Direkt resistensbestämning

Transkript

1 Direkt resistensbestämning (Direct Antimicrobial usceptibility Testing, D-AT) Martin undqvist Laboratoriemedicinska Länskliniken, Klinisk Mikrobiologi, Universitetssjukhuset, Örebro

2 Varför? Ökande resistens Antibiotic stewardship (NNT 4, Klein Breteler JID 11) Kostnadsbesparande (Garcia-Vazquez JID 13) För att matcha snabb artbestämning För patienten

3 Två nivåer av D-AT 1. Direkt från provmaterial a) Urin b) år (Malmö modellen) c) putum (Kontopidou et al Int J Antimicrobial Agents 11) d) Likvor? e) Alla material med total dominans av en art? f) Kammarvätska? (NEJ, Gupta et al Retina 4) 2. Direkt från anrikningsbuljong/blododling a. Disk Diffusion b. Gradient-tester c. Automatiskt

4 Hur kan D-AT användas? om preliminär metod Begränsat antal antibiotika Man gör standardiserad AT dag 2 + Ger snabbare information + Kräver mindre validering Ger mer jobb Ökad kostnad? Kan innebära utmaning för LI

5 Hur kan D-AT användas? om definitiv metod Fler antibiotika testas Ingen ny resistensbestämning + Ger snabbare information + Ger alla AT data direkt Måste valideras noggrant Kan innebära slöseri

6 Vad säger EUCAT om D-AT Ett icke standardiserat inokulat Risk för Blandkultur och ph effekter EUCAT rekommenderar inte DAT Om man gör det ska man Validera Upprepa från ren koloni Om tunn växt rapportera inte Inget stöd för kort inkuberingstid EUCAT DAT guidelines February

7 Grattis Danmark!

8 D-AT från blodkultur De flesta lab i verige gör AT direkt från pos blododlingsflaska. nabb D-AT (inkubation -h) gör 5 av 25 svenska lab (sept )

9 Vilket stöd har vi för D-AT från positiv odlingsflaska Direkt från odlingsflaska Mirrett JCM :1 från flaskan inkuberades 1h, sedan spädning till.5 McF Early reading Coyle et al JCM 194 Utan spädning, 4 och h Etest, (Leegaard et al ECCMID? ) DD MH-F (undqvist et al ECCMID, )

10 EUROTAR RAPID DIK Metod.5 McF, kort inkubation h h E.coli K.pneumoniae Enterokocker P.aeruginosa.aureus 93% av isolaten kunde läsas efter el h Lab Växjö manuell avläsning Hvidovre kamera med justering AMC kamera med justering. Avläsning varje timma.

11 Tidig avläsning, h vs 1h undqvist et al ECCMID 13

12 Konklusion A method for rapid susceptibility testing ( or h) was calibrated to EUCAT disk diffusion methodology and EUCAT clinical breakpoints. MRA (h) and resistance to 3 rd generation cephalosporins due to EBLs in E.coli and K.pneumoniae (h) were readily detected by all three laboratories. A panel of ciprofloxacin, cefotaxime, ceftazidime, meropenem and gentamicin in Enterobacteriaceae and cefoxitin, erythromycin, clindamycin in.aureus can be used for rapid susceptibility testing with disk diffusion. undqvist et al ECCMID 13

13 Hur utvecklas en zon? C. Hodiamont, ECCMID 13

14 På gång Haemophilus influenzae Pneumokocker Validera direkt från Blod Testa nytt protokoll tillsammans med MALDI Lysering Centrifugering Inoculum-beredning Anna Åkerlund 13

15 D-AT från urin Många gör detta töd i litteraturen Olika screening Relativt små serier (- pat) Johnsson JCM 1995 Kombinerat med direkt artbestämning med MALDI?

16 Inhibition zone diameter (mm). DT-U D-AT Urin 5 cfu/ml Renkultur 177 prover, 3 E.coli EUCAT BP DAT från urin gav fler resultat än från pellet Ciprofloxacin Ciprofloxacin 5 µg R I I R Inhibition zone diameter (mm). tandard AT Olafsson ECCMID 13

17 D-AT urin i praktiken Örebro 47 prover april prov 53% negativa Gram pos 9% % blandflora Direktresistens avläst på 25% 9 E.coli (7%) 2 ME (TRI och MEC) 2/2 EBL hittades Proteus spp 1 me Övriga koliforma bakt Inga fel nabb artbestämning viktig! undman 13

18 nabb D-AT från Urin, pilot 5 cfu/ml Renkultur 72 prover ynlig växt på Uriselect (29 med färg) Zoner kunde läsas på 4 (42 E.coli) efter h på MH Byhlén, Växjö 13

19 Vad är viktigt att tänka på? DAT Hitta screeningmetod för att få fram de sannolikt positiva Allvarliga fel är ovanliga om man: Endast accepterar renkultur Är hård mot inokulatet Kort inkubation Registrera zonstorlek Alla bakterie/antibiotika kombinationer fungerar inte Resultat precis intill brytpunkten bör tolkas med försiktighet.

20 Vad krävs för att få ut mest klinisk Patientfokus nabb artbestämning (Chromogena medier, MALDI- TOF) Elektroniska svar Förlängda öppettider Blododlingsskåp tillgängliga 24/7 jukvård som är beredd på snabbare svar nytta av D-AT?

21 Tack Växjö Hvidovre Pia Littauer Jenny Dahl Knudsen Emma Jonasson Gunilla Cederbrandt Robert myth tina Bengtsson Jonas Olafsson Liselott Byhlén Åsa Johansson Erika Matuscheck Gunnar Kahlmeter AMC Caspar Hodiamont Caroline Visser Nijmegen Johan Mouton BD/Kiestra Gerard Muller Martin van der Kaap

22 if the density of the suspension used are not measured by some fixed standards, exact repetition either by the experimenter himself or by those who try to repeat his work will be impossible McFarland 197

23

24 Vad behövde vi göra? kapa QC-gränser Escherichia coli ATCC 25922, Enterococcus faecalis ATCC 292, taphylococcus aureus ATCC and Pseudomonas aeruginosa ATCC to 7 test per stam target value (median) och range (min-max) beräknad

25

26 Results part 2 (ATCC) Escherichia coli ATCC Eurostar (h) EUCAT (1h) (n=44/4) Target Range Target Range Cefotaxime Ciprofloxacin Meropenem Ceftazidime Piperacillin/tazobactam Trimethoprim Nitrofurantoin Tobramycin Gentamicin Enterococcus faecalis ATCC 292 Eurostar (h) EUCAT (1h) (n=55/5) Target Range Target Range Ampicillin Vancomycin Gentamicin 3* Linezolid Nitrofurantoin * 39/4 tested isolates

27 Results part 2 (ATCC) Ps. aerugionosa ATCC (n=4/4) Eurostar (h) EUCAT (1h) Target Range Target Range Piperacillin/tazobactam Tobramycin Meropenem Ceftazidime Imipenem Ciprofloxacin Gentamicin taphylococcus aureus ATCC (n=4/4) Eurostar (h) EUCAT (1h) Target Range Target Range Clindamycin Erythromycin Linezolid Norfloxacin Cefoxitin

28 Vad behöver vi göra? kapa QC-gränser Escherichia coli ATCC 25922, Enterococcus faecalis ATCC 292, taphylococcus aureus ATCC and Pseudomonas aeruginosa ATCC to 7 test per stam target value (median) och range (min-max) beräknad kapa vildtypsdistributioner (med enstaka resistenta isolat) Kliniskt betydelsefulla antibiotika 5 välkarakteriserade E. coli, E. faecalis /E. faecium,.aureus och P.aeruginosa Jämföra både IR kategorisering och zon-zon korrelat med EUCAT metoden (-h incubation).

29 No of isolates No of isolates E. coli and cefotaxime 5µg Cefotaxime 5 µg, hours incubation E. coli, 55 clinical isolates 1 R I 4 2 Inhibition zone diameter (mm) 1 Cefotaxime 5 µg, hours incubation E. coli, 55 clinical isolates 1h CBP 21 R<1 4 2 R I Inhibition zone diameter (mm)

30 No of isolates E. coli and cefotaxime 5µg Cefotaxime 5 µg, hours incubation E. coli, 55 clinical isolates 1 R I 4 2 Inhibition zone diameter (mm) 1h CBP 21 R<1

31 No of isolates No of isolates E. coli and ceftazidime µg h Ceftazidime µg, hours incubation E. coli, 55 clinical isolates R I 4 2 Inhibition zone diameter (mm) Ceftazidime µg, h incubation E. coli, 55 clinical isolates 1h CBP 22 R< h R I Inhibition zone diameter (mm)

32 No of isolates No of isolates E. coli and piperacillin-tazobactam Piperacillin-tazobaktam 3 µg, hours incubation E. coli, 5 clinical isolates 1 I 4 2 Inhibition zone diamter (mm) Piperacillin-tazobaktam 3 µg, hours incubation E. coli, 5 clinical isolates 1 1h CBP 1 R< I Inhibition zone diameter (mm)

33 Vad behöver vi göra? kapa QC-gränser Escherichia coli ATCC 25922, Enterococcus faecalis ATCC 292, taphylococcus aureus ATCC and Pseudomonas aeruginosa ATCC to 7 test per stam target value (median) och range (min-max) beräknad kapa vildtypsdistributioner (med enstaka resistenta isolat) Kliniskt betydelsefulla antibiotika 5 välkarakteriserade E. coli, E. faecalis /E. faecium,.aureus och P.aeruginosa Jämföra både IR kategorisering och zon-zon korrelat med EUCAT metoden (-h incubation).

34 No of isolates.aureus och cefoxitin 3µg 25 Cefoxitin 3 µg, hours incubation. aureus, 5 clinical isolates 15 R 5 1h CBP 22 R<22 Inhibition zone diameter (mm)

35 1 No of isolates 1 No of isolates E. faecalis/faecium och gentamicin 3 µg Gentamicin 3 µg, h incubation Enterococcus, 47 isolates h HLAR R 4 2 Inhibition zone diameter (mm) Gentamicin 3 µg, h incubation Enterococcus, 47 isolates HLAR mm 1h h HLAR R 4 2 Inhibition zone diameter (mm)

36 1 No of isolates 1 No of isolates E. faecalis/faecium and vancomycin 3 Vankomycin 5 µg, h incubation Enterococcus, 4 isolates R 5 Inhibition zone diameter (mm) Vancomycin 5 µg, h incubation Enterococcus, 4 isolates h CBP R< 15 5 R Inhibition zone diametre (mm)

37 lutsats Det är möjligt att standardisera resistensbestämning på h (E.coli och Enterokocker) eller h (.aureus och P.aeruginosa) för de flesta antibiotika Vissa antibiotika/resistensmekanismer kommer inte att passa Fler specifika resistenskombinationer ska testas. törre kollektion av konsekutiva kliniska isolat ska testas

38

39 MH-F agar CO2.pneumoniae (h) n= oxa ery kli tet cdr amp gen van pcg lin rif gen tsu nor

40 MH-F CO2 Beta hem trept GA (n=42) GC (n=4) GG (n=) oxa ery kli tet cdr amp gen van pcg lin rif gen tsu nor

41 tructure 1. Pilot studies 2. Quality control strains Escherichia coli ATCC 25922, Enterococcus faecalis ATCC 292, taphylococcus aureus ATCC and Pseudomonas aeruginosa ATCC to 7 repeated tests target value (median) and range (min-max) 3. Clinical isolates 5 well characterised isolates of E. coli and E. faecalis /E. faecium Compared to IR categorisation, using EUCAT methodology (-h incubation) and breakpoints.

42 Pilot studies (1) Reading from front and back of the plates. (n=9) Reading direct after incubation and after storage in fridge. (n=9) Preincubated plates. (n=45)

43 Results (1) Reading from the front (open lid) were a prerequisite for short incubation Pre-heating not decrease the time to readable zones No significant difference between direct measurements and after storage in fridge

44 Conclusions (1) It is possible to get valid QC of the methodology based on hours of incubation for E. coli and E. faecalis h incubation for. aureus and P. aeruginosa The target values were - mm lower than standardised EUCAT QC targets The range was typically 5 mm (EUCAT -).

45 Methods (2) Isolates from overnight cultures. uspension of McFarland,5-, in NaCl. Rotator (Biomerieux) used for spread. Two suspensions prepared and h 1h Plates read directly or within 2 days after storage in fridge.

46 Methods part 3 (EUCAT collection) Isolates from overnight cultures McF.5-. Rotator Zone measurements by two technicians from the front using a slide gauge (direct or after storage in fridge) Good light and dark background

47 Ni of isolates No of isolates E. coli and ciprofloxacin 5µg Ciproloxacin 5 µg, hours incubation E. coli, 55 clinical isolates R 4 2 Inhibition zone diameter (mm) Ciproloxacin 5 µg, hours incubation E. coli, 55 clinical isolates 1h CBP 21 R< R Inhibition zone diameter (mm)

48 No of isolates E. coli and ciprofloxacin 5µg Ciproloxacin 5 µg, hours incubation E. coli, 55 clinical isolates R 4 2 Inhibition zone diameter (mm)

49 No of isolates No of isolates E. coli and meropenem 25 Meropenem µg, hours incubation E. coli, 55 clinical isolates 15 5 Inhibition zone diameter (mm) 25 Meropenem µg, hours incubation E. coli, 55 clinical isolates 15 1h CBP 22 R< 5 Inhibition zone diameter (mm)

50 No of isolates No of ioslates E. coli and mecillinam Mecillinam µg, hours incubation E. coli, 54 clinical isolates R 4 2 Inhibition zone diameter (mm) Mecillinam µg, hours incubation E. coli, 54 clinical isolates 1h CBP 15 R< R Inhibition zone diameter (mm)

51 No of isolates No of isolates E. coli and trimethoprim 1 Trimethoprim 5 µg, hours incubation E. coli, 54 clinical isolates R 4 2 Inhibition zone diameter (mm) 1 Trimethoprim 5 µg, hours incubation E. coli, 54 clinical isolates 1h CBP 1 R< R Inhibition zone diameter (mm)

52 1 22 No of isolates 1 22 No of isolates E. coli and gentamicin 25 Gentamicin µg, hours incubation E. coli, 5 clinical isolates 15 R 5 Inhibition zone diameter (mm) 25 Gentamicin µg, hours incubation E. coli, 5 clinical isolates 15 1h CBP 17 R< 5 R Inhibition zone diameter (mm)

53 No of ioslates No of isolates E.coli and nitrofurantion 1 Nitrofurantoin µg, hours incubation E. coli, 54 clinical isolates R 4 2 Inhibition zone diameter (mm) 1 Nitrofurantoin µg, hours incubation E. coli, 54 clinical isolates 1h CBP 11 R< R Inhibition zone diameter (mm)

54 No of ioslates No of ioslates E. coli and tobramycin Tobramycin µg, hours incubation E. coli, 5 clinical isolates 1 R I 4 2 Inhibition zone diameter (mm) 25 Tobramycin µg, hours incubation E. coli, 5 clinical isolates 1h CBP R< R I Inhibition zone diamter (mm)

55 No of isolates No of isolates E. faecalis/faecium and ampicillin 1 Ampicillin 2 µg, h incubation Enterococcus, 4 isolates R 4 2 Inhibition zone diameter (mm) 1 Ampicillin 2 µg, h incubation Enterococcus, 4 isolates 1h CBP R< 4 2 R Inhibition zone diameter (mm)

56 No of isolates No of iosolates E. faecalis/faecium and linezolid 25 Linezolid µg, h incubation Enterococcus, 4 isolates 15 R 5 Inhibition zone diameter (mm) 25 Linezolid µg, h incubation Enterococcus, 4 isolates 15 1h CBP 19 R<19 5 Inhibition zones diameter (mm)

57 1 22 No of isolates 1 22 No of isolates E. faecalis/faecium and nitrofurantoin 1 Nitrofurantoin µg, h incubation Enterococcus, 4 isolates R 4 2 Inhibition zone diameter (mm) 1 Nitrofurantoin µg, h incubation Enterococcus, 4 isolates nitrofurantoin 1h CBP 15 R< R Inhibition zone diameter (mm)

58 h vs 1 h incubation Escherichia coli ATCC after h incubation. Escherichia coli ATCC and 1h incubation.

59 h vs 1 h incubation Enterococcus faecalis ATCC 292 after h incubation. Enterococcus faecalis ATCC 292 after 1h incubation.

60 ImagA -results ATCC ATCC Very unstable reading with the camera Our conclusion It is a software problem not a cameraproblem Manual adjustment of zones using the same pictures gives OK results

61 Conclusion It seems possible to standardise AT for - hours on MH agar. All species/antimicrobial combinations will probably not respond equally to a shorter incubation time and time-related zone diameter breakpoints might be needed. A standardised rapid AT method is now developed within the Eurostar project. P9