Resistensbestämning enligt EUCAST lappdiffusionsmetod Version 5.0 Februari 2015
Innehåll Media Inokulatberedning Inokulering av plattor Antibiotikalappar Inkubering Avläsning Tolkning Kvalitetskontroll Felsökning EUCAST 2015 Version 5.0 2
Ändringar i bildspelet om EUCAST lappdiffusionsmetod Version Version 5.0 Februari 2015 Version 4.0 Augusti 2014 Version 3.0 Maj 2013 Ändringar Information om förlängd inkubering för glykopeptider och enterokocker tillagt på bild 20. E. coli ATCC 35218 flyttad till rutinmässig kvalitetskontroll. Tryckfel för DSM-nummer korrigerat på bild 31. Kommentar om att H. influenzae NCTC 8468 ska utgå, tillagt på bild 32. H. influenzae ATCC 49766 tillagd som kvalitetskontrollstam på bild 32. Tryckfel för ATCC-nummer för E. faecalis ATCC 51299 korrigerat på bild 33. Corynebacterium spp. tillagt på bild 7 och 20. Förtydligande angående förvaring och hantering av agarplattor på bild 10. Förtydligande angående defibrinerat hästblod och β-nad på bild 5. Pasteurella multocida, Campylobacter jejuni och coli tillagt på bild 6 och 19. Förtydligande angående selektion av kolonier för lappdiffusion på bild 11 och 12. Förtydligande angående agarplattor på bild 13. Ändring av glykopeptider till vankomycin för Enterococcus spp. på bild 26. Ändring av Staphylococcus spp. till S. aureus för bensylpenicillin på bild 27. Tillägg av länk för kvalitetskontrollstammar med specifika resistensmekanismer på bild 29. Campylobacter jejuni ATCC 33560 tillagd på bild 30. DSM- och CCUG-nummer tillagt för E. faecalis ATCC 51299 på bild 31. EUCAST 2015 Version 5.0 3
Ändringar i bildspelet om EUCAST lappdiffusionsmetod Version Version 2.1 Januari 2012 Version 1.0 December 2009 Ändringar Ny terminologi (Streptokocker viridansgruppen) och tillägg av Listeria monocytogenes på bild 6 och 19. Förtydligande angående agardjup på bild 7. Förtydligande angående avläsning av zoner på bild 23 och 25. Tillägg av undantag vid avläsning av zoner på bild 27. Tillägg av spanska stamkollektionsnummer på bild 30 och 31. Tillägg av K. pneumoniae ATCC 700603 och E. faecalis ATCC 51299 på bild 31. Bildspelet om EUCAST lappdiffusionsmetod publiceras för första gången på EUCAST hemsida i engelsk version. EUCAST 2015 Version 5.0 4
Media EUCAST 2015 Version 5.0 5
Media Använd endast Mueller Hintonagar (MH) För krävande organismer används MH-F (Mueller Hinton- Fastidious), dvs MH med tillsats av 5% hästblod (mekaniskt defibrinerat) och 20 mg/l β-nad. Använd β-nad (Nikotinamid Adenin Dinukleotid) med en renhet på 98%. EUCAST 2015 Version 5.0 6
Media för olika organismer Organismer Enterobacteriaceae Pseudomonas spp. Stenotrophomonas maltophilia Acinetobacter spp. Staphylococcus spp. Enterococcus spp. Streptococcus pneumoniae Streptokocker grupp A, B, C och G Streptokocker viridansgruppen Haemophilus spp. Moraxella catarrhalis Listeria monocytogenes Pasteurella multocida Campylobacter jejuni och coli Corynebacterium spp. Övriga krävande organismer Medium Mueller Hintonagar Mueller Hintonagar + 5% defibrinerat hästblod + 20 mg/l β-nad (MH-F) Ej klart EUCAST 2015 Version 5.0 7
Egen tillverkning av agarplattor Tillverka MH-plattor enligt tillverkarens instruktioner. Låt agarn svalna till 42-45 C innan blod eller β-nad tillsätts, blanda väl och dispensera plattorna omedelbart. Dispensera plattorna på en plan yta för att få ett jämnt djup på 4.0 ± 0.5 mm. Om upprepade mätningar ger ett agardjup över eller under 4 mm, justera volymen även om agardjupet är inom 3.5-4.5 mm. Vanligt förekommande storlekar på Petriskålar är 90 mm (~25 ml), 100 mm (~31 ml), 150 mm (~71 ml) och kvadratiska 100 mm (~40 ml). EUCAST 2015 Version 5.0 8
Kvalitetskontroll av Mueller Hintonagar Kontrollera att alla batcher av Mueller Hinton hamnar inom QC-gränserna för alla relevanta kombinationer av bakterier och antibiotika. Observera: P. aeruginosa ATCC 27853 och aminoglykosider: Zoner utanför QC-intervallet indikerar för höga eller låga koncentrationer av divalenta katjoner i agarn. E. faecalis ATCC 29212 och trimetoprim/trim-sulfa: För små zoner eller växt in till lappen indikerar för höga halter av tymin och tymidin i agarn. EUCAST 2015 Version 5.0 9
Torkning och förvaring av agarplattor Agarplattor ska förvaras vid 4-10 C. Torkning, förvaring och hållbarhet hos egentillverkade agarplattor kan variera beroende på lokala förhållanden (temperatur, fukthalt mm). Köpta agarplattor ska förvaras enligt tillverkarens rekommendationer och användas innan utgångsdatum. MH-F plattor som förvaras i plastpåse eller annan försluten förpackning kan behöva torkas före användning. På detta sätt undviks fukt som annars kan ge problem med otydliga zonkanter och/eller dimma i zon. Agarplattorna ska vara rumstempererade vid inokulering. Det ska inte finnas vattendroppar på agarytan, men plattorna ska inte heller vara för torra. EUCAST 2015 Version 5.0 10
Inokulat Inokulatet ska motsvara grumligheten hos en McFarland 0.5-standard*. * Motsvarar ungefär 1-2 x 10 8 CFU/mL för E. coli. EUCAST 2015 Version 5.0 11
Plocka isolerade kolonier från en övernattskultur på icke selektivt medium EUCAST 2015 Version 5.0 12
Inokulatberedning Plocka om möjligt flera morfologiskt lika kolonier för att undvika att välja en atypisk variant. Slamma kolonierna i 0.85% NaCl till en homogen lösning som motsvarar en McFarland 0.5-standard. Undantag: Streptococcus pneumoniae slammas till McFarland 0.5 från en blodplatta, men till McFarland 1.0 från en chokladplatta. Justera grumligheten genom att tillsätta mer bakterier eller NaCl till slamningen. Mät gärna till McFarland 0.5 med en densitometer. EUCAST 2015 Version 5.0 13
Inokulering av plattor Använd helst inokulatet inom 15 minuter från slamning och alltid inom 60 minuter. Doppa en bomullspinne i slamningen och tryck bort överflödig vätska mot insidan av röret. Se till att agarplattorna är rumstempererade. Sprid inokulatet jämnt över hela agarytan, antingen för hand i tre riktningar eller med hjälp av en rotator. EUCAST 2015 Version 5.0 14
Undvik överinokulering Det är viktigt att inte överinokulera plattorna så att växten blir för tjockt. Kontrollera att zonerna för kontrollstammarna hamnar inom rekommenderade QC-intervall. För tjockt inokulat kan resultera i för små zoner. Tryck bort överflödig vätska genom att försiktigt pressa bomullspinnen mot insidan av röret innan inokulatet sprids ut (undvik dock en alltför torr bommullspinne för grampositiva organismer). EUCAST 2015 Version 5.0 15
Förvaring av antibiotikalappar Förvara lager av antibiotikalappar enligt tillverkarens rekommendationer. Lappar som är i bruk förvaras mörkt vid 4-8 C i förslutna behållare med torkmedel. Låt behållarna nå rumstemperatur innan de öppnas för att undvika kondensation på lapparna. Det är bättre att förvara antibiotikalapparna i rumstemperatur under dagen än att flytta dem in och ut ur kylen upprepade gånger. Använd inte antibiotikalappar som har passerat utgångsdatum (se förpackningen). EUCAST 2015 Version 5.0 16
Applicering av antibiotikalappar Antibiotikalapparna ska appliceras inom 15 minuter från att plattorna inokulerats. Lapparna ska ligga plant på ytan av mediet. Lapparna ska vara fördelade så att zonerna inte överlappar varandra. Överlappande zoner försvårar avläsningen och kan ge interaktioner mellan olika antibiotika. EUCAST 2015 Version 5.0 17
Sammanfattning Inokulering Slamma isolerade kolonier plockade från en icke-selektiv agarplatta som är inkuberad över natten. Justera till McFarland 0.5, gärna med en densitometer. Använd helst inokulatet inom 15 minuter. Doppa en steril bommullspinne i slamningen och tryck bort överflödig vätska mot insidan av röret. Sprid ut inokulatet jämnt över hela agarytan. Applicera antibiotikalappar inom 15 minuter från inokulering och påbörja inkubering av plattorna inom ytterligare 15 minuter. EUCAST 2015 Version 5.0 18
Inkubering Vänd plattorna upp-och-ned och påbörja inkubering inom 15 minuter från att antibiotikalapparna har applicerats. Detta förhindrar prediffusion, vilket annars kan resultera i för stora zoner. Inkubera plattorna i så små staplar som möjligt för att undvika ojämn uppvärmning, vilket kan påverka zonstorlekarna (beroende på inkubatorns effektivitet). MH inkuberas i luft och MH-F i luft med 4-6% CO 2. EUCAST 2015 Version 5.0 19
Inkubering Organism Enterobacteriaceae Pseudomonas spp. Stenotrophomonas maltophilia Acinetobacter spp. Staphylococcus spp. Enterococcus spp. Streptokocker grupp A, B, C och G Streptokocker viridansgruppen Streptococcus pneumoniae Haemophilus spp. Moraxella catarrhalis Listeria monocytogenes Pasteurella multocida Campylobacter jejuni och coli Corynebacterium spp. Övriga krävande organismer Inkubering 35±1 ºC i luft 16-20 h 35±1 ºC i luft 16-20 h 35±1 ºC i luft 16-20 h 35±1 ºC i luft 16-20 h 35±1 ºC i luft 16-20 h 35±1 ºC i luft 16-20 h (24 h för glykopeptider) 35±1 ºC i luft med 4-6% CO 2 16-20 h 35±1 ºC i luft med 4-6% CO 2 16-20 h 35±1 ºC i luft med 4-6% CO 2 16-20 h 35±1 ºC i luft med 4-6% CO 2 16-20 h 35±1 ºC i luft med 4-6% CO 2 16-20 h 35±1 ºC i luft med 4-6% CO 2 16-20 h 35±1 ºC i luft med 4-6% CO 2 16-20 h 41±1 ºC i mikroaerob miljö 24 h (40-48h) 35±1 ºC i luft med 4-6% CO 2 16-20 h (40-48h) Ej klart EUCAST 2015 Version 5.0 20
15-15-15 minutersregeln Observera: Använd helst inokulatet inom 15 minuter från slamning och alltid inom 60 minuter. Applicera antibiotikalappar inom 15 minuter från att plattorna inokulerats. Påbörja inkubering inom 15 minuter från att antibiotikalapparna applicerats. EUCAST 2015 Version 5.0 21
Undersökning av plattor efter inkubering Växten ska vara konfluerande. Det är viktigt att växten är jämn för att få fina zonkanter (se exempel på nästa bild). Om enskilda kolonier syns är inokulatet för tunt och resistensbestämningen måste göras om. EUCAST 2015 Version 5.0 22
Växten ska vara jämn och konfluerande så här!...men inte så här! EUCAST 2015 Version 5.0 23
Avläsning Håll plattan på ca 30 cm avstånd, ta hänsyn till all växt som syns med blotta ögat och läs zonerna där växten slutar. Exempel: E. coli Ciprofloxacin S. aureus Erytromycin KNS Trimetoprim S. pneumoniae Rifampicin EUCAST 2015 Version 5.0 24
Avläsning MH Mät zoner från baksidan mot en mörk bakgrund med belysning mot plattan MH-F Mät zoner från ovansidan utan lock med belysning mot plattan EUCAST 2015 Version 5.0 25
Avläsning Håll inte upp plattan mot ljuset och använd inte förstoringsglas (se undantag nedan). Mät zonerna med skjutmått, linjal eller med en automatisk zonavläsare. Om enskilda kolonier växer in i zonen, kontrollera om det är en kontamination och upprepa resistensbestämningen vid behov. EUCAST 2015 Version 5.0 26
Avläsning undantag (1) Organism Antibiotika Avläsning Proteus spp. Alla Bortse från svärmning. Streptococcus spp. Alla Läs där växten slutar och inte där hemolysen slutar. Alla Trimetoprim Trimetoprim-sulfametoxazol Bortse från en tunn hinna av växt in till lappen i en i övrigt tydlig zon. Staphylococcus spp. Linezolid Håll upp plattan mot ljuset och undersök zonen. Enterococcus spp. Vankomycin Håll upp plattan mot ljuset och undersök zonen. Enterobacteriaceae Ampicillin Bortse från tunn inväxt i form av en inre zon som kan uppstå med viss Mueller Hintonagar. EUCAST 2015 Version 5.0 27
Avläsning undantag (2) Organism Antibiotika Avläsning E. coli Mecillinam Bortse från isolerade kolonier i zonen. S. aureus Bensylpenicillin Håll upp plattan mot ljuset och undersök zonkanten noggrant. Staphylococcus spp. Cefoxitin Undersök zonen noggrant för att detektera ev. kolonier i zonen. EUCAST 2015 Version 5.0 28
Tolkning Kontrollera att zonerna för kontrollstammarna hamnar inom angivna QC-intervall innan resultaten tolkas. Uppmätta zondiametrar (avrundade till närmsta millimeter) tolkas till S, I och R enligt publicerade brytpunktstabeller (www.eucast.org eller www.nordicast.org). Alternativt kan mallar med EUCAST brytpunkter användas. EUCAST 2015 Version 5.0 29
Kvalitetskontroll Använd rekommenderade kvalitetskontrollstammar i laboratoriets rutinmässiga arbete (se EUCAST QC Tables). Kvalitetskontrollstammar med definierade resistensmekanismer kan användas för att detektera specifika resistensmekanismer (se EUCAST QC Tables). Kvalitetskontrollstammar kan köpas från stamkollektioner eller vissa leverantörer av material för resistensbestämning. EUCAST 2015 Version 5.0 30
EUCAST kvalitetskontrollstammar Organism Stamkollektionsnummer Egenskaper E. coli ATCC 25922; NCTC 12241 CIP 7624; DSM 1103 CCUG 17620; CECT 434 E. coli ATCC 35218; NCTC 11954 CIP 102181; DSM 5923 CCUG 30600; CECT 943 P. aeruginosa ATCC 27853; NCTC 12903 CIP 76110; DSM 1117 CCUG 17619; CECT 108 S. aureus ATCC 29213; NCTC 12973 CIP 103429; DSM 2569 CCUG 15915; CECT 794 E. faecalis ATCC 29212; NCTC 12697 CIP 103214; DSM 2570 CCUG 9997; CECT 795 Känslig, vildtyp TEM-1 β-laktamasproducerande Känslig, vildtyp Svagt β-laktamasproducerande Känslig, vildtyp EUCAST 2015 Version 5.0 31
EUCAST kvalitetskontrollstammar Organism Stamkollektionsnummer Egenskaper S. pneumoniae ATCC 49619; NCTC 12977 CIP 104340; DSM 11967 CCUG 33638 H. influenzae NCTC 8468*; CIP5494 CCUG 23946 H. influenzae ATCC 49766; NCTC 12975 CIP 103570; DSM 11970 CCUG 29539 Campylobacter jejuni ATCC 33560; NCTC 11351; CIP 702; DSM 4688 CCUG 11284 Nedsatt känslighet för bensylpenicillin Känslig, vildtyp Känslig, vildtyp Känslig, vildtyp * H. influenzae NCTC 8468 har en ovanlig morfologi och kommer att utgå 2016. EUCAST 2015 Version 5.0 32
Kontrollstammar för detektion av specifika resistensmekanismer Organism Stamkollektionsnummer Egenskaper K. pneumoniae ATCC 700603; NCTC 13368 CCUG 45421; CECT 7787 S. aureus NCTC 12493 E. faecalis H. influenzae ATCC 51299; NCTC 13379 CIP 104676; DSM 12956 CCUG 34289 ATCC 49247; NCTC 12699 CIP 104604; DSM 9999 CCUG 26214 ESBL-producerande (SHV-18) Oxacillin-heteroresistent, meca-positiv Höggradigt aminoglykosidresistent (HLAR) och vankomycinresistent (vanb positiv) β-laktamasnegativ, ampicillin-resistent (BLNAR) EUCAST 2015 Version 5.0 33
Stamkollektioner ATCC: American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA. NCTC: National Collection of Type Cultures, Health Protection Agency Centre for Infections, 61 Colindale Avenue, London NW9 5HT, Storbritannien. CIP: Collection de Institut Pasteur, 25 28 Rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Frankrike. DSMZ: Deutsche Stammsammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 16, D-38124 Braunschweig, Tyskland. CCUG: The Culture Collection University of Gothenburg, Sverige. CECT: Colección Española de Cultivos Tipo, Universidad de Valencia, 46100 Burjassot, Valencia, Spanien. EUCAST 2015 Version 5.0 34
Rutinmässig kvalitetskontroll Kvalitetskontroll bör utföras dagligen, särskilt för antibiotika som används rutinmässigt. Kvalitetskontrollen skall alltid läsas och bedömas innan de kliniska isolaten läses. Bedömningen görs på resultaten från de senaste 20 konsekutiva mätningarna. Var uppmärksam på trender och på zoner som upprepade gånger hamnar över eller under målvärdet. Om två eller fler av 20 mätningar ligger utanför intervallet krävs felsökning. EUCAST 2015 Version 5.0 35
Zondiameter (mm) Övervakning av QC-resultat 25 20 15 10 5 Enstaka mätningar utanför QC-intervallet Alla mätningar inom intervallet men på samma sida om målvärdet. Övre gränsvärde Målvärde Nedre gränsvärde Konsekutiva mätningar utanför intervallet på samma sida om målvärdet. 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Dag EUCAST 2015 Version 5.0 36
Åtgärder vid avvikande QC-resultat Om två ickekonsekutiva mätningar av 20 hamnar utanför QCintervallet rapportera resultaten från resistensbestämningen, men gör felsökning. Om två konsekutiva mätningar av 20 hamnar utanför QC- intervallet gör felsökning innan resultaten rapporteras. Resistensbestämningen kan behöva göras om. Om flera antibiotikalappar (>2) ligger utanför respektive QC-intervall samma dag gör felsökning innan resultaten rapporteras. Resistensbestämningen kan behöva göras om. Om en kontrollstam med specifika resistensmekanismer inte uppvisar resistens svara inte ut resultaten, undersök och gör om resistensbestämningen. EUCAST 2015 Version 5.0 37
Hantering av kontrollstammar Förvara kontrollstammarna vid -70 C på keramiska pärlor/kulor i små portioner. Se till att ha minst ett arkivrör och flera bruksrör i frysen. Alternativ förvaring är frystorkat material eller kommersiellt tillgängliga produkter. Från ett bruksrör görs varje vecka en veckoplatta på ickeselektivt medium. Från veckoplattan stryks varje dag en färsk platta som används till morgondagens kvalitetskontroll. Endast för krävande organismer får man använda seriell omstrykning av den dagliga färska plattan. EUCAST 2015 Version 5.0 38
Potentiella felkällor (1) Förvaring av plattor Ej följt instruktioner vid tillverkning av plattor Medium Variation mellan batcher eller byte av leverantör Tillsatser (variation mellan batcher, fel mängd eller passerat utgångsdatum) ph Agardjup/Agarvolym Passerat utgångsdatum Test- förhållanden Ej följt 15-15-15 -minutersregeln (använd slamning inom 15 min, applicera lappar inom 15 min, inkubera inom 15 min) Inkubering (temperatur, miljö och tid) Felaktig inokulering (för tjockt, tunt eller ojämnt inokulat) Avläsning med fel belysning eller bakgrund Avläsning av zoner EUCAST 2015 Version 5.0 39
Potentiella felkällor (2) Antibiotikalappar Kontrollstammar Fel antibiotikalapp (fel antibiotika eller fel lappstyrka) Antibiotikainnehåll (felaktig förvaring, känsliga antibiotika, passerat utgångsdatum) Lapparna inte rumstempererade när behållaren öppnats För många lappar på plattan (interaktion mellan lappar) Fel kvalitetskontrollstam Mutation Kontamination För gammal kultur EUCAST 2015 Version 5.0 40
EUCAST hemsida Följ regelbundet uppdateringar i metodologi, QC-tabeller och brytpunktstabeller på EUCAST hemsida www.eucast.org Vid eventuella frågor kontakta erika.matuschek@escmid.org eller EUCAST sekretariat (se hemsida). EUCAST 2015 Version 5.0 41