Betydelse av provtagningsrör för faktorer i fibrinolysen

Transkript

1 Betydelse av provtagningsrör för faktorer i fibrinolysen Annette Broberg Vårterminen 2014 Examensarbete, 15 hp Biomedicinsk analytikerprogrammet, 180 hp

2 Institutionen för klinisk mikrobiologi Biomedicinsk laboratorievetenskap Biomedicinska analytikerprogrammet Examensarbete 15 hp Kursansvarig lärare: Ylva Hedberg Fransson Significance of Sampling Tubes for Factors in Fibrinolysis Handledare: Johan Hultdin, Medicinsk biovetenskap, klinisk kemi, Umeå universitet Läraropponent: Examinator: Datum för godkännande Maria Hedberg Mari Norgren xx 2

3 Abstrakt I blodbanan sker en konstant växelverkan mellan koagulation och fibrinolys och två viktiga komponenter i denna balans är Tissue Plasminogen Activator (tpa) och Plasminogen Activator Inhibitor-1 (PAI-1), där tpa löser upp korslänkat fibrin till bland annat D-dimer och PAI-1 bromsar upplösningen genom att bilda komplex med tpa. Vid insamling av prover till forskningsprojekt och biobanker är det viktigt att välja provtagningsrör som är användbara för många olika framtida analyser. I denna studie har vi undersökt de tre vanligaste rörtyperna som används vid analys av fibrinolytiska faktorer: citrat-, EDTA- och Stabilyte-rör med avseende på PAI-1-masskoncentration, tpa/pai-1-komplex och D-dimer. Prover från 35 patienter med misstänkt hjärtinfarkt, med avseende på PAI-1-masskoncentration, tpa/pai-1-komplex, CRP samt D- dimer. PAI-1-masskoncentration och tpa/pai-1-komplex, analyserades med ELISA-teknik, CRP med en automatiserad kemiluminiscensbaserad immunoassay, samt D-dimer med latexbaserad immunologisk test. För samtliga analyter uppmättes de högsta nivåerna i EDTA-plasma, särskilt höga nivåer observerades för PAI-1-masskoncentration. Inga stora skillnader noterades för D-dimer och CRP. Efter deminregressionsanalys visades den högsta förklaringsgraden i Stabilyte-plasma jämfört med citratplasma för tpa/pai-komplex, 0,87 respektive för PAI-1-masskoncentration, 0,73. Den inbördes Sperman-korrelationen mellan olika fibrinolytiska parametrar var starkast i Stabilyte-plasma och svagast i EDTA-plasma. Resultaten från denna studie indikerar att Stabilyte-röret är det bästa valet av de tre undersökta rörtyperna vid analys av PAI-1-antigen och tpa/pai-1-komplex. CRP-nivåerna var stabila oavsett vilken rörtyp som användes. I EDTA-rör riskerar man att missa sambanden mellan fibrinolytiska markörer som ses i Stabilyte-plasma. Nyckelord PAI-1-masskoncentration, hemostas, Stabilyte-plasma, citrat-plasma, EDTA-plasma, D-dimer, 3

4 Introduktion Kroppen är en sinnrik organism som hela tiden eftersträvar balans, så även i blodbanan där det hela tiden bildas små koagler som genast löses upp när allt fungerar som det ska (1). Koagulation innebär att blodet under påverkan av olika mekanismer övergår från flytande till geléartad form. Det sker i två steg, primär hemostas och sekundär hemostas (2). Primär hemostas innebär att kärlen kontraheras och trombocyterna aktiveras och detta tar några sekunder. Sekundär hemostas startar med att trombocyten aktiveras på något sätt, t ex som vid en skada i kärlväggen. Tissue Factor (FIII) exponeras och α-granula från de aktiverade trombocyterna frisätts, vilka innehåller ett antal proteiner som von Willebrands faktor (vwf), fibrinogen och koagulationsfaktor V (FV), samt ämnen som får kärlväggen att kontraheras. Protrombin aktiveras till trombin som i sin tur klyver fibrinogen till fibrin som bildar ett nät runt koaglet och på så sätt förstärker det (1). Fibrinogen är också ett akutfasprotein, vilket innebär att det ökar vid inflammatoriska processer, liksom C-reaktivt protein (CRP). Koagulationens främsta uppgift är att stoppa blödning, men olika rubbningar i balansen mellan koagulationsfaktorer och fibrinolysfaktorer kan ge risk för blodproppsbildning och måste naturligtvis hindras (Fig. 1). Därför har kroppen ett fibrinolytiskt system som ser till att lösa upp koagler. Två viktiga komponenter som ser till att hålla balans mellan dessa två system är tissue plasminogen activator (tpa) och plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1). Det inaktiva proteinet plasminogen aktiveras till det fibrinnedbrytande proteinet plasmin av tpa, och omvänt så hämmar PAI-1 fibrinnedbrytning genom att bilda komplex med tpa och därigenom hämma dess aktivitet (3). Nedbrytningsprodukten av korslänkat fibrin är D-dimer som används som ett mått på fibrinolytisk aktivitet av en trombos. Den största andelen av tpa tycks vara komplexbundet till PAI-1, men även till andra hämmare som t.ex. α2-plasmin inhibitor, medan andelen bundet PAI-1 tycks vara lite mer än hälften av allt PAI-1 (Fig. 2). Förutom att PAI-1 har stor betydelse för fibrinolysen har det också identifierats som en markör för venocklusiv sjukdom (VOD), där man kan skilja VOD från andra orsaker till hyperbilirubinemi som t ex graft versus host desease (GVHD) och läkemedelstoxicitet efter benmärgstransplantation. Förhöjda halter av PAI-1 är också epidemiologiskt relaterat till insjuknande i kardiovaskulär sjukdom, typ 2 diabetes, fetma, malignitet, leversjukdom och även under senare delen av graviditet (4-9). Man har dock liten nytta av denna analys på individnivå i kliniska situationer. För att blodet inte ska koagulera efter provtagning kan provet tas i flera olika typer av rör med antikoagulerande tillsatser, vilket som väljs beror på vad som skall analyseras. Citrat-röret innehåller natriumcitrat och förhindrar koagulation genom att natriumcitrat binder Ca 2+ -joner som behövs för att koagulation ska ske. EDTA -röret innehåller etylendiamintetraättiksyra som även den binder kalciumjoner effektivt (2). Stabilyte-röret innehåller 0,5 ml 0,5 mol/l citratbuffert som binder kalciumjoner, och har ph 4,3 som ger blodprovet ett slutligt ph på 5,9. Det sura ph-värdet gör att fibrinolytisk aktivitet näst intill helt upphör och de värden som uppmäts i plasman ganska väl överensstämmer med halterna av samma ämnen i blodbanan (10). I många forskningsprojekt och vid insamling av prover till biobanker tas prover i rör med olika typer av tillsatser för att senare kunna analyseras för skilda syften. Ofta vet forskarna inte i förväg vilka analyter man kommer att vilja studera längre fram. Detta gör att det kan vara svårt att avgöra vilken typ av prov- 4

5 tagningsrör som ska väljas för att så optimalt som möjligt kunna använda det biologiska materialet i framtiden. Syftet med studien var att undersöka de tre vanligast förekommande provtagningsrören, citrat-plasma, EDTA- plasma och Stabilyte-plasma med avseende på analys av PAI-1-masskoncentration, tpa/pai-1- komplex och D-dimer under förutsättning att fibrinogen inte var påtagligt inflammatoriskt påverkat. Ett ytterligare syfte var att studera de inbördes sambanden mellan dessa analyter inom samma typ av provtagningsrör. 5

6 Material och metoder Patienter och provtagning Provmaterialet bestod av tidigare nedfrysta blodprover (plasma) som erhållits från 35 patienter som kom till akutmottagningen vid Norrlands Universitetssjukhus för misstänkt hjärtinfarkt mellan november 1992 och december 1993 (11). Venprover togs med minimal stas i EDTA-K3 rör (Terumo Leuven, Belgien), i Citrat-rör innehållande 0,5 ml 0,13 mol/l (3,8 %) natriumcitrat (Terumo Leuven, Belgien) samt Stabilyte-rör (Biopool AB Umeå, Sverige) innehållande 0,5 ml 0,5 mol/l citratbuffert ph 4,3. Stabilyteröret fylldes till 4,5 ml vilket ger ett ph på ca 5,9 i plasma. Analysmetoder Komplex av tpa och PAI analyserades med ELISA-teknik (Tintelize tpa/pai-komplex, Biopool AB). Till analysen användes mikrotiterplattor där brunnarna klätts med antikroppar mot tpa/ PAI-komplex. Proverna applicerades och eventuella tpa/pai-komplex bands till antikropparna. Därefter tillsattes en sekundär antikropp kopplad till ett enzym (pepparrotsperoxidas) som gav upphov till en färgreaktion proportionell mot mängden tpa/pai-komplex i provet. Högkänsligt CRP analyserades med en automatiserad kemiluminiscensbaserad immunologisk metod med hjälp av Immulite (DPC, Los Angeles, CA, USA). Metoden bygger på en antigen-antikroppsreaktion där en tillsatt oxiderad molekyl tvingas omformera sig och avge ljus. Ljusintensiteten är proportionell mot mängden CRP i provet. PAI-1- masskoncentration analyserades med ELISA-teknik (Tintelize PAI-1, Tcoag, Wicklow, Irland). Fibrinogen och D-dimer analyserades på ACL TOP 500 LAS (Instrumentation Laboratory, Bedford, MA, USA) enligt tillverkarnas instruktioner. Fibrinogen, som en markör för inflammation, bestämdes med en trombininducerad koagulationsmetod, kronometriskt enligt Clauss metod (12) (Instrumentation Laboratory). D-dimer bestämdes immunturbidimetrisk med antikroppsbelagda latexpartiklar, en antigen-antikroppsreaktion, med en ökad grumlighet i provet ju fler antigen-antikroppskomplex som bildats (D-dimer reagens MRX 143, Medirox AB, Nyköping, Sverige). Alla prover analyserades som enkelprover. Komplex av tpa/pai och CRP hade redan analyserats i en tidigare studie (13). Statistiska metoder De statistiska beräkningarna analyserades med IBM SPSS version 18 (IBM Corporation, New York, NY, USA). Wilcoxon rank-sum test användes för jämförelse av resultaten mellan de olika rörtyperna. Värdena för EDTA-rören dividerades med 1,11 för att justera för skillnader i spädningseffekt gentemot citrat-rören och Stabilyte-rören. Deming regressionanalys användes för jämförelse mellan samma analyt i olika typer av rör (Method Validator, Philippe Marquis MD Centre Hospitalier Metz, Frankrike). För att studera skillnader mellan olika rörtyper för flera analyter samtidigt användes icke-parametrisk Spearman korrelation inom varje typ av rör. 6

7 Etiska överväganden Insamlandet av blodprover på hjärtinfarktpatienterna har godkänts vid etiska prövningsnämnden vid Umeå Universitet för en studie publicerad 1997 (11). Etiskt godkännande för jämförelse av preanalytiska faktorer finns från Regionala etikprövningsnämnden i Umeå. D-nr: M, Proverna var avidentifierade och hade lämnats på frivillig basis och ingen skada drabbar dem som donerat proverna. 7

8 Resultat Variationskoefficient Inomserieprecisionen, CV% (variationskoefficienten) för fibrinogen var 3,1 % och 4,7 % vid nivåerna 2,8 g/l respektive 0,93 g/l, och för D-dimer 11,9 % och 4,6 % vid nivåerna 0,15 mg/l respektive 0,42 mg/l. För CRP har en total mellanserieprecision på <6% tidigare tagits fram. Inomserieprecisionen, CV% (variationskoefficienten) för PAI-1-masskoncentration var 2,65 % vid nivån 42,0 ng/ml och för tpa/paikomplex, 5,98 % vid nivån 6,6 ng/ml. Analysresultat för de olika rörtyperna Citrat-rören och Stabilyte-rören innehöll 0,5 ml antikoagulerande vätska till skillnad från EDTA-rören som innehöll ett pulver med antikoagulerande effekt. Medelvärde för PAI-1-masskoncentration var 29,26 ng/ml i Stabilyte-plasma, 37,49 ng/ml i citrat-plasma och 74,61 ng/ml i EDTA-plasma. Medelvärde för tpa/pai-komplex i Stabilyte-plasma var 7,91 ng/ml, 8,65 ng/ml i citrat-plasma och 10,37 ng/ml i EDTA-plasma. Medelvärde för CRP i Stabilyte-plasma var 5,42 mg/l, 4,69 ng/ml i citrat-plasma och 6,08 ng/ml i EDTA-plasma. Medelvärde för D-dimer var 0,12 mg/l i Stabilyte-plasma, 0,24 mg/l i citrat-plasma och 0,26 mg/l i EDTA-plasma (Tab. 1). Fibrinogennivåerna låg inom eller nära referensintervallet (2,0-3,9 g/l). Rörjämförelse med demingregression Metodjämförelsen för PAI-1-masskoncentration visade högst förklaringsgrad mellan Stabilyte-plasma och citrat-plasma, R 2 =0,73. R 2 för de andra två jämförelserna var 0,43 och 0,46. Även för tpa/paikomplex uppmättes den högsta förklaringsgraden för Stabilyte-plasma och citrat-plasma R 2 =0,87. För D-dimer påvisades den högsta förklaringsgraden för Stabilyte-plasma mot EDTA-plasma, R 2 =0,83. För CRP observerades generellt höga R 2 värden från 0,87 till 0,94 (Tab. 2). Korrelation mellan parametrar analyserade i samma rörtyp För alla rör påvisades en signifikant positiv korrelation mellan PAI-I och tpa/pai-komplexet. D-dimer var korrelerad till CRP enbart i Stabilyte-plasma. För citrat-plasma iakttogs ett relativt högt r-värde men p = 0,081. CRP korrelerade signifikant med tpa/pai-komplex i alla rörtyper medan en korrelation med PAI-1 påvisades enbart i Stabilyte-plasma, p för citrat = 0,054. För fibrinogen uppmättes ett signifikant samband enbart med CRP, korrelationskoefficient 0,617, 0,624 och 0,592 för Stabilyte-plasma, citratplasma och EDTA-plasma (Tab. 3, Fig. 3). 8

9 Diskussion När man samlar in prover till biobanker och vid epidemiologiska studier är det kostnadseffektivt att ta så få provrör som möjligt, både för att spara lagringsutrymme och för att hålla nere kostnader för provtagning och hantering av proverna, men även för att minimera blodmängden man tar från de frivilliga donatorerna eller patienter. EDTA-rör är ett vanligt val när man samlar in prover till forskningsprojekt men i denna studie gav Stabilyte-rör de bästa resultaten. De högsta nivåerna av samtliga studerade analyter uppmättes i EDTA-plasma och skillnaderna var störst för PAI-1-masskoncentration och tpa/pai-komplex. Spridningen var störst för PAI-1-masskoncentration. För CRP och D-dimer var obetydliga. Fibrinogennivåerna var inte tillräckligt höga i något av proverna för att det skulle indikera påtaglig inflammation hos någon, vilket annars kunde ha varit en felkälla. De starkaste sambanden sågs mellan Stabilyte-plasma och citrat-plasma för tpa/pai-komplex R 2 =0,87 och för PAI-1-masskoncentration R 2 =0,73. Rörtyp påverkade inte analysresultaten för CRP, där alla tre provtagningsrören gav jämförbara resultat. Vid analys av samvariation mellan PAI-1-masskoncentration, tpa/pai-komplex, CRP och D-dimer observerades skillnader mellan de olika rörtyperna. Den inbördes korrelationen mellan olika fibrinolytiska parametrar var starkast i Stabilyte-plasma och svagast i EDTA-plasma. I alla rör korrelerade PAI-1-masskoncentration med tpa/pai-komplex. Eftersom den största delen av PAI-1 är komplexbundet till tpa så är det naturligt att PAI-1 är korrelerat med tpa/pai-komplex. En koppling med inflammation analyserat som CRP är också naturligt, men detta var minst tydligt i EDTA-plasma. Att notera är också att D-dimer, som är ännu starkare förknippad med inflammation, inte var korrelerad med CRP i EDTA-plasma. Analysen av samvariation tar hänsyn till rörskillnader för två metoder samtidigt. Sammantaget visar detta att man i EDTA-rör riskerar att missa sambanden mellan fibrinolytiska markörer som ses i Stabilyte-plasma. Materialet som undersökts i denna studie hade frysförvarats år och tinats ett flertal gånger vilket kan göra att provinnehållet förändrats över tid. Tidsaspekten har dock prövats i en annan studie där man tittade på fibrinolysmarkörer som varit frysförvarade vid -70 C i 5-20 år och förklaringsgraden för lagringstid var så låg som 0,02 (14). Matriseffekter är en annan tänkbar anledning till skillnader i resultaten mellan de olika rörtyperna. Med matriseffekt menas den påverkan på analysresultatet man får av andra beståndsdelar i provet än dem man vill mäta (15), som t ex påverkan på provet av något i EDTA-pulvret, föroreningar i provet eller skillnader i centrifugerings-hastigheter. Till skillnad från EDTA-röret innehåller Stabilyte-röret och citratröret 0,5 ml buffert vilket vi i denna studie justerat för vid jämförelsen av parade prover. Det låga phvärdet i Stabilyte-rörets buffert minskar enzymers aktivitet i provet och man kan därigenom till stor del stabilisera nivåerna av de ämnen man vill mäta i provröret. EDTA-plasman ska alltså generellt ge högre nivåer p.g.a. att det inte blir någon spädning av provet, men trots det var CRP jämförbart med nivån i Stabilyte-plasma, vilket skulle kunna förklaras av metodberoende matriseffekter. Ofta använder man sig av prover från friska personer när man gör metodjämförelser, men studier har visat att den pre-analytiska stabiliteten kan vara olika i normala och patologiska prover (16) och därför är 9

10 det viktigt att studier utförs på prover som är representativa för de analyser som ska göras. I detta fall har prover från patienter med misstänkt hjärtinfarkt använts. Eftersom mycket PAI-1 frisätts från trombocyterna är det av största vikt att undvika detta i den preanalytiska fasen när man tar prover för PAI-1-analyser. Antingen centrifugerar man provet vid tillräckligt hög hastighet för att avlägsna trombocyterna, 2000G i 15 min (17), eller tar provet i surgjort rör (Stabilyterör) som stabiliserar PAI-1. För personer som donerar blod till forskningsprojekt är det naturligtvis en fördel att man tar så få rör som möjligt. För biobankernas del är det en fördel att inte förvara onödigt stort antal rör eftersom de frysar som proverna förvaras i är både dyra och utrymmeskrävande och man kan på detta sätt spara in kostnader för fler frysar. För många analyser är det en fördel att använda sig av surgjord plasma eftersom plasman då är stabilare. Allt detta sammantaget gör stabilyte-röret till ett bra val för de parametrar vi analyserat. En begränsning med studien är att materialet är litet, endast 35 individer. En fördel är dock att respektive analyt har analyserats vid ett och samma tillfälle, vilket gör att metodförändringar över tid inte kan påverka resultatet. Konklusionen av denna studie är att Stabilyte-plasma är ett bra val när det gäller fibrinolysmarkörer. Vid insamling av prover till biobanker eller epidemiologiska studier vore det enklare och billigare att bara använda en sorts rör och där har Stabilyte-röret en fördel framför allt när det gäller fibrinolys och koagulation. 10

11 Tack tillägnas Ett stort tack till min handledare Johan Hultdin som lärt mig otroligt mycket i skrivandets konst och hur man ska tolka sina resultat. Ett stort tack till Stiftelsen för medicinsk forskning i Skellefteå som bekostade PAI-1-masskoncentrationsanalyserna. Tack till Ulla Lundgren och Kerstin Nordlöf som hjälpte mig med D-dimer och fibrinogenanalyserna på klinisk kemi, Skellefteå. Tack Ylva Hedberg-Fransson för tips och trix när jag kört fast, Jenny Hernestål-Boman för goda råd i hur man skriver och allmän uppmuntran samt vår sekreterare Marie Tjernkvist för hjälp med klurigheter i Word. Tack Johan Nilsson för att jag har fått använda ditt provmaterial och även ett stort tack till de personer som lämnat blodprover till studien. 11

12 Referenser 1. Kolde H-J. (2001). Haemostasis. Pentapharm Ltd. Basel, Schweiz. 2. Hillarp A, Stenflo J. (2003). Hemostas. I Laurells Klinisk kemi. Nilsson-Ehle P, red. Studentlitteratur, Lund, 8:e uppl Nilsson TK, Wallén P. (1991). The Fibrinolytic system: biochemistry and assay methods. Clinical aspects of fibrinolysis. Nilsson TK, Boman K. Jansson J-H. Almqvist & Wiksell International, Stockholm Folsom AR, Qamhieh HT, Wing RR, Jeffery RW, Stinson VL, Kuller LH, Wu KK. Impact of weight loss on plasminogen activator inhibitor (PAI-1), factor VII, and other hemostatic factors in moderately overweight adults. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1993;13: Skurk T, Hauner H. Obesity and impaired fibrinolysis: role of adipose production of plasminogen activator inhibitor-1. Int J Obes Relat Metab Disord. 2004;28: Hernestål-Boman J, Norberg M, Jansson JH, Eliasson M, Eriksson JW, Lindahl B, and Johansson L. Signs of dysregulated fibrinolysis precede the development of type 2 diabetes mellitus in a populationbased study. Cardiovasc Diabetol 2012;18(11): Sawdey MS, Loskutoff DJ. Regulation of murine type 1 plasminogen activator inhibitor gene expression in vivo. Tissue specificity and induction by lipopolysaccharide, tumor necrosis factor-alpha, and transforming growth factor-beta. J Clin Invest 1991;88: Alessi MC, Bastelica D, Mavri A, Morange P, Berthet B, Grino M, Juhan-Vague I. Plasma PAI-1 levels are more strongly related to liver steatosis than to adipose tissue accumulation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003;23: Robb AO, Mills NL, Din JN, Cameron S, Ludlam CA, Newby DE, Denison FC. Acute endothelial tissue plasminogen activator release in pregnancy. Thromb Haemost. 2009;7: Hultdin J, Nilsson TK. Analysis of cystatin C, creatinine, albumin, lipids and lipoprotein concentrations in serum and acidified citrate plasma (Stabilyte) tubes compared. Clin Chem Lab Med 2004;42(8): Nilsson JB, Nilsson TK, Jansson JH, Boman K, Thögersen AM, Näslund U. Relationship between fibrinolytic activity following streptokinase treatment in acute myocardial infarction and vectorcardiographic signs of reperfusion. Fibrinolysis Proteolysis 1997;11:

13 12. Clauss A. Gerinnungsphysiologische Schnellmethode zur Bestimmung des Fibrinogens. Acta Haemat. 1957;17: Nilsson TK, Boman K, Jansson JH Thögersen AM, Berggren M, Broberg A, Granlund.Comparison of soluble thrombomodulin, von Willebrand factor, tpa/pai-1 complex, and high-sensitivity CRP concentrations in serum, EDTA plasma, citrated plasma, and acidified citrated plasma (Stabilyte ) stored at 70 C for 8 11 years. Thromb Res 2005;116: Hernestål-Boman J, Jansson JH, Nilsson TK, Eliasson M, Johansson L. Long-term stability of fibrinolytic factors stored at -80 C. Thromb Res 2010;125: Theodorsson E. Kan man lita på laboratorieresultat? Flera faktorer påverkar. Läkartidningen 1997;94: Bowen RA, Remaley AT. Interferences from blood collection tube components on clinical chemistry assays. Biochem Med (Zagreb) 2014;15;24: Winegårdh B, Breimer L, Nilsson T. Centrifugeringstid på 15 minuter vid 2000 G räcker för adekvat minimering av trombocyter. Klinisk Kemi

14 Tabell 1. Plasmanivåer och skillnader för de olika rörtyperna, singelprover. Analyt Median 25:e - 75:e percentilen P a, b p a, c Fibrinogen, g/l Citrat 2,95 2,47-3,56 PAI-1- masskoncentation ng/ml Stabilyte 22,54 15,93-44,74 Citrat 30,29 17,00-45,10 0,005 EDTA 68,61 45,51-97,79 <0,001 <0,001 D-dimer, mg/l Stabilyte 0,06 0,02-0,11 Citrat 0,14 0,07-0,21 <0,001 EDTA 0,18 0,07-0,26 <0,001 <0,001 CRP, mg/l Stabilyte 3,75 1,66-10,10 Citrat 3,29 1,32-8,96 <0,001 EDTA 3,87 2,40-9,99 0,694 <0,001 tpa/pai komplex ng/ml Stabilyte 5,90 4,20-8,87 Citrat 7,58 5,65-9,45 0,002 EDTA 9,71 7,17-14,25 0,001 0,007 a EDTA-värdena dividerade med 1,111 för att justera för mindre buffertvolym i röret. b p-värde (Wilcoxon ranksummatest) Stabilyte vs citrat respektive EDTA, c p-värde (Wilcoxon ranksummatest) citrat vs EDTA n=35 14

15 Tabell 2. Jämförelse mellan tre plasmatyper parvis med deming-regression singelprover. Analyt Regressionsformel R 2 95% CI för lutning 95% CI för intercept PAI, masskoncentration Stabilyte vs citrat PAICitrat 1,677 PAIStabilyte 11,58 0,73 0,97 ; 2,38-29,34; 6,17 Stabilyte vs EDTA PAIEDTA 2,637 PAIStabilyte 2,53 0,43 0,11 ; 5,39 71,50 ; 66,43 Citrat vs EDTA PAIEDTA 1,408 PAICitrat + 21,82 0,46 0,46 ; 2,35 6,55 ; 50,19 D-dimer Stabilyte vs citrat D-dimerCitrat 1,097 D-dimerStabilyte + 0,11 0,64 7,18 ; 9,37 0,47 ; 0,69 Stabilyte vs EDTA D-dimerEDTA 1,344 D-dimerStabilyte + 0,10 0,83 4,17 ; 6,86 0,28 ; 0,49 Citrat vs EDTA D-dimerEDTA 1,275 D-dimerCitrat 0,04 0,64 0,44 ; 2,11-0,19, 0,10 CRP Stabilyte vs citrat CRPCitrat 1,013 CRPStabilyte 0,31 0,94 0,90 ; 1,12-0,80 ; 0,17 Stabilyte vs EDTA CRPEDTA 1,001 CRPStabilyte + 0,66 0,87 0,90 ; 1,09-0,02 ; 1,35 Citrat vs EDTA CRPEDTA 0,988 CRPCitrat + 0,97 0,90 0,87 ; 1,09 0,36 ; 1,59 tpa/pai komplex Stabilyte vs citrat tpa/paicitrat 0,643 tpa/paistabilyte + 3,57 0,87 0,12 ; 1,15 0,25 ; 6,88 Stabilyte vs EDTA tpa/paiedta 0,428 tpa/pai Stabilyte + 6,99 0,30 1,03 ; 1,89 2,41 ; 16,39 Citrat vs EDTA tpa/paiedta 0,891 tpa/paicitrat + 2,66 0,54 0,08 ; 1,70 3,08 ; 8,40 n=35 15

16 Tabell 3. Inbördes relation mellan analyserade analyter inom samma rör, Spearman korrelation (rho), singelprover. Plasma Spearman rho tpa/pai D-dimer CRP Stabilyteplasma PAI-I 0,813 ** 0,193 0,572 ** tpa/pai 0,161 0,523 ** D-dimer 0,414 * Citratplasma tpa/pai D-dimer CRP PAI-I 0,670 ** 0,210 0,329 a tpa/pai 0,181 0,471 ** D-dimer 0,299 b EDTA-plasma tpa/pai D-dimer CRP * P < 0,005 ** p < 0,01 a p = 0,054 b p = 0,081 n=35 PAI-I 0,576 ** 0,114 0,220 tpa/pai 0,213 0,346 * D-dimer 0,260 16

17 Balans mellan hemostas och antihemostas Koagulationsfaktorer Hämmare Antitrombin Protein C Protein S Fibrinolys tpa Plasmin Hämmare PAI 1 PAI 2 α 2 Makroglobulin α 2 Plasmin Inhibitor Figur 1. I blodbanan sker konstant en växelverkan mellan koagulation och fibrinolys, så att det varken bildas tromboser eller blödningar. 17

18 Figur 2. tpa (tissue plasminogen aktivator) aktiverar plasminogen till aktivt plasmin som tillsammans med andra substanser löser upp fibrin. PAI-1 (plasminogen activator inhibitor-1) hämmar fibrinnedbrytning genom komplexbildning med tpa. Den största delen av både PAI-1 och tpa finns i inaktiv form, bundna till hämmare. Förutom PAI-1 finns andra fibrinolyshämmare, α2- Plasmin Inhibitor och α2-macroglobulin som även de bildar komplex med tpa. Modifierad från (4). 18

19 200 EDTA 160 Y=EDTA X= Citrat Citrat Unweighted Deming regression N = 35 Slope : 1,408 [ 0,464 to 2,352 ] Intercept : 21,8217 [ -6,5565 to 50,1999 ] 160 Citrat 120 Y= Citrat X= Stabilyte Stabilyte Unweighted Deming regression N = 35 Slope : 1,677 [ 0,973 to 2,381 ] Intercept : -11,5810 [ -29,3403 to 6,1784 ] 200 EDTA Y= EDTA X= Stabilyte Stabilyte Unweighted Deming regression N = 35 Slope : 2,637 [ -0,118 to 5,392 ] Intercept : -2,5357 [ -71,5083 to 66,4368 ] Figur 3. Jämförelse av PAI-1-masskoncentration för tre olika plasmatyper. Svart linje visar uppmätt värde, röd linje visar lutningen om Y och X hade varit identiska. 19