. Gap fungerar stabiliserande genom att en guanidiumgrupp från arginin ockuperar den aktiva ytan på Ras. Gap binder till Ras på så sätt att switchregionerna låses i en struktur som stabiliserar TS hos reaktanterna. Om Ras-Gap samarbetet avbryts av någon anledning, kan det leda till ohämmad celldelning.

6 Nukleotid utbytesfaktor SOS (son of sevenless) Receptorer för tillväxtfaktorer aktiverar Ras genom att dra den nukleotida utbytes faktorn SOS till cellmembranet och därmed trigga produktionen av GTP-Ras. SOS har dessutom en site vilken befinner sig distalt från den som binder Ras, vilken binder RasGTP. Mekanism Tillväxtfaktorer, vilka signalerar med tyrosine kinaser, aktiverar Ras genom att binda SOS till plasmamembranet och därigenom underlätta för omvandlingen av RasGDP till RasGTP. Bindandet av GTP skapar konformationsförändringar hos Ras vilket gör det lättare för RasGTP att binda till effektor protein och initiera signaler genom dem. När GTP har hydrolyserats frigörs GDP från Ras mycket långsamt och utan inblandning av SOS och RasGDP binds Ras i ett inaktivt tillstånd. Humant SOS1 är ett stor multidomän protein på 1333aminosyror. En central katalytisk del på ca 500 aminosyror(sos cat ) är nödvändig för dess Ras- specifika nukleotid utbytesaktivitet. Denna del av SOS består av en central del som kallas cdc25 samt en del som kallas REM (Ras exchanger motif). SOS fungerar i korthet så att det öppnar upp och omformar den nukleotidbindande platsen på Ras och på så sätt frigör antingen GTP eller GDP bundet till Ras. Huvudragen i denna mekanism är att Switch I flyttas från den nukleotidbindande stället samt att Switch II omformas så att metylgruppen hos Ala-59 hos Ras placeras där Mg normalt sitter. Denna interaktion mellan nukleotidfria Ras och SOS sker i det område som kallas cdc25. REM domänen interagerar med cdc25 endast med en kant av en hårnålsformat helixpar som sticker ut från huvudkroppen av cdc25. Detta helixpar innehåller helixarna ah och ai, och ansvarar för att rikta Switch I hos Ras bort från nukleotidbindnigsstället. I en klyfta mellan REM domänen och ytan av cdc25 finns ytterligare ett bindningsställe vilket är distalt till den aktiva siten. Denna är specialiserad för RasGTP. Hela detta RasGTP:SOS cat :Ras komplex är sammanlänkat på ett sätt som antyder en allosterisk mekanism med vilken RasGTP stabiliserar SOS cat och stimulerar dess aktivitet. Det område hos Ras som innehåller Switch I och Switch II binder in i REM domänen av SOS. Detta omges av hydrofoba effekter. När RasGTP binder till den distala siten så vrids REM domänen gentemot cdc25 ca 10. Denna vridning sker runt basen av det hårnålsformade helixparet i cdc25 domänen på ett sådant sätt att den aktiva siten hos SOS cat i stort sett behålls oförändrad. Om inget RasGTP är bundet till SOS cat så interagerar inte det nukleotidfria Ras med REM domänen, och interaktionen mellan helixparet och Switch I regionen av Ras är svårbestämd. När RasGTP binder till detta Ras: SOS cat komplex och vridningen sker, så uppstår vätebindningar mellan Switch I hos det nukleotidfria Ras och den nya konformationen av helixparet och REM. RasGTP: SOS cat :Ras komplexet är dessutom stabilare än SOS cat :Ras. Allt detta leder till att distal RasGTP ökar aktiviteten hos

7 SOS cat genom att stabilisera komplexet som bildas mellan SOS och nukleotidfritt Ras. Ras aktiveras således av SOS vilket i sig själv påverkas genom positiv återkoppling från RasGTP, vilket ledet till en ökad katalytisk effektivitet hos SOS. detta är alltså en mekanism där aktiviteten hos katalysatorn ökar med ökande lokal koncentration av slutprodukten. Slutligen binder Ras i sin aktiverade form till andra komponenter vilket leder till aktivering av specifika serine-threonin proteinkinaser vilka fosforylerar målprotein som gynnar celltillväxt. Forskning Ett exempel på cancerforskning angående Ras från UC Berkley och Akacia Biosciences Inc där man har upptäckt att avlägsnandet av ett enzym, Rce1, vilket aktiverar Ras, leder till att Ras funktion hämmas drastiskt. Det har visat sig att det muterade Ras, som är orsaken till cancer, är mer mottaglig för avlägsnandet av Rce1 än det normala. Detta är naturligtvis mycket intressant för cancerforskningen. Referenser Berg et al: Biochemistry, 5th ed. Matthews, van Holde: Biochemistry Branden, Tooze: Introduction to protein structure, 2 nd ed. Margarit et al: Structural Evidence for Feedback Activation by RasGTP of the Ras- Specific Nucleotide Exchange Factor SOS, Cell Vol 112, 2003 Länk