Ämnen som binder till järn, så kallade järnkelerare, kan därför indirekt minska den oxidativa stressen i cellen.

Transkript

1 Laborationsrapport: Cellskada och manipulering av cellers känslighet för stress Basgrupp 5 Bakgrund I mitokondrien sker den oxidativa fosforyleringen för att bilda ATP. Under denna kemiska process kommer det ständigt att bildas en liten mängd fria radikaler så som superoxid, väteperoxid och hydroxylradikaler. Dessa molekyler är mycket reaktiva och kan i fri form skada cellens makromolekyler. Cellen har därför olika skyddsmekanismer som gör att de fria radikalerna oskadliggörs direkt när de bildas. Skyddsmekanismerna är dock inte felfria och en liten andel fria radikaler frisätts och utsätter cellen för oxidativ stress. Den cellulära stressen tar sig i uttryck genom att både lipider och proteiner reagerar med syreradikaler och därmed blir icke-funktionella. Yttre stressfaktorer så som strålning, toxiska kemikalier och näringsbrist kan öka den oxidativa stressen i cellen. Antioxidanter är ämnen som har förmåga att binda upp och reagera med de fria radikalerna innan de utövar stress. Järn kan öka den oxidativa stressen genom att donera en elektron till väteperoxid som då bildar den ännu mer reaktiva hydroxylradikalen. Detta är den så kallade Fentonreaktionen: H 2 O 2 + Fe 2+ HO +OH - + Fe 3+ Ämnen som binder till järn, så kallade järnkelerare, kan därför indirekt minska den oxidativa stressen i cellen. Material och metod 1.1 Behandling med modulatorer Cellerna som användes är en cellinje från humant skivepitel (UT-SCC-77). Cellerna har odlats i små cellodlingsskålar i 2 ml cellodlingsmedium. Odling har ägt rum i en inkubator med 37 C med 5 % CO 2. För att studera hur cellerna påverkas av oxidativ stress har järn (FeCl 3 ) och väteperoxid tillsatts. Antioxidanten NAC (N-acetylcystein)och järnkeleraren desferal tillsattes för att studera hur cellen kan skyddas mot oxidativ stress. Slutkoncentration av järn (FeCl 3 ) var 30 µm. Slutkoncentrationen av Desferal och NAC var 1 mm. Modulatorerna tillsattes enligt tabell 1. Experimenten gjordes i dubbelprover för att kunna analysera både ATP samt lipidperoxidering. Skål 1 till 4 är positiva kontroller för att studera de olika modulatorernas effekter på cellerna. Skål 5 är en negativ kontroll utan någon tillsatts. I skål 6 tillsattes antioxidant, järn och väteperoxid för att studera om antioxidanten hade en skyddande effekt. Det samma gällde för skål 7 men då utan järn. I skål 8 tillsattes väteperoxid och järn för att studera effekten av de två tillsammans. Det tillsattes järnkelerare, järn och väteperoxid till skål 9 för att studera om järnkeleraren kunde ha en skyddande effekt. I skål 10 tillsattes antioxidant, järnkelerare, järn och väteperoxid för att undersöka om antioxidant och järnkelerare tillsammans ger bättre skydd.

2 Tabell 1. Skål Antioxidant Järnkelerare Järn Väteperoxid 1 X 2 X 3 X 4 X 5 6 X X X 7 X X 8 X X 9 X X X 10 X X X X 1.2 Kärnmorfologi vid apoptotisk celldöd Färdigpreparerade cellprover som utsatts för alla kombinationer av aktuella modulatorer studerades. För att studera kärnmorfologin på dessa prover färgades de med DAPI, ett ämne som binder in till A- T-rika områden i DNA vilket färgar cellkärnorna. Kärnmorfologin studerades i fluorescencemikroskop för att titta på skillnaden i morfologi mellan kontrollceller och celler som är behandlade med oxidativ stress. Cellerna fotograferades för att kunna beräkna antalet normala och apoptotiska celler. Därefter beräknades apoptosfrekvensen. 1.3 Viabilitetstest Nekrotisk celldöd Kontrollceller och celler som exponerats för väteperoxid färgades med tryptanblått. Celler med skadade plasmamembran färgades blå eftersom färgen då kunde läcka in. Cellerna inkuberades med tryptan i en minut och tvättades sedan två gånger med PBS (phosphate buffered-saline). Uppskattning av andel färgade celler gjordes genom mikroskopering. 2.1 Cellerna exponeras för väteperoxid Cellodlingarna som hade inkuberats kontrollerades om de var viabla genom att mikroskoperas. Efter detta tillsattes 1 ml väteperoxid till skål 4 och skål 6-10 efter att odlingsmediet pipetterades bort från cellerna. I de resterande cellodlingsskålarna tillsattes en buffert, 1ml PBS. Sedan inkuberades samtliga cellodlingarna i en timme med en temperatur på 37 C. När cellodlingarna var färdiginkuberade förbereddes de för senare analys. Odlingsmediet pipetterades bort från skålarna och 500 µl 2.5% triklorättiksyra (TCA) tillsattes för att lysera cellerna. Efter detta skrapades cellerna loss från botten av odlingsskålarna med en cellskrapa och pipetterades därefter till provrör som lades på is.

3 2.2 Kvantifiering av cellernas järninnehåll Handledarnas redan förberedda preparat användes för att studera cellernas järninnehåll. För järninfärgningen användes preussisk blå. Genom att räkna antalet celler som var blå kunde andelen celler innehållande järn beräknas i procent för de olika modulatorerna. 3.1 ATP-analys med hjälp av chemiluminiscens Skillnaden mellan friska cellers ATP-nivå och nivån i celler som utsatts för oxidativ stress är ett mått på mitokondriernas förmåga att kunna producera ATP. Har cellerna cellskada på grund av exempelvis oxidativ stress leder detta till minskad ATP-produktion. ATP -nivån i cellen mäts genom att studera reaktionen då D-luciferin omvandlas till oxyluciferin. Denna reaktion katalyseras av luciferas. Under reaktionen omvandlas ATP till AMP och överskottsenergin avges som ljus. Mängden ATP- molekyler är direkt proportionerlig mot antalet emitterade fotoner. Reaktionen är alltså ATP- beroende. Tio preparerade provrör med celler från cellodlingsskålarna användes. Cellproverna tillsattes till tio provrör med Tris-EDTA buffert och ATP -reagens. Antalet emitterade fotoner uppmättes i en luminometer. ATP-standard tillsattes och luminometern användes igen. Mängden ATP beräknades enligt följande formel: ATP prov = 10-7 x I prov / (I prov +std I prov ) Där I prov motsvaras av det första värdet och I prov+std motsvaras av det andra värdet. 3.2 Exponering av celler för väteperoxid I cellodlingsskålen sögs odlingsmediet bort med hjälp av en pipett. Därefter tillsattes 1 ml väteperoxidlösning till de prover som innehöll väteperoxid, till de prover som ej innehöll väteperoxid tillsattes 1 ml PBS. Proverna ställdes i cellodlingsinkubatorn i en timme på 37 C. Vart och ett av proven pipetterades över i varsitt eppendorfrör. 200 µl vatten tillsattes till cellodlingsskålen, sedan skrapades cellerna med en cellskrapa, därefter pipetterades cellerna över till eppendorfrören. Proverna frystes i temperatur av -70 C för att analyseras nästkommande dag. 4.1 Mätning av lipidperoxidering När lipiderna i cellmembranet reagerar med de fria radikalerna kommer aldehyder att bildas. Dessa aldehyder kan därför användas som ett mått på oxidativ stress kopplad till cellmembranet. För att mäta detta låter man aldehyderna reagera med en specifik reagens och ett kromkomplex bildas. Antalet kromkomplex kommer att vara proportionellt mot den mängd aldehyder som bildats vid den oxidativa stressen i cellmembranet.

4 När aldehyden bildat kromkomplexet kommer provets förmåga att släppa igenom ljus att förändras vilket kan mätas. Ljusgenomsläppligheten ger därmed ett värde på den mängd aldehyder som bildats och indirekt ett mått på den oxidativa stressen. För att få fram en aldehydkoncentration i respektive prov jämförs den uppmätta genomsläppligheten med en standardkurva. Standardkurvan är en serie prover i vilka mängden aldehyder är känt. Genom att mäta ljusgenomsläppligheten i dessa standardprover fås en kurva i vilken man kan läsa ut koncentrationen aldehyder för en viss ljusgenomsläpplighet. Resultat 1.2 Kärnmorfologi vid apoptotisk celldöd Bilden nedan visar antalet celler då järn och väteperoxid är tillsatt. Man ser till cellernas form och färg att alla är apoptotiska. I cellprovet nedan har både järn,väteperoxid, järnkelerare och NAC tillsatts. Man ser en mycket minskad apoptotisk frekvens. Alltså har järnkeleraren och antioxidanten en positiv effekt på cellerna.

5 Andel apoptotiska celler Andel apoptotiska celler Järn och väteperoxid tillsammans inducerade apoptos mest effektivt, med en frekvens på 100 %. Enbart exponering av järn påverkade cellerna, men i mindre utsträckning än bara väteperoxid. Andelen apoptotiska celler vid exponering av enbart NAC och desferal var likvärdig med andelen i kontrollprovet. Tillsatts av NAC till cellerna som exponerats för väteperoxid skyddade mot apoptos och frekvensen sjönk från 77 % till 28 %. NAC och desferal kombinerat skyddade cellerna som utsatts för både järn och väteperoxid bättre än de som enbart fått NAC. Frekvensen sjönk från 78 % till 33 %. 1.4 Viabilitetstest nekrotisk celldöd I provet med kontrollceller fanns inga blå celler, alltså var de inte skadade. Däremot i de väteperoxidexponerade cellerna sågs blå celler. Uppskattningsvis omkring 70 % av cellerna hade skadat membran och var därmed blåfärgade. 2.2 Kvantifiering av cellernas järninehåll Modulator Celler innehållande fritt järn % Kontroll 0% Järn 77% Järn + Antioxidant (NAC) Järn + Järnkelerare (Desferal) 87% 0% Till kontrollprovet har järn ej tillsatts. De övriga proverna har järn tillsatts tillsammans med en modulator.

6 Ljusgenomsläpplighet 3.1 ATP-mätning ATP-nivåer 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 ATP ,2 0,1 0 Neg Des NAC H2O2 Fe NAC & H2O2 NAC & Fe Fe & H2O2 Des, Fe & H2O2 NAC, Des, Fe & H2O2 4.1 Mätning av lipidperoxidering För att kunna beräkna koncentrationen aldehyd i de olika cellproverna görs först mätningar på ett antal prover där mängden aldehyd redan är känd. Resultaten som fås från standardproverna kan plottas in i en så kallad standardkurva. Standardkurvan fås genom en linjär regression. Standardkurva 0,35 0,3 0,25 y = 0,0636x + 0,0441 R² = 0,9996 0,2 0,15 0,1 0, Koncentration Aldehyd Ur standardkurvans funktion kan sedan koncentrationen aldehyd läsas ut för en viss ljusgenomsläpplighet

7 Koncentration aldehyd [μm] Aldehydkoncentrationen i respektive prov 2,5 Lipoperoxidering i cellmembranet 2 1,5 1 0,5 0 Koncentrationen aldehyd i cellproverna är beräknade med hjälp av funktionen i standardkurvan. Aldehydkoncentrationen indikerar graden lipoperoxidation i respektive cellprov. Diskussion Hur påverkar de olika modulatorerna cellernas järninnehåll? I både kontrollgruppen samt provet där järnkelelare tillsatts syntes inga blåa celler. Detta visar på att det mesta av järnet var uppbundet antingen med järnkeleraren Desferal eller med cellernas egna funktioner. Detta indikerar att Desferal ger ett effektivt skydd mot den stressen som cellen utsätts för. I provet med den vattenlösliga antioxidanten NAC var antalet blåfärgade celler högre (87% totalt) jämfört med kontrollprovet samt den med järnkelelaren. Antioxidanten verkar inte binda till järn och därför syns höga järnnivåer. I det prov där enbart järn tillsattes sågs 77% av cellerna vara blåfärgade, alltså verkar cellerna tagit upp det mesta av det tillsatta järnet. Detta indikerar att NAC i det här fallet inte skyddar cellen mot stressen. Vi upplevde det svårt att se skillnad på celler som endast var svagt infärgade, vilket kan ha lett till ett felaktigt resultat. De bilder vi studerade representerade en liten del av en stor cellodling varför just denna del kan vara missvisande för hela odlingen.

8 Hur påverkar de olika modulatorerna cellernas förmåga att producera ATP? Järn och väteperoxid gav enligt tabell 4 den lägsta ATP-nivån, vilket innebär att mitokondrierna hos cellerna i prov 4 har tagit mest skada och producerar minst energi. Tillsattes enbart järn (se prov 3) uppmättes mer ATP-produktion än då enbart väteperoxid tillsattes (se prov 4), vilket tyder på att väteperoxid har en mer skadlig effekt på våra celler än järn. Provresultaten visar att ATP-produktionen var högre då antioxidant hade tillsatts till ett prov med järn och väteperoxid. Vilket indikerar att antioxidanten hade en skyddande effekt på cellerna och ATP-produktionen fungerade bättre. Dock var värdet för ATP-produktionen ganska lågt (se prov 6). Jämför man med ett prov då även järnkelerare tillsattes (se prov 10) så ser man att värdet är ungefär dubbelt så högt, alltså har det skett mindre cellskada då järnkeleraren bundit upp järnet. Om man till ett prov med väteperoxid och järn tillsatte endast järnkelerare (se prov 9) visade mätningen att ATP-produktionen förbättrades i förhållande till om endast antioxidant var tillsatt. (se prov 6). Tillsattes antioxidant till ett prov med enbart väteperoxid (se prov 7), så hade antioxidanten en större effekt än om järn också fanns med i provet (se prov 6). Vilket man ser genom att avläsa ATP-nivån som var högre då järn inte var närvarande. Jämför vi vår negativa kontroll (se prov 5) med prov där endast antioxidant (se prov 1) respektive järnkelerare (se prov 2) tillsatts ser vi ett högre värde i de senare två proven. Detta troligen på grund av att järn naturligt förekommer i celler. Hur påverkar de studerade faktorerna lipoperoxidering i cellmembranet? Som väntat leder tillsats av väteperoxid till ökad lipoperoxidering. Det är också tydligt att närvaro av järn kommer att främja bildandet av ytterligare fria radikaler som ökar lipoperoxidering. Om man jämför prov med antioxidant, järn och väteperoxid med prov med järnkelerare, järn och väteperoxid minskar den oxidativa stressen betydligt mer vid närvaro av järnkelerare jämfört med antioxidant. I våra experiment har järnkelerare alltså större dämpande effekt på oxidativa stressen på cellmembranet än vad antioxidanten har. Detta beror på att NAC är vattenlösligt och påverkar därför inte cellmembranet. NAC reducerar väteperoxid ökade intracellulära reaktiva oxygen species till den normala nivå samt NAC kan öka glutation reserver, glutation kan på sin tur är en antioxidant. Järnets betydelse för graden av oxidativ stress styrks också genom att jämföra kontrollen med prover med enbart järnkelerare respektive antioxidant. Järnkeleraren dämpar den oxidativa stressen även utan tillsatta järnjoner eller väteperoxid vilket pekar på att även en minskning av det endogena järnet leder till minskad oxidativ stress. I denna del av laborationen är det viktigt att det inte är några bubblor i de prover som analyseras då detta kan påverka ljusgenomsläppligheten och därmed ge ett felaktigt resultat. Medicinsk tillämpning Antioxidanter som kan skydda cellen mot oxidativ stress finns framför allt i grönsaker och frukt, men även i te, kaffe och vin. Exempel på näringsämnen som fungerar som antoxidanter är vitamin E, vitamin C, beta-karoten, riboflavin och selen. Zink, mangan och koppar är viktiga för enzymer med antioxidativa funktioner.

9 Det finns ett stort antal studier som visar att kost med stort intag av frukt och grönsaker skyddar mot insjuknande i hjärt-kärlsjukdomar och vissa former av cancer. Man har inte kunnat bevisa att dessa resultat är kopplande till antioxidanters skyddande effekt på cellen. Livsmedelsverket rekommenderar dagligt intag av ca 500 g frukt och grönsaker per dag. Många studier har gjorts på hur antioxidater som kosttillskott påverkar hälsan. Risken för hjärtkärlsjukdomar och cancer sjunker inte vid kosttillskott med antioxidanter. Studier har visat att kosttillskott med beta-karoten, vitamin A och vitamin E istället ökade dödligheten, medan det var svårare att dra slutsatser om vitamin C och selen. Nyligen visade en forskargrupp i Göteborg att möss med lungcancer fick ett snabbare förlopp i sjukdomen efter tillskott av antioxianter (vitamin E och acetylcystein). Antioxianterna gav en minskning av oxidativ stress och DNA skada, men minskade även uttrycket av p53, som är en viktigt tumörsuppressorgen. Resultatet har konfirmerats i humana lungcancercellinjer men inte på människor. Medicinskt används acetylcystein som läkemedel med slemlösande och hostfrämjande effekt. Detta genom att den kan lösa upp segt slem så att det blir mer tunnflytande och därmed lättare att hosta upp. Den kan också minska vävnadsskadan vid inflammation då den används för behandling av kronisk bronkit. En av de viktigaste acetylcystein användningar är för paracetamolförgiftning samt att den kan användas för cystisk fibros och inflammationen i ögat. Källor Livsmedelsverket Mortality in randomized trials of antioxidants supplements for primary and secondary prevention systematic review and meta-antalys, Goran Bjelakovic et al, JAMA. 2007;297(8): Antioxidants accelerate lung cancer progresson in mice. Volkan I Sayin et al, Sci Transl Med 6 221ra15 (2014) FASS