Receptorfarmakologi trombocyter

Storlek: px

Starta visningen från sidan:

Download "Receptorfarmakologi trombocyter"

Ulla Lind
för 6 år sedan
Visningar:

1 Receptorfarmakologi trombocyter Bakgrund: Många hormoner och signalsubstanser verkar genom att binda till receptorer för att utöva sin effekt. Kunskapen om detta utnyttjas vid läkemedelsframställning då många läkemedel verkar genom att binda till receptorer för att antigen stimulera eller inhibera. Substanserna som binder till receptorerna kallas för ligander, dessa kan vara agonister (aktiverar receptorn och dess signalväg) eller antagonister (inhiberar receptorn och dess signalväg eller ger motsatt effekt mot agonisten om antagonisten är en invers agonist). Det är känt att receptorer på trombocyter kan stimuleras av ADP, vilket kan leda till aggregation, vilka vi har undersökt i denna laboration. Syftet med laborationen var att undersöka den antikoagulativa effekten av två olika typer av trombocythämmande substanser: Cangrelor och MRS Dessa substanser verkar som antagonister på olika receptorer på trombocyterna: Cangrelor på receptorn P2Y12 och MRS-2179 på receptorn P2Y1. Dessutom ville vi utreda hur betydande roll de två olika receptortyperna hade i aggregationsprocessen. Metod: För att undersöka trombocyters förmåga till aggregation, användes en metod som baseras på kontinuerlig mätning av ljustransmission genom trombocytprov. Instrumentet som använts för detta kallas för aggregometer. Ökad ljustransmission genom provröret är ett resultat av att trombocyterna aggregerat, klumpat ihop sig och sjunkit till botten. Vi började med att separera blodplasma genom centrifugering. Vi genomförde två centrifugeringar, en för att få fram en trombocytrik (PRP) och en för att få fram trombocytfattig (PPP) blodplasma. PPPprovet använde vi som referensprov, då det medgav maximal ljustransmission pga den låga koncentrationen trombocyter. Kalibrering utfördes med hjälp av PPP och PRP. En spädningsserie gjordes sedan med olika koncentrationer av ADP för att göra en kumulativ tillsats av ADP, dvs vi lade till allt starkare koncentrationer av ADP till trombocytprovet som mätningarna gjordes i. Spädningsserien med ADPlösning bestod av 7 provrör, med koncentrationer som motsvarade 0.03, 0.1, 0.3, 1.0, 3.0, 10 och 30 μm. Ursprungsvolymen i trombocytprovet var 500μL och vi tog inte hänsyn till vare sig volym- eller koncentrationsändringen som uppstod då föregående ADP-koncentration tillsats. För varje ökad koncentration undersökte vi förändringen av ljustransmissionen i trombocytprovet. Vi gjorde även ett försök där vi tillförde en singeldos av ADP för att se om de små tillsatta doserna i det kumulativa försöket hade en sensitiserande eller desensitiserande effekt, därför valde vi en koncentration som låg mitt i intervallet i den kumulativa studien, dvs 3 μm (se fig 1).

Slutligen blandade vi nya lösningar med antagonister för att undersöka hur trombocytprovet påverkades av en kombination av dessa (Cangrelor respektive MRS-2179) och agonisten ADP.

2 Slutligen blandade vi nya lösningar med antagonister för att undersöka hur trombocytprovet påverkades av en kombination av dessa (Cangrelor respektive MRS-2179) och agonisten ADP. Koncentrationen för antagonisterna var 0.1 och 5 μm för Cangrelor, samt 1 och 20 μm för MRS För detta behövdes två nya trombocytprov, med en typ av antagonist i varje, samt referensprov. Antagonisterna tillsattes sedan till trombocytproven, därefter tillsattes 10 μm ADP till båda provrören. Förändringen i ljusgenomsläppligheten undersöktes därefter. Resultat och diskussion: Kumulativ tillsättning av ADP Efter fjärde dosen observerades en topp på tid-respons kurvan orsakad av konformationsändring hos trombocyterna (förstoring och bildning av dendritutskott), vilket medförde att ljusgenomsläppligheten blev mindre. Detta tydde på att trombocyterna började aktiveras, när vi sedan lade till den femte dosen fick vi en tydlig aggregation av trombocyterna. Detta kännetecknades av att en ökad ljustransmission genom provröret registrerades. Ytterligare aggregation observerades när resterande doser tillsattes. Orsaken till att ljustransmissionen ökar vid aggregation är att trombocyterna då blir tyngre och sjunker till botten av röret. Fig 1. Grafen visar förändringen av ljustransmissionen vid ökad koncentration ADP (dos 1 7). På y-axeln visas andel aggregerade trombocyter (i procent) och på x-axeln visas tiden. De lodräta topparna som kan observeras i grafen är orsakade av minskat ljusinflöde då pipettspetsen fördes ned i provröret. Ingen sådan topp kan observeras vid dos 7 då en annan typ av pipettspets användes.

3 Singeldos Fig 2. Här ser vi resultatet av försöket med singeldos (med samma koncentration som dos 5 i det kumulativa försöket). Här konstaterades att effekten av ADP på trombocyternas aktivitet blev mindre än vid samma dos vid det kumulativa försöket. Detta kan förklaras av att de tillförda doserna innan dos 5 i det kumulativa försöket aktiverade trombocyterna vilket också gjorde dem mer excitatoriska vid dos 5.

MRS-2179 (antagonist) Fig 3. De två olika kurvorna i grafen presenterar de två olika doserna av MRS-2179. Den svarta grafen motsvarar 1 μm och den blåa 20 μm ADP.

4 MRS-2179 (antagonist) Fig 3. De två olika kurvorna i grafen presenterar de två olika doserna av MRS Den svarta grafen motsvarar 1 μm och den blåa 20 μm ADP. Trots närvaro av antagonister blev trombocytsvaret kraftigt, oberoende av vilken dos som tillsattes. Man kan alltså konstantera att denna receptor troligtvis har en liten betydelse för effekten av ADP på trombocyternas aggregation. I detta test undersökte vi receptorn P2Y1.

5 Cangrelor (antagonist) Fig 4. Den svarta kurvan motsvarar en dos på 0,1 μm och den blåa 5 μm ADP. I detta fall ser vi att koncentrationen av antagonisten har stor betydelse för ADPs effekt på trombocytaggregationen. Uppnås en tillräckligt hög koncentration av antagonisten (c.a 5 μm Cangrelor), kommer 10 μm ADP-inducerad trombocytaggregation att blockeras helt. Detta tror vi kan bero på att samtliga receptorer inhiberas. En dos på 0,1 μm Cangrelor har i princip ingen blockerande effekt på trombocyterna om man jämför med det kumulativa försöket. I detta test undersöktes receptorn P2Y12. Vi kan konstatera att Cangrelor har en betydligt starkare hämmande effekt än MRS-2179.

6 Fig 5. I denna dos-responskurva ser vi att vi inte kommer upp i tillräcklig hög dos för att få maxaggregation hos trombocyterna. Därför syns ingen sigmoidal-kurva som planar ut efter aggregationen, vilket den troligen hade gjort om vi hade fortsatt tillsätta ADP. Vi kan dock avläsa ett EC 50 värde då vi har mer än 50% av maxeffekten, enligt kurvan är EC 50 värdet c.a 16 μm ADP. Felkällor: - Felberäkningar av volymer m.m. - Luftbubblor i provrören efter pipettering vilket kan ändra volymen. - Problem med centrifugeringen kan leda till att blodplättarna inte separeras som de ska - Hantering av proven, exempelvis om man råkar skaka om provrören. Temperaturändringar m.m. Dessa faktorer kan påverka blodets egenskaper Källor: George M. Brenner, Craig W Stevens, Pharmacology, Elsevier, 2013, 4:e upplagan

Relevanta dokument

Receptorfarmakologi Purinerga receptorer och Trombocyter

Receptorfarmakologi Purinerga receptorer och Trombocyter Utförd av: Johanna Nylund Hanna Svahlstedt Linnea Stenlund Yousif Saeed Bakgrund Många läkemedel utövar sin effekt genom att de binder in till receptorer