Immunoglobulin. Funktion och Struktur. Projektarbete skrivet av: Linnéa Ahlin, Louise Andersson, Elsa Björn och Karin Thellenberg

Transkript

1 Immunoglobulin Funktion och Struktur Projektarbete skrivet av: Linnéa Ahlin, Louise Andersson, Elsa Björn och Karin Thellenberg Handledare: Hans Eklund Bke1 (KE0026)

2 Sammanfattning Immunsystemet är en viktig fuktion i kroppen som ser till att vi håller oss fria från skadliga inkräktare i form av virus och bakterier. Försvaret består av det specifika och ospecifika immunförsvaret. I det specifika immunförsvaret hittar vi immunoglobulinerna/antikroppar som har till uppgift att binda till sig antigener. Immunoglobulin molekylen är Y-formad och uppbyggd av två lätta kedjor och två tunga kedjor som i sin tur är uppbyggda av variabla och konstanta domäner. I de variabla domänerna, som finns vid N-terminalen på immunoglobulin, finns de hypervariabla regionerna som är de som binder till sig antigenet. Bindningen i sig utgörs av icke-kovalenta bindningar mellan en del på antigenet och antikroppen. Inom biokemin kan antikroppar användas till att identifiera proteiner och andra substanser. Immunförsvaret - inledning Immunsystemet är en viktig funktion i våran kropp när det gäller försvar mot sjukdomar och är uppbyggt av det specifika och det ospecifika immunförsvaret. Det ospecifika immunförsvaret fungerar redan från födseln och består av huden och slemhinnorna som skyddar oss mot främmande smittoämnen. Till det ospecifika immunförsvaret räknas dels komplementsystemet som utgörs av olika proteiner som hjälper till att oskadliggöra bakterier, samt olika typer av vita blodkroppar. Det finns många olika slags vita blodkroppar och alla har varsin uppgift, exempelvis granulocyter som har förmågan att äta upp och oskadliggöra bakterier och andra smittoämnen. De kan känna igen en främmande eller sjuk cell genom att varje cell har antigener på sig som fungerar som ett slags fingeravtryck. Det specifika immunförsvaret utgörs av T-lymfocyter och B-lymfocyter som är ett slags vita blodkroppar. Bådas uppgift är att på olika sätt identifiera antigener så som virus eller bakterier. I en individ finns över en miljon olika B-lymfocyter och varje B-lymfocyt producerar en specifik antikropp (immunoglobulin) som i sin tur är specialiserad på en typ av antigen. I det här projektarbetet har vi valt att inrikta oss på just immunoglobuliner. B-lymfocyter som någon gång blivit aktiverat av ett antigen "kommer ihåg" detta och finns kvar som så kallade minnesceller och kan snabbt mobiliseras om vi återigen utsätts för samma smittoämne, så kallad immunitet. Vi kan även bli immuna på medicinsk väg med hjälp av vaccin där man injicerar det smittoämnet som man vill bli immun mot. Det framställs då antikroppar och minnesceller mot just den sjukdomens antigen. Då ett smittoämne redan fått fäste i kroppen och man på ett snabbt sätt vill få antikroppar kan man injicera ett serum. Serumet består av redan färdiga antikroppar som utvunnits ur blod från exempelvis människa eller djur. Det varar dock inte så länge eftersom att antikropparna tar slut efter ett tag och det egna försvaret blir passivt.

3 Immunoglobulin Alla immunoglobuliner är uppbyggda av två lätta kedjor (L) och två tunga kedjor (H) som binds samman av disulfidbindningar. Det finns två olika klasser (isotyper) av lätta kedjor, l och k och det finns fem olika isotyper av tunga kedjor som delar in immunoglobuliner i olika klasser: IgG, IgA, IgE, Ig M och Ig D. Dessa skiljer sig inte bara åt i strukturen utan också i hur de binder antigen (se figur 1). IgM är en pentamer, där H-kedjan består av en variabel domän och fyra konstanta domäner. Det svarta strecket i molekylen är en polypeptidkedja som har adderats och kallas för J-kedjan (se figur 1). Den kan binda ihop två enheter och forma en dimer av IgA. IgG, IgD och IgE är monomeriska immunoglobulinmolekyler [2]. Figur 1. (a) Immunoglobulin molekylen med de tunga och lätta kedjorna och vart antigen binder till Immunoglobulin. (b) Schematisk polypeptidkedjestruktur av olika immunoglobulin molekyler. [2] Immunoglobulin G är den antikropp som finns i högst koncentration i människans serum och som har den enklaste strukturen. Immunoglobulin M är den första klassen av antikroppar som dyker upp i serum efter ett ha blivit utsatt av en antigen. Immunoglobulin A finns mest i yttre avsöndringar så som saliv, tårar och luftrörsslem och fungerar som försvar mot bakterier och virusantigener. Immunoglobulin D vet man inte så mycket om ännu. Immunoglobulin E tilldelar försvar emot parasiter. IgE kan också orsaka allergiska reaktioner. Immunoglobulin G Immunoglobulin G består av två olika polypeptidkedjor, en 25-kd lätt kedja och en 50-kd tung kedja. Den lätta kedjan har två domäner, immunoglobulindomäner, medan den tunga kedjan har fyra. Subenhetskompositionen hos immunoglobulin G är L 2 H 2. Varje L-kedja är bunden till en H-kedja genom en disulfidbindning, och H-kedjorna är bundna till varandra genom minst en disulfidbindning.

4 IgG-molekylen har en Y-liknade struktur, bestående av stammen F c och de två armarna F ab (F= fragment, ab= antigenbindande) (se figur 2). De tre delarna formas när proteaset papain klyver IgG-molekylen. Stammen består av två C-terminal immunoglobulindomäner av varje H-kedja. Armarna består av två N-terminal immunoglobulindomäner av varje H-kedja och två N-terminal domäner av varje L-kedja. Papain klyver H-kedjan på C-terminalsidan av disulfidbindningen som binder ihop varje L- och H-kedja. Varje F ab består en hel L-kedja som binds med en disulfidbrygga till tre N-terminalhalvor av en H-kedja. Varje F c består av C- terminalhalvor av båda H-kedjorna. Varje F ab innehåller en antigenbindande yta. Eftersom en intakt IgG molekyl består av två F ab komponenter har den två bindningsytor vilket gör att molekylen kan tvärbinda flera antigener. [1] Figur 2. Klyvning av immunoglobulin G med papain som bildar två Fab delar och en Fc del. [2] Bindningen mellan F ab - och F c -regionerna i IgG-molekylen är flexibel och gör så att de två antigenbindande ytorna kan orientera sig rätt för att kunna binda till ett antigen. Detta kallas för segmental flexibility. Jämförelse av aminosyrasekvenser från olika IgG-antikroppar, från människor eller möss, visar att N-terminaldomäner av varje polypeptidkedja har mycket variabla sekvenser medan de återstående domänerna har konstanta sekvenser. En L-kedja är uppbyggd från en N- terminaldomän som är variabel (V L ) och en C-terminaldomän som är konstant (C L ). H-kedjan är uppbyggd från en variabel N-terminaldomän (V H ) och tre konstanta N-terminaldomäner (C H1, C H2 och C H3 ). De fyra kedjorna hålls ihop av disulfidbryggor. Ytan som binder antigen finns vid slutet på de variabla domänerna. I figur 3 syns tre små regioner som visar mycket hög variabilitet än resten av domänerna. Dessa områden kallas hypervariabla regioner eller complementarity determining regions, CDR1, CDR2 och CDR3 och är lokaliserade vid N-terminalen på varje variabla domän. Dessa varierar både i storlek och aminosyrasekvens hos olika immunoglobuliner. Dessa regioner bestämmer specificiteten hos antigen-antikropp interaktionerna. De olika konstanta domänerna - C L, C H1, C H2 och C H3 - visar stor sekvenslikhet mellan varandra och andra konstanta domäner från olika klasser av immunoglobulin.

5 Figur 3. (a) De hypervariabla regionerna hos immunoglobulin. (b) Diagram över variabilitet som funktion av aminosyra nummer längs polypeptidkedjan. De tre topparna i diagrammet visar de tre hypervariabla regionerna, CDR1, CDR2 och CDR3. [2] Både konstanta och variabla domäner från både H- och L-kedjor har liknande strukturer, vilket har blivit känt som immunoglobulin fold. Detta tas upp i nästa del, immunoglobuliners struktur. Immunoglobulins struktur En immunoglobulin molekyl består av 12 domäner där varje domän har en liknande struktur: 2 b-flak bestående av antiparallella b-strängar är tätt ihop packade mot varandra i en komprimerad b-tunna med en hydrofob kärna [3]. Tunnan hålls samman och stabiliseras av vätebindningar mellan b-strängarna i varje flak, hydrofoba interaktioner mellan sidokedjorna i de två b-flaken samt genom en disulfidbrygga mellan flaken. Denna konserverade struktur kallas The Immunoglobulin Fold och återfinns i många andra proteiner som har nyckelroller i immunsystemet [1]. Som tidigare beskrivet består immunoglobulin molekylen av konstanta och variabla domäner. Alla konstanta domäner är uppbyggda av sju b-strängar, varav fyra strängar bygger upp ett flak och tre strängar det andra flaket (se figur 4). Looparna i de konstanta domänerna varierar i längd och sekvens mellan de olika klasserna av immunoglobulin, men är konstanta inom varje klass. Den övergripande strukturen hos de variabla domänerna är väldigt lik strukturen hos konstanta domäner, förutom att variabla domäner är uppbyggda av nio b-strängar istället för sju [3]. De två extra strängarna är inlagda i loopregionen där b-sträng C är ihop bunden med b-sträng D (se figur 4). Det är i de variabla domänerna som de hypervariabla regionerna (CDRs) är lokaliserade.

6 Figur 4. (a) Jämförelse i struktur mellan konstanta och variabla domäner hos immunoglobuliner. Hos de variabla domänerna finns de hypervariabla looparna som tillsammans bildar en potentiell bindningsyta för ett antigen. (b) illustration över att ett _-flak återfinns i både den variabla och konstanta domänen. [2] Det finns två aspekter gällande immunoglobulins struktur som är speciellt viktiga för dess funktion [1]: 1. De hypervariabla looparna hos de variabla domänerna då de bestämmer specificiteten hos en immunoglobulin molekyl och bildar en bindningsyta för ett antigen. 2. N-terminalerna och C-terminalerna är på motsatt sida om varandra i strukturen, vilket medför att domänerna i immunoglobulin kan kopplas samman och bilda kedjor (se figur 1). Sådana kedjor är närvarande i många andra nyckelmolekyler i immunsystemet. Immunoglobulins specifika bindningsförmåga Hos samtliga typer av antikroppar bildar de utgående looparna vid N-terminalerna hos L- och H-kedjorna en bindningsyta till vilken olika antigener kan bindas (se figur 5). Varje domän har tre loopar med hypervariabla sekvenser. De totalt sex looparna bildar tillsammans en enda yta vid slutet av antikroppens arm. Då alla typer av variabla L- och H-kedjor kan binda till varandra kan därigenom ett mycket stort antal olika bindningsytor uppstå.

7 Figur 5. Två överblickar av de variabla domänerna hos L-kedjan (gul) och H-kedjan (blå), de hypervariabla looparna är i rött. De sex looparna bildar tillsammans en bindningsyta och specificiteten för olika antigen bestäms av sekvensen och strukturen hos de hypervariabla looparna. [1] Bindningen mellan ett antigen och en antikropp styrs av samma princip som när ett substrat binds till ett enzym, bland annat med hjälp av approximitetseffekten, närhetseffekten. Fenomenet induced fit förekommer även vid antigen antikropp komplex och ökar antikroppens specificitet [1]. Monoklona antikroppar har en Lock-and-Key passning till varandra vilket innebär att bindningsytornas form anpassas till varandra [4]. En formbar bindningsyta bidrar till betydligt fler bindningsmöjligheter än en stel sådan. Ett stort antal vätebindningar, elektrostatiska bindningar och van der Waals bindningar förstärkta med hjälp av hydrofobiska krafter bidrar till de starka och specifika bindningarna. Bindningsytan på antikroppen använder sig av en eller flera av looparna vid bindningen till molekyler. Små molekyler har kontakt med färre loopar medan en större molekyl kan vara i kontakt med alla sex loopar. Vid bindning av små molekyler deltar omkring 15 sidokedjor hos antikroppen i bindningen. Vanligtvis binds små molekyler i klyftor i bindningsytan med hjälp av exempelvis elektrostatiska bindningar. En makromolekyl, som exempelvis globulära proteiner, binder till större mer plana bindningsytor. Då en makromolekyl binds deltar 20 eller fler sidokedjor till bindningen [1]. Bindningen mellan en antigen och en antikropp är reversibel och komplex av stora molekyler kan brytas bland annat genom en förändring i ph som i sin tur förstör passningen mellan molekylerna. Detta gör att man kan använda affinitetskromatografi för att rena fram antikroppar och antigener [4]. Användning av immunoglobuliner/antikroppar inom Biokemin Inom biokemin kan man använda antikroppar för att på immunologisk väg identifiera proteiner och andra substanser genom olika tester som t.ex. ELISA (Enzyme Linked Immuno- Sorbent Assay) eller Western Blot. Vid dessa test använder man sig antingen av polyclonal antibodies eller monoclonal antibodies. Monoklona antikroppar är antikroppar som är identiska med varandra. De är producerade från en typ av B-cell och är kloner av varandra. Monoklona antikroppar kan massproduceras i ett laboratorium genom att exempelvis smälta samman en antikropp-producerande B-cell med

8 relativt kort livslängd, med en snabbt växande cancer cell. Resultatet blir en hybridcell som förökar sig snabbt och skapar en klon som producerar den antikropp man vill åt, i stora kvantiteter. Monoklona antikroppar används ofta i laboratorium och i medicinska tester då de minskar bieffekterna som kan uppstå om man använder sig av polyklona antikroppar som är antikroppar producerade av olika B-celler och är därmed olika i sin struktur. [1] Varje B-cell producerar antikroppar som är specifika, inte till en antigen utan till ett epitop som är en liten del på detta antigen där antikroppen binder. Polyklona antikroppar binder till många epitoper på ett antigen, medan monoklona enbart binder till en enda epitop. Nackdelen med att använda monoklona antikroppar är att när man preparerar antikroppar kan vissa bindningsförmågor blir fördärvade, om de monoklona antikropparna som man jobbar med är känsliga för detta kan de lätt bli oanvändbara då de bara binder till en epitop. Om man arbetar med polyklona antikroppar kommer de fortfarande att vara användbara även om vissa epitopbindningstyper försvinner. [1] ELISA Används för att undersöka om en viss substans är närvarande i ett prov. ELISA går till på så sätt att man har ett enzym, som reagerar med ett färglöst substrat för att bilda en färgad produkt, som är kovalent bunden till en specifik antikropp som känner igen antigenet man vill ha tag på. Om antigenet är närvarande i lösningen binder antikropp-enzym komplexet antigenen och katalyserar reaktionen som ger den färgade produkten. Närvaron av den färgade produkten indikerar på närvaron av antigenen. Detta är ett snabbt och lättanvändligt sätt att detektera olika substanser. Ett ELISA test kan upptäcka en substans även om mängden av det är mindre än ett nanogram (10-9 g). I ELISA kan man använda sig av både monoklona och polyklona antikroppar, men monoklona ger ett mer tillförlitligt resultat. ELISA test används vid undersökning om man har en HIV infektion i blodet.[5] Western Blot Används då man vill hitta ett protein som finns i liten mängd i en lösning innehållande en massa andra proteiner, t.ex. i blodet. Western Blot går till på så sätt att man först applicerar provet på en SDS-polyacrylamid gel, sedan blottar man genom att överföra de denaturerade proteinerna till en polymerplatta som gör proteinerna mer tillgängliga för antikroppen som specifikt binder det protein man vill ha tag på. Antikropp-antigen komplexet identifieras genom att tvätta plattan med en annan antikropp som känner igen den första antikroppen (t.ex. en antikropp från ett annan djur). Ett radioaktivt märke på den andra antikroppen frambringar ett mörkt streck vid röntgen strålning. Alternativt är den andra antikroppen bundet till ett enzym som ger en färgad produkt (som ELISA test). Western Blotting gör det möjligt att hitta ett protein i en komplex blandning och används t.ex. vid test för hepatit C. [5]

9 Referenser [1] Biochemistry, Fifth Edition. Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko and Lubert Stryer, s [2] Introduction to Protein Structure, Second Edition, Carl Branden and John Tooze, s [3] Hemsida: An Introduction to immunoglobulin structure [4] Essential immunology, Seventh Edition. Ivan Roitt, s. 68. [5] Hemsida: Wikipedia, the free encyclopedia