Laboration: cellskada/celldöd

Transkript

1 Laboration: cellskada/celldöd Läkarprogrammet termin 3 Basgrupp 2 Therese Enenge Amanda Amanda Karlsson Erik Andersson Johansson Niklas Åkesson Ebba Gabrielson Emil Saghamre Salik Hamid

2 Inledning; Vi har under en veckas tid gjort fyra laborationer där vi undersökt proteinet p53:s betydelse och funktion för cellen. Vi har jobbat med två olika bröstcancer-cellinjer och med olika metoder testat hur cellinjerna reagerat på strålning och nutlinbehandling. I den första laborationen genomförde vi en cellcykelanalys mha flödescytometri. I den andra laborationen undersökte vi hur många celler som går i apoptos pga strålning eller nutlin. I den tredje laborationen använde vi oss av Western Blot för att undersöka förekomsten av p21. I den fjärde laborationen undersökte vi p53 genen med hjälp av mutationsanalys

3 Laboration: cellcykelanalys Introduktion: Syfte: Undersöka hur två olika cancer-cellslinjer reagerar på radioaktiv strålning (stress) samt nutlin. Detta gör vi genom en flödescytometri som ger oss information om hur mycket DNA cellerna innehåller vilket i sin tur ger oss information om vilken fas i cellcykeln våra celler befinner sig i. Teori: Celler befinner sig någonstans i den sk cellcykeln. Cellcykeln delas upp i fyra faser: M (mitos=delning), G1 (tillväxtfas), S (replikerings-fas), G2 (tillväxtfas). Det finns ett ytterligare tillstånd som cellen kan befinna sig i som heter G0 (vilofas). I G2 fasen finns det dubbelt så mycket DNA jämfört med G1 fasen. I cellcykeln finns det även check-points där man kontrollerar om cellen har allt som den behöver innan den går vidare till nästa fas. I vår undersökning har vi fokuserat på en check-point mellan G1-S (har cellen allt som den behöver för att replikera sig), och G2-M (har cellen allt som den behöver för att dela sig). Vid en skada utav vårt DNA kommer cellcykeln att stanna upp och reparera sig själv genom att aktivera DNA-reparations-protein, gå i apoptos eller nekros. Ett exempel på någonting som skadar vår arvsmassa är radioaktiv gamma-strålning som vi har använt oss utav i denna laboration. Gamma-strålning skadar både DNA:t direkt (1/3) samt via fria radikaler indirekt: H 2 O 2, O 2 -, OH - (2/3). När DNA:t blir skadat kommer ATM (ett protein-kinas) att fosforylera p53 som börjar utöva sina effekter. P53 är en transkriptionsfaktor och binder in till DNA för transkription av viktiga gener vars produkter reglerar cellcykeln och gör så att cellcykeln stannar upp i ex G1-S eller G2-M, eller går i apoptos. Pga p53:s viktiga roll i cellcykelkontroll blir det problem om cellen har mutation i denna. MDM2 är ett protein som tillverkas och degraderas konstant. Det ubiquitinerar p53 som sedan bryts ner i proteasomer, dvs gör så cellcykeln inte stannar (p53 kan inte utöva sin effekt. Nutlin hämmar MDM2, dvs gör så att p53 kan utöva sin effekt. Hypotes: Vi tror att radioaktiv strålning leder till cellcykel-stopp bland annat genom att aktivera p53. Vi tror att nutlin kommer göra så att mer p53 blir fritt och fler celler stannar upp i G1 eller G2 fasen

4 Material och metod: Cellcykelanalysen genomförs med hjälp av en flödescytometri. I förväg kommer några av cellproverna ha blivit strålade med 10 Gy och några kommer ha blivit nutlin-behandlade (Figur A). Figur A Under vår laboration tillsatte vi sedan 3 lösningar: A: Trypsin och detergent Som leder till att cellmembranet går sönder. B: Trypsin inhibitor och RNAas som inhiberar trypsin reaktionen, samt inaktiverar RNA nedbrytande enzym C: Propidium iodide som binder till DNA. Sedan förde vi in våra åtta cellprover i en flödescytometer som nu kan beräkna hur mycket DNA som finns i varje cell tack vare lösningarna vi tillsatte tidigare (PI visar hur mycket DNA som finns). Resultatet från flödescytometrin visades i en graf. (Figur 1, Figur 2) Resultat: RT= strålning. N= nutlin. Cellinje A kallas: BT474 Cellinje B kallas: MCF7 Celltyp, G1-fas G2-fas S-fas strålning, nutlin B:RT-N- 47% 18% 33% B:RT+N- 73% 28% 0% G1- arrest B:RT-N+ 25% 55% 18% G2-arrest B:RT+N+ 17% 62% 19% S-fas mindre (lägre proliferation) A:RT-N- 27% 47% 25% A:RT+N- 6% 88% 7% G2-arrest A:RT-N+ 22% 66% 11% Påverkas genom G2- arrest och lägre proliferation (S) A:RT+N+ 9% 79% 11% Påverkas genom G2- arrest och lägre proliferation (S)

5 Tolkning utav tabell; I tabellen går utläsa de olika cellprovernas fördelning i de olika cellcykelfaserna efter respektive behandling. Det går att utläsa att vår cellinje B som blivit behandlad med radioaktiv strålning har stannat i G1-arrest. Cellinje B som behandlades med nutlin har stannat av mer i G2. De i cellinje B som behandlades med Nutlin och radioaktiv strålning har en något mindre S-fas än de obehandlade. Cellinje A som behandlades med radioaktiv strlåning stannade i G2. De nutlinbehandlade med eller utan radioaktiv strålning påverkas också genom G2-arrest. Figur 1: Graf över cellcykelfördelning utav obehandlad cellinje B. Figur 2: Graf över cellcykelfördelning utav obehandlad cellinje B Diskussion: En utav cellstammarna har en mutation i p53 genen och en är vildtyp. Resultaten visar att cellinje B:RT+N- har 0% celler i S-fasen. Detta tyder på att p53 fungerar som den ska och lyckas stanna upp cellcykeln helt. Detta får oss att tro att B-cellerna är vildtyp. Detta borde innebära att cellinje A inte bör svara bra på nutlinbehandling eftersom p53 ändå inte fungerar som den ska. Dock i vårt resultat sänks S-fas celler när vi behandlar med nutlin, men vi tror att detta kan bero på det faktum att nutlin är toxiskt

6 vid höga doser. Det kan ha skadat cellen på andra sätt vilket gör att cellcykeln ändå stannar upp. Cellprovet B som blev strålad och behandlad med nutlin tycker vi borde ha stannat upp helt i cellcykeln vilket den inte gjorde. Detta kan bero på felkällor i laborationen. Felkällor: Vi kan ha pipetterat och blandat felaktigt. Nutlin kan vara toxiskt i för höga doser

7 Laboration: Apoptos Introduktion: Teori: När celler utsätts för strålning och behandling med Nutlin-3 kan det skada genomet och leda till apoptos. Viktigt för cellens skydd är proteinet p53 som inducerar apoptos. Vid strålning kan det uppstå dubbelsträngsbrott, dvs. brott i DNA helixen. Om cellen inte kan reparera skadan så induceras apoptos för att skydda organismen från större skada. Nutlin-3 verkar genom att hämma MDM2 som i sin tur hämmar p53. Nutlin-3 kan därför indirekt stimulera apoptos. DAPI som används som färgning binder till A-T par i DNA. Genom att stråla med UV-ljus kan man se kromatinet och på så sätt se om cellen genomgår apoptos eller mitos. DAPI kan binda in till DNA genom att saponin tillsätts tidigare och bildar porer i cellmembranen. Beroende på hur p53-genen fungerar kommer cellerna svara olika på strålning och Nutlin-3. Hypotes: I kontrollen bör vi inte se någon stor mängd apoptos men kan förekomma då det är cancerceller, ej friska. Vid behandling med bara Nutlin tror vi att det sker lite apoptos då p53 induceras, indirekt via inhibering av MDM2. Vid endast stålning borde vi se mer apoptos i och med att skador på DNA uppstår. Vid behandling med både strålning och nutlin borde mängden apoptos vara stor då apoptos nu induceras av två olika faktorer. Material och metod Två cellinjer av bröstcancerceller (BT474 (A) och MCF7 (B)), PBS, formaldehyd, Saponinbuffert, vectashield (DAPI), pipetter, mikroskopglas. Se Fig. A ovan Cellerna var fördelade över åtta brunna, fyra per cellinje, och två från varje cellinje var behandlade med röntgenstrålning resp. nutlin-3 enligt fig. A. Medium i brunnarna avlägsnades och cellerna tvättades två gånger med PBS. Formalin tillsattes i de tomma brunnarna och cellerna inkuberades 20 min i kylskåp, +4 C. Formalin tillsattes för att fixera cellerna. Efter inkubationen avlägsnades formalinet och cellerna tvättades två gånger med PBS. Saponin tillsattes, för att skapa permeabilitet in i celler, cellerna inkuberades ytterligare 20min men i rumstemperatur. Mikroskopsglas tvättades med etanol och en droppe Vectashield droppades på varje glas. Efter dubbel tvätt med PBS togs cellplattorna upp från brunnarna och placerades upp och ner på mikroskopsglasen. Preparaten torkades i kylskåpet, mörklagt, övernatten. Under dag 2 studerades preparaten i mikroskop med UV-ljus som visar kromatinet med hjälp av DAPI-färgningen. Genom att studera kromatinet kunde apoptos, mitos och vanliga celler studeras. Resultat: A RT- N- (kontroll) Få celler, lite mitos Fig. 1.2 A RT- N+ Få celler, lite mitos Fig. 1.3 Nutlin

8 A RT+ N- Lite mitos, mycket apoptos och apoptotiska kroppar Fig. 1.4 A RT+ N+ Lite mitos, mycket Fig. 1.5 apoptos och apoptotiska kroppar B RT- N- (kontroll) Många celler, lite mitos Fig. 1.6 B RT- N+ Färre celler, ligger mer Fig. 1.7 påverkar inte RT påverkar RT påverkar Nutlin påverkar isär B RT+ N- Mycket apoptos Fig. 1.8 RT-känsliga celler B RT+ N+ Få celler, mycket apoptos Fig. 1.9 Nutlin bara tilläggseffekt i den här cellinjen Fig. 1.2 Fig. 1.3 Fig

9 Fig. 1.5 Fig. 1.6 Fig

10 Fig. 1.8 Fig. 1.9 Diskussion: Genom att undersöka våra resultat kan vi säga att p53 inte fungerar helt normalt i cellinje A. Detta kan vi se genom att nutlin-3 inte har någon effekt. I cellinje B där p53 fungerar ökar mängden apoptos vid behandling med nutlin-3. Cellinje B reagerar som förväntat och vi kan på så sätt dra slutsatser om att dess p53-gen inte är muterad. Anledningen till att det från börjar skiljer mycket mellan cellinje A och B tror vi har med cellernas olika proliferationshastighet att göra. Cellinje B är mycket snabbare och kan vara en mer aggressiv cancer men det kan inte denna labb utvisa

11 Laboration: Western blot Introduktion Teori: p53 är en transkriptionsfaktor och tumörsupressor som bland annat verkar inhiberande på cellcykeln med hjälp av p21. p53 kan också inducera apoptos med hjälp av aktivering av pro-apoptotiska proteiner. MDM2 är en p53 hämmare. Den fosforyleras vid stress vilket gör att p53 då aktiveras och kan inducera p21 uttryck. p21 är ett cyklin-inhiberande protein som inhiberar fortskridning av cellcykeln. Den inhiberar en mängd olika cyklin-cdk komplex. Nutlin är en MDM2 inhibator. Då den inhiberar MDM2 så ökas uttrycket av p53 och indirekt p21. Hypotes: Vi tror att en av cellinjerna kommer att uppvisa mindre p21 än den andra. Detta tror vi kan bero på en form av mutation i p53-genen. De som får Nutlin bör uttrycka mer p21 dock bör p21 även uttryckas av de som får strålning. Således bör en kombination ge störst uttryck av p21. Metod & material : Metoden som användes under laborationen var Western blot. I Western blot så mäter man mängden av ett specifikt protein. Proteinerna som testades kom från två olika bröstcancerceller. De döptes till cellinje A och B. De båda cellinjerna preparerades med Nutlin - 3, strålning samt jämfördes med ett obehandlat kontrollprov. Innan preparaten erhölls preparerades de för proteinkvantifikation. Laborationen började med att förbereda inför en elektrofores. Efter den följde en transfer från gelen till ett membran. Membranet lades sedan i en blockning buffer innehållandes mjölkprotein vilket kunde fästa till de laddade proteinerna för att säkerställa att antikropparna enbart binder antigen-specifikt. Antikropparna tillsattes och inkuberades över natten i låg temparatur för att förhindra antigen-ospecifik bindning. De primära antikropparna som tillsattes var HLA-specifika antikroppar från en kanin. De sekundära antikropparna var specifika för kanin-antikroppar och konjugerade med ett specifikt enzym. Andra dagen tillsattes den sekundära antikroppen vilken var specifik för den primära antikroppen. På den sekundära antikroppen är ett enzym (horseradish peroxidas) bundet. Då substratet tillsattes så kunde horseradish peroxidas katalysera reaktion av substratet. Då uppstår kemiluminiscens och det är det som kan upptäckas av kameran. Detta inkuberades och preparerades inför exponering av CCD kamera. Resultat: Enligt våra resultat fanns inget p21 i cellinje A, oberoende vad de behandlats med. I cellinje B tyder resultatet på att p21 påverkades mest av Nutlin behandling. Man kunde även se en ökad mängd p21 i de preparat som påverkats av strålning och både strålning och Nutlin. Andra gruppers resultat påvisar att nutlin och strålning påverkade p21 mest

12 Brunnnumme r Cellinj e A Cellinj e B Stege Stege Obeha ndlad Nutlin RT Nutlin + RT Obeha ndlad Nutlin RT Nutlin + RT Stegen är inte synlig vid exponering av kameran men för blotta ögat. Diskussion: Efter diskussion med andra grupper och undersökning av vårt egna resultat så framkom det att vårt resultat troligen är felaktigt. Utifrån de sekundära banden som finns ovan resultatet av p21 så kan man se att det finns en nyansskillnad. Denna nyansskillnad ska ej finnas. Detta kan tyda på att det föreligger en ojämn laddning av protein. Det kan till exempel ha varit en luftbubbla vid inkubationen av antikropparna eller felpipettering då proteinerna tillsattes i brunnarna vilket leder till minskad mängd proteinblandning. Det kan därför bli olika starkt resultat beroende på både de primära och sekundära antikropparnas inbindning. Vår ena hypotes var att det förelåg en mutation i någon av cellinjerna, enligt resultatet är detta cellinje A och hypotesen stämmer. Enligt de resultat vi kom fram med hjälp av de andra gruppernas resultat så är den absolut starkaste induktionen av p21 då man använder sig av både Nutlin och strålning. Eftersom Nutlin är en MDM2 inhibator så är den indirekt specifik för just p21 induktion och väldigt effektiv på detta. Strålning är mer ospecifikt eftersom det skapar en DNA-skada som i sin tur aktiverar p53 i samband med en mängd andra reglerande faktorer. Detta gör att den inte är riktigt lika effektiv på att inducera p21 som Nutlin är. Men då dessa två kombineras så ger det absolut starkast induktion. Felkällor: Luftbubblor vid inkubationen Olika längd av exponering av substratet Felpipettering För liten mängd av proteiner i brunnarna

13 Laboration: Mutationsanalys Introduktion: Teori: Proteinet p53 kan kallas för genomets väktare och spelar en central roll vid cellsvar på olika stressorer som t.ex. DNA-skada, hypoxi och supression av tumörceller. P53 binder till DNA och medierar nyckelprocesser som DNA-reparation, cell-cykelarrest och om cellen inte kan repareras inducera apoptos. På möss har visats att om endast en kopia på p53-genen har inaktiverats så resulterar det i högre cancerutveckling och hos människor med Li-Fraumenis syndrom, som ärver en muterad p53-gen har en stark korrelation att utveckla olika typer av tumörer. Det finns också en stark koppling mellan utveckling av tumörer och mutationer i p53-genen. Vi har fått två prover med bröstcancerceller. Vår uppgift var att undersöka p53-genen för dessa prover och se om de var muterade. Syfte: Vårt mål var att med vetenskapliga metoder kartlägga nukleotidsekvensen och dess kvävebaser för p53-genen för att se om de hade någon mutation. Metoder för mutationsanalys av p53-genen Metoden innebär kortfattat att man börjar med att syntetisera nya DNA-strängar från enkelsträngat DNA med en PCR-maskin. För att kartlägga nukleotidsekvensen har Sanger-sekvensering använts, som uppfunnits av Fredrik Sanger. I metoden används en viss koncentration av nukleotider uppmärkta med ett fluorescerande ämne som också får DNA-syntesen att avstanna och detta gör att man märker upp alla nukleotidsekvenser vilket sedan körs i en kapillärelektrofores. I denna beskjuts nukleotiderna med laser och ljuset från de olika fluorescerade nukleotiderna registreras av en sensor vilken berättar nukleotidsekvensen. Resultat Vi har fått nukleotidsekvensen som en skriptfil och denna har jämförts mot en databas med normal omuterad sekvens. P53-genen ligger på kromosom 17, lokus p13.1 och består av 11 exon. Den kodande sekvensen startar i exon 2 och den kodande sekvensen är 1182 baspar lång. Genen i sig är baspar lång och kodar för ett protein som består av 393 aminosyror. I cellinje A forward finns det en deletion och två nukleotider med brus (sekvensen anger M dvs. antingen C eller A) samt en punktmutation. Denna sekvens jämfördes med cellinje A reversed och det enda som sammanföll med cellinje A forward var punktmutationen. Mutationen innebär ett aminosyrabyte från Glutaminsyra till Lysin (GAG285AAG; Glu>Lys). Aminosyran Glutaminsyra har en hydrofil och sur sidokedja medan Lysin har en hydrofil och basisk sidokedja. Glutaminsyra är vanligtvis negativt laddad i en neutral miljö medan Lysin är positivt laddad i samma miljö vilket kan ändra proteinets laddning och dess funktion. I vår mutationsanalys av cellinje B hittades inga mutationer efter att vi samkört cellinje B forward mot cellinje B reversed

14 Gemensam slutsats: När vi tittar på alla laborationer har samtliga kommit fram till att det finns en mutation i cellinje A på genen för p53. Detta påverkar om cellerna går i apoptos eller om de fortsätter i cellcykeln. Mutationer påverkar p53 genom att förändra dess kapacitet att binda till genomet. Detta leder till att andra gener ej kan transkriberas, exempelvis p