PROKALCITONIN SOM MARKÖR FÖR SEPSIS OCH BAKTERIELLA INFEKTIONER

Transkript

1 PROKALCITONIN SOM MARKÖR FÖR SEPSIS OCH BAKTERIELLA INFEKTIONER UTPROVNING AV EN NY METOD PÅ KLINISK KEMI I KRISTIANSTAD THERESE VELIN HANDLEDARE: STEN ERIK BÄCK Examensarbete i Malmö högskola: Biomedicinsk laboratorievetenskap Hälsa och samhälle 15 högskolepoäng Malmö Biomedicinska analytikerprogrammet Maj 2010

2 PROKALCITONIN SOM MARKÖR FÖR SEPSIS OCH BAKTERIELLA INFEKTIONER UTPROVNING AV EN NY METOD PÅ KLINISK KEMI I KRISTIANSTAD THERESE VELIN Velin, T. Prokalcitonin som markör för sepsis och bakteriella infektioner. Utprovning av en ny metod på Klinisk Kemi i Kristianstad. Examensarbete i biomedicinsk laboratorievetenskap 15 högskolepoäng. Malmö högskola: Hälsa och samhälle, Utbildningsområde Biomedicinsk laboratorievetenskap, Prokalcitonin är ett prohormon på 116 aminosyror som normalt produceras i tyroideas c-celler och i neuroendokrina celler i lungorna som svar på hyperkalcemi. Vid sepsis och andra bakteriella infektioner stimulerar bakterielipopolysackarider (LPS) och olika cytokiner produktionen av prokalcitonin i celler i hela kroppen. Flera studier har gjorts för att utvärdera hur prokalcitoninmätningar kan användas, dels för att skilja bakteriella infektioner från icke-bakteriella, dels för att anpassa antibiotikabehandlingen individuellt. I dessa studier har antibiotikaanvändningen kunnat minskas, vilket kan leda till minskat selektivt tryck och minskad resistens hos bakterier, samt sänker kostnaden för behandling. Syftet med denna studie är att sätta upp en ny metod för prokalcitoninanalys. Metoden är en automatiserad, immunologisk metod på befintligt instrument i Kristianstad. Prover dels från Lund, som använder samma metod, dels från Malmö, som använder en annan automatiserad metod, jämfördes med mätningar på Kristianstads instrument. Resultatet visade god överensstämmelse mellan Kristianstads och Lunds mätningar och något sämre mellan Kristianstads och Malmös mätningar. Mellandagsprecisionen var tillfredsställande, totalt 4,5 % på den låga kontrollen och 1,9 % på den höga kontrollen. Inomserieprecisionen var utmärkt, 1,4 % i genomsnitt. Nyckelord: antibiotikaanvändning, bakterieresistens, Elecsys Brahms PCT, hållbarhet, inomserieprecision, mellandagsprecision, prokalcitonin 2

3 PROCALCITONIN AS A MARKER FOR SEPSIS AND BACTERIAL INFECTION EVALUATION OF A NEW METHOD AT THE DEPARTMENT OF CLINICAL CHEMISTRY IN KRISTIANSTAD THERESE VELIN Velin, T. Procalcitonin as a marker for sepsis and bacterial infection. Evaluation of a new method at the department of Clinical chemistry in Kristianstad. Degree Project, 15 Credit Points. Biomedical Laboratory Science, Malmö University: Health and Society, Department of Biomedical Laboratory Science, Procalcitonin is a 116 amino acid prohormone, normally produced in the thyroid c-cells and in the neuroendocrine cells in the lungs, in response to hypercalcemia. In infections and sepsis bacterial lipopolysaccharides and different cytokines stimulate cells throughout the body to produce procalcitonin. Several trials have been carried out to evaluate how measurements of procalcitonin can be used, partly to separate bacterial infections from non-bacterial, and partly to guide individual treatment with antibiotics. In these studies the use of antibiotics could be reduced, reducing the risk of developing bacterial resistance and the cost of treatment. The purpose of this trial is to investigate a new method for procalcitonin assay. The method is an automated immunoassay on an existing instrument in the department of Clinical chemistry in Kristianstad. Blood specimens from the departments of Clinical chemistry in Lund, who uses the same method and Malmö, who uses another automated immunoassay, were compared to the present method. Good agreement was found between Kristianstad and Lund, while the relationship between Kristianstad and Malmö was slightly weaker. Precision between days was satisfactory, totalling 4,5 % on the low control and 1,9 % on the high control. Precision within series was excellent, 1,4 % on average. Keywords: antibiotic use, bacterial resistance, Elecsys Brahms PCT, precision, procalcitonin, stability 3

4 INNEHÅLLSFÖRTECKNING INLEDNING 5 Prokalcitonin 5 Kortare antibiotikabehandling 5 Individuellt anpassad behandling 6 Prokalcitonin som prognosmarkör 7 Då PCT saknar diagnostiskt värde 8 Mätprincip Elecsys BRAHMS PCT 8 Mätprincip PCT sensitive kryptor 8 Syfte 8 MATERIAL OCH METOD 9 Prover 9 Lund 9 Malmö 9 Hållbarhet 9 Mellanserieprecision 9 Inomserieprecision 9 Statistisk analys 9 RESULTAT 10 Jämförelse Kristianstad-Lund 10 Jämförelse Kristianstad-Malmö 11 Hållbarhet 11 Mellanserieprecision 12 Inomserieprecision 13 DISKUSSION 13 Jämförelse Kristianstad-Lund 13 Jämförelse Kristianstad-Malmö 13 Hållbarhet 14 Mellanserieprecision 15 Inomserieprecision 15 Slutsats 15 REFERENSER 16 4

5 INLEDNING Sepsis är ett systematiskt inflammatoriskt svar på en infektion orsakad av bakterier, virus, svamp eller parasiter. Orsakas ett systematisk inflammatoriskt svar av en annan orsak än infektion, som till exempel brännskada eller blödning, kallas tillståndet systemiskt inflammationsresponssyndrom (SIRS) [1]. Det är av stor vikt att snabbt skilja sepsis från SIRS eftersom sepsis kräver omedelbar antibiotikabehandling medan antibiotika inte behövs vid enbart SIRS. Flera markörer har testats för att skilja sepsis från SIRS. I en studie där man utvärderade användbarheten av prokalcitonin (PCT) vid sepsis mättes C-reaktivt protein (CRP), PCT och cytokinerna interleukin 2, 6 och 8 (Il-2, Il-6, Il-8) samt tumor necrosis faktor alfa (TNFα). PCT hade klart högst sensitivitet och specificitet (85/91) följt av Il-8 (68/57) och Il-2 (63/55) [1]. Även en annan studie om värdet av PCT, Il-8 och Il-6 hos kritiskt sjuka patienter visade att PCT hade högst sensitivitet och specificitet. Denna visade också att PCT-värdet under de första 48 timmarna väl speglade utfallet hos patienterna. Ett högt värde som sjönk sakta eller inte alls under dessa timmar var associerat med en dålig prognos, medan ett sjunkande värde var associerat med återhämtning. Högst prognosvärde för död i sepsis var ett Il-6 värde över 1000 pg/ml vid inskrivning. Dock kunde nivåerna av Il-6 och Il-8 vara förhöjda fortfarande 8 dagar efter sjukdomsstart, trots behandling med antibiotika och återhämtning. Il-6 och Il-8 ökar dessutom vid inflammation oavsett om ursprunget är bakteriellt eller inte, vilket gör dem mindre användbara vid diagnos av sepsis versus SIRS. PCT är däremot mer specifikt för bakteriell infektion [2]. Prokalcitonin Kalcitonin är ett hormon som produceras av tyreoideas parafollikulära celler, de så kallade c-cellerna. Vid hyperkalcemi utsöndras kalcitonin som hämmar osteoklasternas aktivitet, så att bennedbrytningen minskar och kalciumnivån i plasma sjunker. Kalcitonin används även som markör för medullär tyroideacancer [3]. PCT är prohormon till kalcitonin och består av 116 aminosyror [4]. PCT bildas normalt genom uttryck av CALC-I genen i tyroideas c-celler och i neuroendokrina celler i lungorna [5]. Vid sepsis och bakteriella infektioner ökar PCT i serum markant och består då endast av 114 aminosyror, de första två aminosyrorna saknas [6], och PCT-ökningen leder inte till ökad kalcitoninhalt i serum [7]. Vid sepsis uttrycks CALC-I genen i celler i hela kroppen istället för bara i c-cellerna i tyroidea och i lungornas neuroendokrina celler [5]. Uttrycket induceras dels av toxiner från bakterier, LPS, och dels av cytokiner som produceras i kroppen vid inflammatoriskt svar. Cytokinerna IL-1β och TNFα stimulerar induktionen av PCT medan interferon gamma, som främst finns vid virusinfektion, fungerar som antagonist och dämpar ökningen [8]. Kortare antibiotikabehandling Långtidsbehandling med antibiotika ökar det selektiva trycket på bakterierna i vårt samhälle. Detta leder till att de bakterier som är resistenta mot antibiotika selekteras och överlever. Dessutom är följsamheten hos patienterna sämre vid längre tids behandling, dels på grund av att man glömmer att ta antibiotikan, dels på grund av att fler biverkningar drabbar patienterna vid längre tids behandling och som leder till att kuren får avslutas i förtid. Den dåliga följsamheten bidrar också till ökad resistens. Genom att använda en kortare behandling med högre dos 5

6 minskar det selektiva trycket på bakterien och dessutom minskas biverkningarna, som ibland beror på att normalfloran slås ut [9]. I en fransk studie undersöktes utfallet efter antingen 8 eller 15 dagars antibiotikabehandling av patienter inlagda på intensivvårdsavdelning. Patienterna var mekaniskt ventilerade och misstanke fanns om ventilationsassocierad pneumoni, VAP. Man fann inga fördelar med 15 dagars behandling. Antal dagar på intensivvårdsavdelningen, antal dagar med mekanisk ventilation, antal dagar utan organsvikt, antal dödsfall och status när patienterna skrevs ut var liknande i båda grupperna. Det man vann på att behandla endast 8 dagar var fler antibiotikafria dagar. Dessutom upptäcktes att vid återfall i lunginflammation uppstod oftare infektioner med multiresistenta bakterier i gruppen som hade behandlats i 15 dagar [10]. Förutom vinsterna i minskad antibiotikaresistens minskar riskerna för biverkningar som diarré, kräkningar och utslag med kortare behandlingstid [11]. I PROHosp, en studie som visar en minskning av den genomsnittliga behandlingstiden med antibiotika med 29,3 % med hjälp av PCT-guidning, minskade även illamående, diarré och utslag med 7,2 % [12]. Individuellt anpassad behandling Det vore givetvis idealiskt om man i varje enskilt fall kunde styra antibiotikaanvändningen med en markör för bakteriell infektion istället för att försöka reducera behandlingstiden generellt [10]. Eftersom PCT ökar i serum vid bakteriella infektioner har många studier gjorts i ämnet. PCT har dels använts för att skilja bakteriella infektioner från infektioner orsakade av virus och dels för att avgöra när patienten är färdigbehandlad. I olika studier har PCT visats ha signifikant högre sensitivitet och specificitet än CRP vid diagnos av bakteriell pneumoni hos barn [13] respektive vid diagnos av VAP [14]. Ett flertal studier har gjorts för att undersöka om utfallet blir lika bra med PCT-guidad antibiotikaterapi istället för terapi som bygger på traditionella riktlinjer inom vården vid sepsis och pneumoni [12, 15-18]. I alla dessa studier var antibiotikaexponeringen mindre i grupperna som baserade behandlingen på mätningar av PCT jämfört med kontrollgrupperna, som baserade behandlingen på befintliga riktlinjer, och detta utan några negativa effekter på utfallet. Dessutom rapporterades kortare intensivvårdsbehandling i ett par av studierna [15-16]. Man har använt sig av olika PCT-värden för att avbryta eller inte påbörja behandling, men ett PCT < 0,25 µg/l rekommenderas generellt som gränsen då bakteriell infektion inte är trolig och behandling inte bör initieras eller bör avslutas [12, 16-18]. Initiering eller fortsatt behandling vid PCT-värden > 0,25 µg/l rekommenderas och med ett PCT-värde > 0,50 µg/l rekommenderas starkt fortsatt eller initierad behandling [12, 18]. Vid riktigt höga PCT-värden initialt (>10 µg/l) rekommenderas att antibiotikabehandlingen avslutas när PCT-värdet har minskat med 80 % och rekommenderas starkt när PCT-värdet har minskat med 90 % [12]. Intervallen mellan PCT-mätningarna skiljer sig åt i studierna. En del studier använder sig av dagliga mätningar från början [16] medan andra avvaktar till tredje dagen efter initierad behandling innan andra mätningen [12, 17] och sedan dagliga mätningar [17] eller mätningar varannan dag [12]. Inom primärvården har värdet av PCT som markör för bakteriell infektion undersökts i en studie i Schweiz [19]. Denna studie riktade in sig på akuta luftvägsinfektioner. Patienter som sökte för akut luftvägsinfektion och som 6

7 läkaren hade tänkt skriva ut antibiotika till randomiserades till en grupp med PCTguidad behandling eller till en kontrollgrupp som behandlades efter gällande riktlinjer. I PCT-gruppen användes samma gränsvärden som beskrivna ovan [12, 18] och mätning av PCT 3 dagar efter initierad behandling utfördes för reevaluering av behandling. Det utfall studien främst riktade in sig på var hur begränsad patienten blev av luftvägsinfektionen i sina dagliga aktiviteter i respektive grupp. I PCT-gruppen var patienterna i genomsnitt bara begränsade 0,1 dag längre än i kontrollgruppen, dvs. skillnaden mellan grupperna var minimal. Dessutom var medelantalet dagar som patienterna upplevde biverkningar som ont i magen, diarré, illamående, kräkningar och utslag signifikant lägre i PCTgruppen. Behandlingseffekten var liknande i båda grupperna. Den största vinsten var minskningen i antibiotikautskrivning. I PCT-gruppen fick 25 % av patienterna antibiotika utskrivet och i kontrollgruppen 97 % av patienterna, alltså 72 procentenheter lägre utskrivning av antibiotika. Behandlingens varaktighet minskade med en dag i genomsnitt i PCT-gruppen [19]. Ett annat sjukdomstillstånd som vinner på snabb differentiering av bakteriellteller virusursprung är meningit hos barn. Om meningiten är orsakad av bakterier krävs omedelbar antibiotikabehandling. I fem olika länder i Europa jämfördes PCT, CRP, leukocyter, neutrofila granulocyter i blod och protein, glukos, leukocyter och neutrofila granulocyter i cerebrospinalvätska för att se vilken biologisk markör som bäst kunde skilja bakteriell meningit från virusorsakad meningit hos barn. Vid tröskelvärdet 0,5 ng/ml hade PCT den högsta sensitiviteten och specificiteten (95 % respektive 83 %) bland barn på akuten. Man kom fram till att PCT är den bästa biologiska markören för att diagnostisera bakteriell meningit hos barn [20]. På hjärtkirurgipatienter kan det vara svårt att skilja den inflammatoriska processen efter operationen från en bakteriell infektion. En studie gjordes mellan januari och juni 2003 på patienter som skulle genomgå hjärt-lung-bypass. Blodprover togs på patienterna både innan operationen och sedan varje dag under en vecka efter operationen. Proverna inkluderade CRP och leukocytanalys, som specialisterna som bedömde patientens tillstånd fick ta del av, och PCT, Il-6 och Il-8, som specialisterna inte fick ta del av vid bedömning av patienten. Specialisterna delade upp patienterna i två grupper, beroende på om de bedömts vara infekterade eller icke-infekterade. De båda gruppernas prover jämfördes sedan. Den markör som hade bäst sensitivitet och specificitet var PCT, som efter andra dagen efter operationen hade en sensitivitet på 93 % och en specificitet på 80 % vid tröskelvärdet 1,5 ng/ml. Man kom fram till att läkarna hade kunnat ställa diagnos tidigare med hjälp av PCT och även behandla infektionen tidigare [21]. Prokalcitonin som prognosmarkör Vid pankreatit kan PCT hjälpa till att bedöma svårighetsgraden på sjukdomen. En studie i Europa visade att PCT-värdet följer svårighetsgraden bra och är som högst vid patienter med pankreatit, organsvikt i flera organ och infekterad nekros. Man kunde med hjälp av PCT identifiera de patienter som löpte risk att utveckla de svåraste komplikationerna, infekterad nekros och död [22]. Även vid en studie av VAP, visade sig PCT-värdet användbart för att prediktera utfallet. De som dog hade signifikant högre PCT-värden vid ankomsten till sjukhuset än de som överlevde [17]. Mönstret var samma efter hjärtkirurgi, där 7

8 man såg ökade värden hos dem med sämst chanser att överleva och de som dog hade signifikant högre PCT-värden än de som överlevde [21]. Då PCT saknar diagnostiskt värde Vid appendicit däremot, har PCT inte visat sig ha något diagnostiskt värde. Bara 14,3 % av patienterna med appendicit visade ett förhöjt PCT. Det var först vid allvarlig inflammation som man såg en ökning av PCT, speciellt vid brustet blindtarmsbihang. Deras teori om varför denna infektion i regel inte orsakar höjning av PCT-värdet är att vid appendicit sker inte translokation av bakterier till lymfkörtlarna i så stor utsträckning, vilket skulle leda till att bakterielipopolysackarider inte kommer ut i kroppen. En annan teori är att det kan vara virus som ursprungligen är orsaken till inflammationen i appendix [23]. Inte heller vid diagnosticering av borrelios är man hjälpt av PCT [24]. Mätprincip Elecsys BRAHMS PCT Patientprovet blandas med reagens som innehåller biotinylerade antikroppar riktade mot PCT och ruteniummärkta antikroppar riktade mot PCT. Provet inkuberas i nio minuter så att antikropparna kan binda in till PCT i provet och bilda ett sandwichkomplex med PCT i mitten. Streptavidinklädda mikropartiklar som är magnetiska tillsätts provet. Inkubering i ytterligare nio minuter då det biotinylerade antigenet binder in till de magnetiska mikropartiklarna som är täckta av streptavidin. Blandningen transporteras sedan till mätcellen där en magnet aktiveras så att sandwichkomplexen med mikropartiklar fångas upp och blir kvar i mätcellen medan obundet material från provet och överblivna antikroppar lätt kan tvättas bort. Detektionssteget baseras på elektrokemiluminiscens. Tripropylamin tillsätts och spänning läggs på, vilket leder till att ljus emitteras, vars intensitet mäts av fotomultiplikator. Intensiteten av ljuset är direkt proportionell mot mängden prokalcitonin i provet [25]. Mätprincip PCT sensitive kryptor Provet blandas med reagens innehållande polyklonala anti-kalcitonin-antikroppar konjugerade med kryptat och sedan reagens med monoklonala anti-katakalcin antikroppar konjugerade med XL 665 (kalcitonin och katakalcin är delar av PCT). När ett prov träffas av en kvävelaser (337 nm) exciteras kryptat och avger en lång fluorescerande signal vid 620 nm, acceptorn fångar upp signalen och avger en kort signal (nanosekunder) vid 665 nm. Då PCT finns i provet bildas immunkomplex med PCT mellan antikropparna. När immunkomplex bildats kommer donatorn och acceptorn tillräckligt nära för att amplifiering ska ske så att signalen förstärks och signalen från acceptorn fördröjs, vilket ger en längre signal (mikrosekunder). Den förlängda fluorescerande signalen är proportionell mot koncentrationen av prokalcitonin i provet. Metoden är helt utan tvättsteg som ingår i många andra immunologiska sandwichmetoder. Tack vare fördröjningen av signalen kommer de korta signalerna från obundet XL 665 inte med i mätningen [26]. Syfte Syftet är att sätta upp en ny metod för PCT på klinisk kemi i Kristianstad. Detta kan leda till att intensivvårdsavdelningen får tillgång till en markör för bakteriell infektion för att lättare och snabbare kunna identifiera de patienter som behöver antibiotika och anpassa behandlingstiden efter patienternas individuella behov. I längden innebär detta förhoppningsvis minskad antibiotikaanvändning och minskad bakterieresistens. 8

9 MATERIAL OCH METOD Cobas 6000 (Roche AB, Stockholm, Sverige), Elecsys BRAHMS PCT reagent kit, kalibratorer: Cal1 och Cal2, kontrollmaterial: PC PCT 1 och PC PCT 2 (Roche AB, Stockholm, Sverige). Patientprover analyserade på Klinisk Kemi i Lund (på Cobas 6000 från Roche AB, Stockholm, Sverige), patientprover analyserade på Klinisk Kemi i Malmö (på BRAHMS Kryptor från BRAHMS Aktiengesellschaft, Kungsängen, Sverige). Prover Samtliga analyser utfördes på Klinisk Kemi i Kristianstad. Lund Nitton plasmaprover tagna i litiumheparinrör, analyserade i Lund, nedfrysta efter mätning på Lunds instrument och skickade frysta valdes ut. Urvalet gjordes för att täcka så mycket av mätområdet som möjligt, ur det material som skickats. Provernas koncentration varierade mellan 0,111 ng/ml och 14,27 ng/ml. Proverna tinades, blandades på vortex och centrifugerades för att minimera fibrintrådar som kunde störa analysen. Malmö Tretton serumprover tagna i SST-rör analyserades, nedfrysta efter analys på BRAHMS Kryptor i Malmö, skickade på kolsyreis. Provernas koncentration varierade mellan 0,09 ng/ml och 49,7 ng/ml. Hållbarhet Sju prover från Lund, som hade lite större mängd plasma, tinades upp och analyserades för att kontrollera hållbarheten vid 4 C. De analyserades sedan efter 24 timmar och 48 timmar. Mellanserieprecision Kontroller i låg och hög nivå analyserades vid 17 olika dagar för att kontrollera mellanserieprecisionen. Efter 11 mättillfällen byttes reagens, kalibratorer och instrumentets mätceller ut. Inomserieprecision Ett av proverna ifrån Malmö analyserades sex gånger och ett annat sju gånger vid samma tillfälle. Proverna analyserades av samma person, på samma instrument, inom en timme för att kontrollera inomserieprecisionen. Statistisk analys Jämförelserna utvärderades med regressionsanalys och Bland-Altman analys. Bland-Altman är baserad på plott av metodernas differenser mot medelvärdet av metoderna. Medelvärdet av differenserna representerar uppskattad bias, det systematiska felet mellan de två metoderna. Medeldifferensen plus minus två standarddeviationer definierar Limits of Agreement (LOA), de gränser inom vilka 95 % av differenserna återfinns. I detta försök har differensen procentuellt mot medelvärdet använts. Samma metod användes för att jämföra Kristianstads mätningar med Malmös. Hållbarhetsförsöket utvärderades med Wilcoxons test för parvisa mätvärden. Variationskoefficient och standardavvikelse räknades ut för 9

10 samtliga kontroller, först för alla värden innan reagens- och kalibratorbyte, sedan totalt för hela perioden. Mätvärdena plottades även i diagram mot mättillfälle. På två av proverna från Malmö räknades medelvärde, standardavvikelse (SD) och variationskoefficient (CV) ut för att kontrollera inomserieprecisionen. SPSS (17.0 SPSS Inc., Chicago, Illinois) användes för majoriteten av beräkningarna. RESULTAT Resultaten för de olika försöken presenteras under respektive rubrik. Jämförelse Kristianstad-Lund Totalt 19 prover inkluderades i mätningarna, koncentrationerna blev mellan 0,085 och 16,89 ng/ml. Korrelationen mellan mätningarna i Kristianstad och referensmetoden, i detta fall mätningar på Lunds instrument, visas i diagram 1. Diagram 1. Korrelationen mellan Kristianstads och Lunds mätningar av PCT. Linjen representerar regressionslinjen. Det vänstra diagrammet innehåller alla mätvärden, i det högra är ett mätvärde exkluderat. Ett mätvärde uppvisade större skillnad mellan laboratorierna. För att värdera dess inflytande gjordes regressionsanalysen både med och utan denna punkt (diagram 1). Pearson korrelationen mellan Kristianstad och Lunds metoder blev 0,995 med alla mätvärden inkluderade, med ett mätvärde exkluderat blev det 0,994. Den linjära regressionen mellan Kristianstads mätvärden (y) och Lunds mätvärden (x) anges av ekvationen: y = 1,132x - 0,045 med alla mätvärden inkluderade och y = 1,054x + 0,178 då ett är exkluderat. Differensen procentuellt mot medelvärdet av resultaten varierar mellan 28,6 % och + 26,5 % med ett medelvärde på 8,77 %. LOA beräknades till 30,8 % och + 13,24 % (se diagram 2). 10

11 Diagram 2. Bland-Altmandiagram med differensen procentuellt av medelvärdet mellan Lunds och Kristianstads mätningar mot medelvärdet av mätningarna. Jämförelse Kristianstad-Malmö De tretton proverna uppmättes i Kristianstad till mellan 0,083 och 63,83 ng/ml. Korrelationen mellan mätningarna i Kristianstad och referensmetoden, system Kryptor i Malmö, visas i diagram 3. Diagram 3. Korrelationen mellan Kristianstads och Malmös mätningar av PCT. Linjen representerar regressionslinjen. Pearson korrelationen mellan Kristianstad och Malmös metoder blev 0,95. Den linjära regressionen mellan Kristianstads mätvärden (y) och Malmös mätvärden (x) anges av ekvationen: y = 0,863x+2,574. Differensen procentuellt mot medelvärdet av resultaten varierar mellan 55, 5 % och + 24,9 % med ett medelvärde på 3,2 %. LOA beräknades till 43,3 % och +37,0 % (se diagram 4). 11

12 Diagram 4. Bland-Altmandiagram med differensen procentuellt av medelvärdet mellan Malmös och Kristianstads mätningar mot medelvärdet av mätningarna. Hållbarhet Mätvärdena mätta vid tid 0, 24 timmar och 48 timmar visas i tabell 1. Skillnaderna i mätvärden mellan 0 och 24 timmar, eller mellan 0 och 48 timmar var inte signifikanta med Wilcoxons test för parvisa mätvärden. Tabell 1. Visar hur mätvärden på prover förändrades med tiden vid förvaring i kylskåp. Prov 0-värde Efter 24 h Efter 48 h 1 1,60 1,59 1,50 2 1,91 1,87 1,23 3 0,71 0,72 0,49 4 0,042 0,039 0, ,081 0,074 0, ,124 0,126 0, ,621 0,589 0,603 Medelvärde 0,727 0,715 0,579 Mellanserieprecision Mätvärdena på låg och hög kontroll vid den första perioden med samma reagens, mätceller och kalibratorer visas i tabell 2. Tabell 3 inkluderar byte av reagens, mätceller och kalibratorer. Mätvärdena på den låga kontrollen under totalt 17 dagar hamnade mellan 0,47 och 0,54 ng/ml och den höga hamnade mellan 9,64 och 10,33 ng/ml (se tabell 3). Kontrollernas fördelning visas i diagram 5 och 6, angiven SD i diagrammen är leverantörens rekommenderade. Tabell 2. Kontroll namn; lot nummer PC PCT PC PCT Kontroll värde Mellanserieprecision med kontroller mätta vid 11 olika dagar. Åsatt intervall Erhållet intervall Medel värde 0,50 0,40-0,61 0,50-0,54 0,52 0,014 2,7 SD CV (%) 10,0 8,20-11,80 9,73-10,33 10,0 0,196 2,0 12

13 Tabell 3. Kontroll namn; lot numme PC PCT PC PCT Mellanserieprecision totalt. Kontroller mätta 17 dagar inklusive byte av reagens, kalibratorer och mätceller. Kontroll värde Åsatt intervall Erhållet intervall Medel värde 0,50 0,40-0,61 0,47-0,54 0,51 0,023 4,5 10,0 8,20-11,80 9,64-10,33 9,91 0,187 1,9 SD CV (%) Diagram 5. Den låga kontrollens fördelning vid olika mättillfällen. Diagram 6. Den höga kontrollens fördelning vid olika mättillfällen. Inomserieprecision Resultatet av mätningen av två av proverna från Malmö som mättes upprepade gånger inom en timme av samma person, på samma instrument visas i tabell 4. Variationskoefficienten blev i genomsnitt 1,4 % på de båda proverna (se tabell 4). Tabell 4. Prov n Malmös värde Inomserieprecision på två prover mätta 6 respektive 7 gånger. Erhållet intervall Medelvärde Prov ,1 13,79-14,43 14,12 0,23 1,6 Prov ,6 31,31-32,20 31,84 0,37 1,2 SD CV (%) DISKUSSION Resultaten för de olika försöken diskuteras under respektive rubrik. Jämförelse Kristianstad-Lund Jämförelsen resulterade i en utmärkt överensstämmelse, med ett mycket litet intercept och lutning nära 1,0. Lutningen av regressionslinjen som var 1,13 med alla punkter inkluderade sjönk mot 1,0 när ett enstaka mätvärde exkluderades. Det är dock oklart om något hänt med just detta prov som gjorde att en uteslutning var strikt motiverad, och det är därför inkluderat i övriga beräkningar. Spridningen av differenserna i Bland-Altmandiagrammet får betraktas som låg jämfört med andra studier som jämför andra metoder av PCT [27]. Man kan se en bias, dvs. ett systematiskt fel. Kristianstads mätvärden ligger systematiskt högre än Lunds. 13

14 Detta beror troligtvis på problem med kalibreringarna vid första reagensförpackningen. De första två kalibreringarna gick inte in eftersom skillnaden mellan dubbelproverna på den låga kalibreringspunkten var för stor. Inställningarna i instrumentet ändrades efter inrådan av Roche så att kalibratorerna bytte plats. Bytet innebär att den höga kalibreringspunkten mäts före den låga. Kalibrering utfördes sedan utan problem. Kontroller analyserades och var inom godkänt område. Innan nästa reagensförpackning sattes i och kalibrerades byttes instrumentets mätceller. Vid kalibrering av nästa reagensförpackning gick kalibreringen in vid första försöket med kalibratorerna enligt orginalinställningarna, vilket troligtvis gav en mer korrekt kalibrering. Mätningarna av den låga kontrollen i mellandagsprecisionen gav i genomsnitt 8 % lägre värden efter mätcellsbytet och omkalibreringen än innan. Troligtvis hade även de flesta proverna som låg i samma mätområde som den låga kontrollen varit lägre om de hade mätts efter omkalibreringen. Jämförelse Kristianstad-Malmö Det linjära sambandet är tillfredställande. Bland-Altman diagrammet visar ett något större LOA relativt Lund. Detta är naturligt med tanke på att här jämförs två olika metoder, medan det tidigare var samma metod på olika laboratorier. Jämfört med en annan metodjämförelse av PCT Lumitest och PCT-Kryptor är LOA hälften så stor i denna undersökning [27]. Tidigare jämförelser som har gjorts mellan Brahms Kryptor och Roches Cobas visar god överensstämmelse, men diagram där differenserna är plottade mot medelvärdet saknas [28]. Jag vet inte hur länge proverna har varit frusna i Malmö och hur detta har påverkat koncentrationerna. I en studie testades hur PCT-koncentrationen påverkades vid 24 timmars frysning. Det visade sig att koncentrationen kunde variera med upp till 10 % [29]. I en annan studie utvärderades hur långtidsfrysning påverkade PCTkoncentrationen. Då analyserades stora mängder prover, 198 respektive 192, som hade varit nedfrysta vid 80 C under 4,8 till 5,5 år respektive 3,3 till 4,6 år. Dessa provers koncentration hade minskat med 11,4 % i första gruppen och 13,5 % i andra gruppen [30]. Frysningen kan ha påverkat PCT-koncentrationen även på de prover som använts vid denna undersökning. Eventuellt kan en del av spridningen förklaras med att proverna varit frysta en längre tid. En annan faktor som kan ha påverkat spridningen är blandningen av proverna. De första tio proverna blandades genom att vända provrören, vilket kan ha varit otillräckligt, medan de sista tre blandades på vortex. Hållbarhet Wilcoxons test för parvisa mätvärden visade inte någon signifikant skillnad mellan tidpunkterna 24 timmar eller 48 timmar jämfört med ursprungsvärdet. Några av proverna var förvånansvärt stabila, medan andra sjönk kraftigt efter 48 timmar. På grund av att vissa prover minskade kraftigt vill jag ändå inte rekommendera längre tids förvaring vid 4 C än 24 timmar innan mätning sker. Frånvaron av signifikans kan sannolikt förklaras med att antalet observationer var relativt få. Det är möjligt att resultatet hade blivit annorlunda om jag hade haft fler prover och prover med högre koncentrationer. Det är dock svårt att få tag i prover med höga koncentrationer. Vid en evaluering av Kryptor system undersöktes även hållbarheten vid 4 C. I den undersökningen var det fortfarande efter 4 dagar ingen statistiskt säkerställd skillnad mellan mätresultaten [27]. Hållbarheten bör undersökas vidare med färska prover och med tätare tidsintervall. Mina prover var frysta och jag vet inte hur lång tid det tog innan de frystes in, eller om frysning påverkar stabiliteten efter upptining av provet. Tätare tidsintervall kan vara 14

15 intressant med tanke på prover som transporteras från vårdcentraler in till laboratoriet. Ibland kan det ta längre tid än 24 timmar innan provet kommer till instrumentet så det kan vara av stort värde att kontrollera stabiliteten vid till exempel 30 och 36 timmar. Mellandagsprecision Precisionen var tillfredsställande. Variationskoefficienten var mycket låg (2,7 % och 2,0 %) på de första 11 mätvärdena som analyserades med samma reagens, kalibratorer och mätceller, och fortfarande låg (4,5 % och 1,9 %) på totalt 17 mätvärden som inkluderade reagens-, kalibrator- och mätcellsbyte. Leverantören har i sin test av den totala precisionen på instrumentet fått en variationskoefficient på 3,2 % på den låga kontrollen och 2,3 % på den höga [25]. Resultaten här stämmer väl med den undersökningen. Variationskoefficienten är låg jämfört med den biologiska variationen hos friska individer (CV intraindividuell = 16 %) [31]. Leverantörens kontrollvärde ligger inom det erhållna intervallet vilket visar på god noggrannhet, medelvärdet av mina mätningar ligger nära det åsatta värdet på kontrollerna. Reagenset och kalibreringen visade sig vara stabila, mätvärdena låg inom en standardavvikelse utom vid ett tillfälle på den låga kontrollen. Även efter mätcells-, kalibrator- och reagensbyte låg kontrollerna stabilt. Inomserieprecision Precisionen inom serien var mycket god med en variationskoefficient på 1,2 % respektive 1,6 %. I en evaluering av Kryptor blev variationskoefficienten, i samma mätområde som mina prover, mellan 0,70 % och 3,14 % [27]. Tillverkaren har i sina tester fått en variationskoefficient på sina mätningar inom serien på 2,6 % på den låga kontrollen och 1,9 % på den höga kontrollen och 1,1 % på ett patientprov med koncentrationen 54,4 ng/ml [25]. Mina mätningar stämmer inte helt koncentrationsmässigt, men ligger bra i jämförelse. Slutsats Metoden visade sig ha mycket god överensstämmelse med metoder på andra laboratorier och utmärkt precision, både inomserie och mellanserie. Proverna bör analyseras inom 24 timmar tills hållbarheten testats vidare, eftersom en del av proverna sjönk mycket efter 48 timmar. Laboratoriet kan dock ha nytta av en något vidare tidsgräns innan analys utförs om provet transporteras från vårdcentral. 15

16 REFERENSER 1. BalcI C., Sungurtekin H., Gurses E., Sungurtekin U., Kaptanoglu B (2003) Usefulness of procalcitonin for diagnosis of sepsis in the intensive care unit. Crit.Care, 7(1): Harbarth S., Holeckova K., Froidevaux C., Pittet D., Ricou B., Grau G. E., et al (2001) Diagnostic value of procalcitonin, interleukin-6, and interleukin-8 in critically ill patients admitted with suspected sepsis. Am.J.Respir.Crit.Care Med, 1;164(3): Copp D. H (1970) Calcitonin and calcium metabolism. Can.Med.Assoc.J, 17;103(8): Becker K. L., Nylen E. S., White J. C., Muller B., Snider R. H., Jr. Clinical review 167 (2004) Procalcitonin and the calcitonin gene family of peptides in inflammation, infection, and sepsis: a journey from calcitonin back to its precursors. J.Clin.Endocrinol.Metab, 89(4): Muller B., White J. C., Nylen E. S., Snider R. H., Becker K. L., Habener J. F (2001) Ubiquitous expression of the calcitonin-i gene in multiple tissues in response to sepsis. J.Clin.Endocrinol.Metab, 86(1): Weglohner W., Struck J., Fischer-Schulz C., Morgenthaler N. G., Otto A., Bohuon C., et al (2001) Isolation and characterization of serum procalcitonin from patients with sepsis. Peptides, 22(12): Ittner L., Born W., Rau B., Steinbach G., Fischer J. A (2002) Circulating procalcitonin and cleavage products in septicaemia compared with medullary thyroid carcinoma. Eur.J.Endocrinol, 147(6): Linscheid P., Seboek D., Nylen E. S., Langer I., Schlatter M., Becker K. L., et al (2003) In vitro and in vivo calcitonin I gene expression in parenchymal cells: a novel product of human adipose tissue. Endocrinology, 144(12): File T. M.,Jr (2004) Clinical efficacy of newer agents in short-duration therapy for community-acquired pneumonia. Clin.Infect.Dis, 1;39 Suppl 3:S Chastre J., Wolff M., Fagon J. Y., Chevret S., Thomas F., Wermert D., et al (2003) Comparison of 8 vs 15 days of antibiotic therapy for ventilatorassociated pneumonia in adults: a randomized trial. JAMA, 19;290(19): Gulani A., Sachdev H. P., Qazi S. A (2010) Efficacy of short course (<4 days) of antibiotics for treatment of acute otis media in children: a systematic rewiew of randomized controlled trials. Indian Pediatr, 7;47(1):

17 12. Schuetz P., Christ-Crain M., Thomann R., Falconnier C., Wolbers M., Widmer I., et al (2009) Effect of procalcitonin-based guidelines vs standard guidelines on antibiotic use in lower respiratory tract infections: the ProHOSP randomized controlled trial. JAMA, 9;302(10): Khan D. A., Rahman A., Khan F. A (2010) Is procalcitonin better than C- reactive protein for early diagnosis of bacterial pneumonia in children? J.Clin.Lab.Anal, 24(1): Ramirez P., Garcia M. A., Ferrer M., Aznar J., Valencia M., Sahuquillo J. M., et al (2008) Sequential measurements of procalcitonin levels in diagnosing ventilator-associated pneumonia. Eur.Respir.J, 31(2): Hochreiter M., Kohler T., Schweiger A. M., Keck F. S., Bein B., von Spiegel T., et al (2009) Procalcitonin to guide duration of antibiotic therapy in intensive care patients: a randomized prospective controlled trial. Crit.Care, 13(3):R Nobre V., Harbarth S., Graf J. D., Rohner P., Pugin J (2008) Use of procalcitonin to shorten antibiotic treatment duration in septic patients: a randomized trial. Am.J.Respir.Crit.Care Med, 1;177(5): Stolz, D., Smyrnios, N., Eggimann, P., Pargger, H., Thakkar, N., Siegemund, M., Marsch, S., Azzola, A., Rakic, J., Mueller, B and Tamm, M. (2009) Procalcitonin for reduced antibiotic exposure in ventilator-associated pneumonia: a randomised study. The European respiratory journal : official journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology. 34(6): Christ-Crain M., Stolz D., Bingisser R., Muller C., Miedinger D., Huber P. R., et al (2006) Procalcitonin guidance of antibiotic therapy in communityacquired pneumonia: a randomized trial. Am.J.Respir.Crit.Care Med, 1;174(1): Briel M., Schuetz P., Mueller B., Young J., Schild U., Nusbaumer C., et al (2008) Procalcitonin-guided antibiotic use vs a standard approach for acute respiratory tract infections in primary care. Arch.Intern.Med, 13;168(18):2000-7; discussion Dubos F., Korczowski B., Aygun D. A., Martinot A., Prat C., Galetto-Lacour A., et al (2008) Serum procalcitonin level and other biological markers to distinguish between bacterial and aseptic meningitis in children: a European multicenter case cohort study Arch.Pediatr.Adolesc.Med, 162(12): Jebali M. A., Hausfater P., Abbes Z., Aouni Z., Riou B., Ferjani M (2007) Assessment of the accuracy of procalcitonin to diagnose postoperative infection after cardiac surgery. Anesthesiology, 107(2): Rau B. M., Kemppainen E. A., Gumbs A. A., Buchler M. W., Wegscheider K., Bassi C., et al (2007) Early assessment of pancreatic infections and overall prognosis in severe acute pancreatitis by procalcitonin (PCT): a prospective international multicenter study. Ann.Surg, 245(5):

18 23. Sand M., Trullen X. V., Bechara F. G., Pala X. F., Sand D., Landgrafe G., et al (2009) A prospective bicenter study investigating the diagnostic value of procalcitonin in patients with acute appendicitis. Eur.Surg.Res, 43(3): Lotric-Furlan S., Maraspin-Carman V., Cimperman J., Ogrinc K., Stopar T., Strle F (2002) Procalcitonin levels in patients with Lyme borreliosis. Wien.Klin.Wochenschr, 31;114(13-14): Roche Diagnostics GmbH (2009), Elecsys insert. Elecsys BRAHMS PCT (medföljer i reagensförpackning) 26. BRAHMS Aktiengesellschaft (2008), BRAHMS PCT sensitive kryptor bruksanvisning. > SENSITIVE_KRYPTOR/ifu_ _sv_R09_brahms-kryptor-pctsensitive.pdf < Steinbach G., Rau B., Debard A-L., et al (2004) Multicenter evaluation of a new immunoassay for procalcitonin meassurement on the Kryptor system. Clin. Chem. Lab. Med, 42(4): Bernstein H-G., Braunewell K-H (2009) Comparison of a new procalcitonin assay from Roche with the established method on the Brahms kryptor. Clin. Chem, 55(5): Algeciras-Schimnich A., Preissner C. M., Theobald J. P., Finseth M. S., Grebe S. K.( 2009) Procalcitonin: a marker for the diagnosis and follow-up of patients with medullary thyroid carcinoma. J.Clin.Endocrinol.Metab, 94(3): Schuetz P., Christ-Crain M., Huber A. R., Muller B.( 2010) Long-term stability of procalcitonin in frozen samples and comparison of Kryptor and VIDAS automated immunoassays. Clin.Biochem, 43(3): Barassi A., Pallotti F., Melzi d'eril G (2004) Biological variation of procalcitonin in healthy individuals. Clin.Chem, 50(10):