Komplementanalyser i teori och praktik Equalis användarmöte april 2016

Komplementanalyser i teori och praktik Equalis användarmöte 14-15 april 2016 Lillemor Skattum Klinisk immunologi och transfusionsmedicin, Lund 1

The Complement System. Figure from: Trends Immunol 23:61-64. 2002. Mollnes TE, Song WC, Lambris JD. 2

Classical Lectin Alternative C3 Amplification loop C3b 3

Komplementsystemet Aktivering Hämning Fördelar: Infektionsförsvar, reglering av adaptivt immunförsvar, hantering av apoptotiskt material, vävnadsregeneration m m Risker: Inflammation och cellskada 4

Komplementsystemet ~ 35 plasmaproteiner och membranbundna proteiner Flera komplementproteiner cirkulerar som proenzymer Kaskadsystem, aktivering via proteolytiska klyvningssteg Tre huvudsakliga aktiveringsvägar 5

Complement protein synthesis Hepatocytes in the liver produce the majority of the complement protein molecules found in serum (e. g. C4, C3, factor B and C1- INH) Monocytes are able to produce most (all) of the complement proteins Epithelial cells and fibroblasts are able to produce several complement proteins e. g. C3 C1q and properdin are produced by bone-marrow derived cells, not by hepatocytes Factor D (adipsin) is produced by fat cells 6

Biological effects of complement Scavenger effect Lymphocyte activation Virus neutralisation Opsonization Elimination of immune complexes Inflammatory response Clearance of apoptotic cell material by binding to C1q Binding of antigen-bound C3d to CR2 on B cells enhance antibody production Coating of virus with C3b prevents cell contact Coating of microbes with mainly C3b and/or ic3b increases phagocytosis Coating of IC with C3b and/or C4b, and binding to CR1 on erythrocytes and transport to the liver and the spleen Anaphylatoxins (C5a, C3a), Chemotaxis (C5a, C3a). Cytolysis Formation of the Membrane attack complex (MAC) 7

Komplementsystemet Klassiska vägen C1q C1r C1s Lektinvägen C4 C2 MBL/ficolin MASP B D P Alternativa vägen C3b C4b2b C3bBb C3 C3b Feedback loop (amplifiering) MAC C5b-C9 n C5 C4b2a3b C3b 2 Bb 8

Klassiska vägen C1q C1r C1s Lektinvägen C4 C2 MBL/ficolin MASP B D P Alternativa vägen C3b C4b2b C3bBb C3 C3b Feedback loop (amplifiering) MAC C5b-C9 n C5 C4b2a3b C3b 2 Bb 9

Klassiska vägen Aktivatorer: immunkomplex m ffa IgM eller IgG, CRP, pentraxin 3 Beroende av Ca++ och Mg++ Faktorer: C1, C4, C2 C3-konvertas: C4b2a 10

Lektinvägen Aktivatorer: vissa sackarider (mannos, N-acetylglukosamin, fucos m fl) Komplementfaktorer: mannos-bindande lektin (MBL)/ficolin 1, 2 resp. 3 MASP-1, -2, resp. -3 C4 C2 Beroende av Ca++ och Mg++ C3-konvertas: C4b2a Teizo Fujita, Nature Reviews Immunology 2, 346-353 (May 2002) 12

Alternativa vägen Aktivatorer: ytor m vissa egenskaper, vissa polysackarider Hydrolys av C3 + avsaknad av hämning Faktorer: C3, faktor B, faktor D, properdin Feedback och förstärkning av övriga aktiveringsvägar Beroende av Mg++ C3-konvertas: C3bBb 15

Terminala vägen C9 Startar med C5-aktivering (genererar C5a och C5b) C5b-7 C8 C9 C9 Faktorer: C5, C6, C7, C8, C9 Cellytiskt komplex, MAC (C5b-C9) bildas C6 C7 C5b C3b C5b-7 C5b-8 C9 MAC 17

Komplementreglering Classical pathway Antigen/antibody complexes MBL activation pathway Microbes with mannose groups Alternative pathway C1q-C1r 2 -C1s 2 C1-INH MBL-MASP s (ficolins) Activating surfaces (bacteria, fungi, virus or tumor cells) C3b C4 C2 B D P Factor I C4BP DAF MCP CR1 C3 C5 C6 C7 C8 C9 C5b-9 n Factor I Factor H/HL-1 DAF MCP CR1 CD59 S-protein Clusterin 18

Reglering av klassiska vägen: C1-inhibitor 19

Reglering av alternativa vägen: faktor H 20

Faktor H C3b C3b/C3c C3b/C3d NH 2 SCR 1 SCR 20 COOH SCR = short consensus repeat Silalinsyra, sulfaterade polyanjoner (celler) Faktor H-relaterade proteiner 1-5 NH 2 SCR 1 SCR(n) 4-9 SCR SCR = short consensus repeat 21

Faktor H och CFRH 1-5 Faktor H:s funktioner: Skyndar på sönderfall av C3-konvertaset Hindrar bildning av C3-konvertas Är kofaktor för faktor I vid nedbrytning av C3b Faktor H-relaterat protein 4 kan aktivera komplement (Hebecker M, Józsi M. Factor H-related protein 4 activates complement by serving as a platform for the assembly of alternative pathway C3 convertase via its interaction with C3b protein. J Biol Chem. 2012 Jun 1;287(23):19528-36). Faktor H-relaterade proteiner 1, 2 och 5 kan bilda homo- och heterodimerer med ökad affinitet för ligander: konkurrerar med faktor H (Goicoechea de Jorge, E., Caesar, J.J., Malik, T.H., Patel, M., Colledge, M., Johnson, S., Hakobyan, S., Morgan, B.P., Harris, C.L., Pickering, M.C., Lea, S.M., 2013. Dimerization of complement factor H-related proteins modulates complement activation in vivo. PNAS, 2013). 22

Komplementanalyser Funktion, respektive aktiveringsväg Enskilda komplementfaktorer: koncentration, funktion Aktiveringsprodukter: gemensamma för alla vägar eller specifika Autoantikroppar mot komplement Genetik: bristgenotyp/sjukdomsassocierad polymorfism eller mutation 23

Komplementanalyser Alltid vid komplementanalyser: risk för in vitro-aktivering som leder till sänkt funktion och ökade aktiveringsprodukter Provmaterial: minskad risk för in vitro-aktivering i plasma (EDTA) jämfört med serum Provhantering viktigt, rekommendationer: < 1 dygn: 4 C, vissa analyser kortare tid. Längre tid: fryst till -80(70) C. Lång transport: transport på torris. Undvik upprepad frysning/upptining 24

Analys av komplementfunktion Kvantitativ funktionsanalys: ELISA eller hemolysmetoder Kvalitativ funktionsanalys: Hemolys i gel 25

Analys av enskilda komplementfaktorer Enskilda komplementproteiner m. avs. på: Koncentration Funktion (ffa. komplementhämmare) Genetik Enzyme-linked immunoassay (ELISA) Immunelektrofores ( raket ) Automatiserad immunokemisk analys (ex nefelometri) 26

Analys av komplementaktiveringsprodukter C3-klyvning Exempel Komplementaktiveringsprodukt: C3d/C3dg fi Metod: T ex ELISA/nefelometri/ raketelektrofores Sequential digestion of C3, generating C3b, ic3b, C3c, C3dg, and C3d. Activation of C3 leads to disruption of the thiol ester (TE circular), which then establishes covalent bonds (TE linear). The interchain disulfide bonds are indicated (S S). Nilsson UR, Funke L, Nilsson B, Ekdahl KN. Two conformational forms of target-bound ic3b that distinctively bind complement receptors 1 and 2 and two specific monoclonal antibodies. Ups J Med Sci. 2011 Mar;116(1):26-33. 27

Kvalitetssäkring och standardisering av komplementanalyser EQUALIS-utskick från Klinisk immunologi Uppsala (C3, C4, C3dg, C1INH, C1q, funktion klassiska och alternativa vägarna) UKNeqas (C3, C4, C1INH konc. och funktion) Europeiskt initiativ (Ungern): Standardization of complement measurements, samarbete för External quality assessment startat 2009 28

Standardization of complement measurements 5 provutskick sedan 2010 Administreras av Instand e.v. (Tyskland) Senaste utskick (EQA5) 2015: 35 laboratorier, 20 parametrar Komplementfunktion klassiska, alternativa och lektinvägen C3, C4 C1q, C1INH (konc. och funktion), faktor H, faktor I anti-c1q, anti-c1inh (IgG/A/M), anti-fh, C3NeF aktiveringsprodukter C3dg, Bb, C3a, sc5b-c9 Laboratorierna i EQA5: blandning av små och stora laboratorier, kliniska resp. forskningslab Ca 40 % av laboratorierna tar emot >200 komplementprov/månad 29

Varierande analysmetoder inom Standardization of complement measurements Funktion klassiska vägen: olika typer hemolystest (17 lab), olika ELISA (9). Mer varierande resultat med hemolystester. Funktion alternativa vägen: olika hemolystest (11), olika ELISA (11). Mer varierande resultat med hemolystester och stor skillnad mellan hemolys och ELISA. Funktion lektinvägen: olika ELISA, (11), varierande resultat. Funktion C1-inhibitor: olika kromogena metoder (13), ELISA (5). Stor variation för kromogena metoder. Koncentration C1-inhibitor: nefelometri (13), RID (5), annat (3). Jämförelse svårt pga. små undergrupper och blandning av enheter (% av normalt, g/l). C3 och C4: nefelometri vanligast. Mkt varierande referensintervall. Skillnad mellan Siemens och Beckman: för C3 ca 0,25 g/l C3dg: raketelektrofores (4), ELISA (3). Jämförelser ej möjliga pga. olika enheter (g/l, % eller U/ml). Arbete pågår nu med att planera harmonisering med hjälp av rekommendationer 31

Kliniska komplementfrågeställningar 1. Misstänkt komplementbrist? Hereditär eller förvärvad? Vilken aktiveringsväg? 2. Ökad komplementaktivering? När är komplementutredning motiverad? 2 (1) el. fler invasiva bakteriella infektioner Meningokocksjukdom Misstänkt SLE/HUVS Angioödem/urtikaria utan känd orsak Atypiskt hemolytiskt uremiskt syndrom/c3-glomerulopati och membranproliferativ glomerulonefrit/poststreptokocknefrit Paroxysmal nocturnal hemoglobinuri 32

Medfödd komplementbrist i Sverige Komponent Antal kända fall Uppskattat antal C1q 8 C4 1 C2 ca 70 450 C3 2 C6 3 C7 18 C8 3 C9 1 Properdin 9 MBL >200 >500.000? MASP-2 1 C1 inhibitor >140 180 Faktor I 3 Faktor H 1 33

Brist i den klassiska vägen: risk för utveckling av SLE/SLE-liknande sjukdom C1qD: >90 % C1r/sD: ~ 60 % C4D: ~ 75 % C2D: ~ 20 % Ökad risk vid partiell brist (C4A0) Complement dysfunction and SLE a vicious circle? Sturfelt & Truedsson, Nature Rev Rheumatol, 2012 34

C2-brist Homozygot brist med total avsaknad av protein Samma mutation hos ~ 95% av alla m C2-brist Prevalens ca 1/20 000 Associerade sjukdomar: invasiva infektioner 57%, SLE 25%, andra reumatologiska sjukdomar 17%, kardiovaskulär sjukdom 15% (Jönsson G et al 2005) 35

Brist i de alternativa och terminala vägarna C3: infektioner med kapslade bakterier, glomerulonefrit, mer sällan SLE och andra autoimmuna sjukdomar Properdin, faktor B och faktor D: invasiva neisseriainfektioner Terminala vägen (C5-C9): upprepade invasiva infektioner med neisseria 36

Brist i övriga vägar Lektinvägen MBL (<100µg/L): ökad infektionsbenägenhet hos små barn och i samband med annan samtidig immunbrist MASP-2: första fall inflammatorisk tarmsjukdom, lungfibros, symtom från hud och leder, ytterligare enstaka fall varierande, oklart Ficolin 3 (fåtal patienter): oklart, eventuellt ökad risk för infektioner? Övrigt CD59/DAF: PNH vid förvärvad brist - tromboser, hemolys, medfödd brist hemolys och varierande neurologiska symtom 37

Brist på /dysfunktion av komplementhämmare C1-Inhibitor Hereditärt angioödem C4BP? 1 fall beskrivet Faktor H Dense deposit disease/membranproliferativ glomerulonefrit typ II Atypiskt hemolytiskt uremiskt syndrom (ahus) Åldersrelaterad makuladegeneration Faktor I Infektioner SLE, immunkomplexnefrit ahus CD59, CD55 Paroxysmal nocturnal hemoglobinuri (förvärvad) Neurologiska symtom och hemolys (medfödd) 38

Bakgrund till defekt komplementreglering vid ahus Mutationer i gener för komplementproteiner/hämmare: Faktor H hos 20-30 % (funktion ), sämst prognos MCP hos 5-15 % (försämrad funktion ) bäst prognos Faktor I hos 4-10 % (försämrad funktion ) Trombomodulin hos 3-5 % (funktion ) C3 hos 2-10 % (ökad funktion ) Faktor B hos 1-4 % (ökad funktion ) Autoantikroppar mot faktor H hos 6-10 % Oftast associerat med deletion av CFHR1 och CFHR3 39

C1-inhibitorbrist, Hereditärt angioödem (HAE) Prevalens ca 1/50 000 C1-inhibitorn i kininsystemet Heterozygot brist symtomgivande Högmolekylärt kininogen (HK) Prekallikrein FXIIa Bristande kontroll av serinproteaser Plasmakallikrein C1-INH Symptom beror på: Ökad bildning av bradykinin som ger vasodilation Bradykinin FXII 40

Polymorfism i komplementsystemet sjukdomsrisk, exempel Åldersrelaterad makuladegeneration (AMD): flera komplementfaktorer och hämmare framför allt allternativa vägen (McHarg S, Clark SJ, Day AJ, Bishop PN. Age-related macular degeneration and the role of the complement system. Mol Immunol. 2015 Sep;67(1):43-50.) Meningokockinfektion: polymorfa varianter av faktor H och C8B påverkar sjukdomsrisk (Bradley DT et al, Susceptibility to invasive meningococcal disease: polymorphism of complement system genes and Neisseria meningitidis factor H binding protein. PLoS One. 2015 Mar 23;10(3):e0120757) 41

Förvärvad komplementbrist Partiell orsak: minskad syntes eller ökad förlust (konsumtion) Varierande grad av symtom motsvarande dem vid hereditär komplementbrist Fluktuerande/tillfälliga symtom I vissa fall diagnostiskt hjälpmedel/aktivitetsmarkör Komplementfaktorer, komplementfunktion, aktiveringsprodukter (vid konsumtion) 42

Förvärvad komplementbrist Associerat tillstånd/orsak Påverkad aktiveringsväg/komplementfaktor SLE/annan immunkomplexsjukdom Infektion/sepsis C3 nephritic factors, akut poststreptokocknefrit Klassiska vägen Alternativa vägen C3, alternativa vägen Lymfoproliferativa sjukdomar, annan malignitet, autoimmun sjukdom Biomaterial (ex hjärt-lungmaskin) Nedsatt leverfunktion Hypogammaglobulinemi Komplementhämmande läkemedel anti-c5 (eculizumab) C1-inhibitor (C4, C1q) Alla komplementaktiveringsvägar (ffa. klassiska) De flesta faktorer utom C1q C1q C5 ingen bildning av MAC 43

Komplementaktivering? Aktiveringsprodukter gemensamma för alla aktiveringsvägar TCC (sc5b-c9), C3d, C3a, C5a Aktiveringsprodukter specifika för en viss aktiveringsväg C1rs-C1 INH, C4d, C4a, Bb, C3bBbP 44

Autoantikroppar mot komplementproteiner Vanligt vid flera tillstånd med komplementaktivering/förvärvad komplementbrist Kliniskt relevanta autoantikroppar mot komplementproteiner Antikroppar mot C1q Antikroppar mot C1-inhibitor C3 nephritic factors - C3NeF Antikroppar mot faktor H (Antikroppar mot MBL) ( C4 nephritic factors C4NeF) 45

Antikroppar mot C1q C1q: kollagen-lik del; binder C1r/C1s och cc1qr globulär del; binder Fc (IgG och IgM) och gc1qr Anti-C1q: riktade mot den kollagenlika delen av C1q, ofta av subklass IgG2-typ Förekommer hos ca 20-30 % av SLE-patienter, ffa patienter m njurengagemang Även vid HUVS (ca 100 %), membranproliferativ glomerulonefrit m. m. 46

Analys av antikroppar mot C1q ELISA 1. 2. Automatiserad ELISA (Alegria) Western blot (WB) av C1q-molekylens separerade kedjor (A, B och C) Reaktivitet mot B och C-kedjor vanligare vid HUVS än vid SLE (Mårtensson U, Sjöholm AG, Sturfelt G, Truedsson L, Laurell AB. Western blot analysis of human IgG reactive with the collagenous portion of C1q: evidence of distinct binding specificities. Scand J Immunol. 1992 Jun;35(6):735-44.) 47

Antikroppar mot C1-inhibitor Kan blockera C1-inhibitorns funktion eller öka konsumtionen av C1- inhibitorn Ofta riktade mot aktivt site i C1-INH Alla isotyper IgG, IgA, IgM beskrivna (ofta samma isotyp som patientens ev. M-komponent) Framför allt vid förvärvad brist på C1-inhbitor, AAE (prevalens okänd), även beskrivet vid HAE (enstaka) och SLE (17 % av 202 patienter) Förekomst kan motivera behandling med rituximab (Bygum A & Vestergaard H, Int Arch Allergy Immunol 2013) 48

In-house ELISA för antikroppar mot C1INH Alla isotyper IgG, IgA, IgM analyseras på alla patienter Indikation: misstänkt förvärvad brist på C1-inhibitor Tolkning: förekomst ökar sannolikheten för AAE relativt HAE men avsaknad utesluter inte AAE Antigen: C1-inhibitor från Comptech 49

C3 nephritic factors - C3NeF Autoantikroppar mot den alternativa vägens C3 konvertas (C3bBb) Förlänger halveringstid ökad C3-nedbrytning C3,C5 eller, C3d, P, funktion av alternativa vägen C3NeF Kontinuerligt låg C3-halt Heterogenitet avs. specificitet C3b Bb Koppling mellan olika C3NeF och kliniska parametrar dåligt känd Många tänkbara felkällor, framför allt för funktionstester Alternative pathway C3 convertase Flera analysmetoder i kombination rekommenderas (Paixão-Cavalcante D, López-Trascasa M, Skattum L, Giclas PC, Goodship TH, de Córdoba SR, Truedsson L, Morgan BP, Harris CL. Sensitive and specific assays for C3 nephritic factors clarify mechanisms underlying complement dysregulation. Kidney Int. 2012 Nov;82(10):1084-92.) 50

C3NeF Förekomst Vissa kroniska primära glomerulonefriter m dysreglering av den alternativa vägen: Dense deposit disease (tidigare: membranproliferativ glomerulonefrit, MPGN, typ II): >80 % C3 glomerulonefrit MPGN I/III 30-50 % Partiell lipodystrofi (förvärvad form) Enstaka fallbeskrivningar vid SLE och akut poststreptokocknefrit Infektionsbenägenhet ffa meningokocker Enstaka friska personer 51

C3NeF-analys: metoder Funktionstester Klassisk C3NeF hemolys: C3-konvertas byggs på cellytan med renade komplementfaktorer Hemolys enl. Rother Hemolys av innocent bystander -cell C3-nedbrytning i löslig fas Funktions-ELISA: neoepitop (Bb) påvisas efter inkubation av serum med C3, fb och fd Antikroppspåvisning ELISA 52

Analys av C3NeF Klassisk C3NeF hemolys-assay: C3-konvertas byggs på cellytan med renade komplementfaktorer C3 C3a D Ba C3NeF C4 C2 C4 C2 C3b C3b B Bb C3b Bb ShE ShE ShE ShE 53

Analys av C3NeF Hemolytisk test osensibiliserade fårblodkroppar (Rother U, 1982) MAC C3 NeF C3bBb ShE ShE Hemolys av innocent bystander -cell efter elfores av patientprov 54

Analys av C3NeF C3-nedbrytning i fluid phase med korsad immunelektrofores 55

Analys av C3NeF med ELISA Princip: alternativa vägens C3-konvertas byggs upp med renade komplementfaktorer i mikrotiterplatta Ni 2+ i buffert Patientserum eller renat IgG binder till konvertas (Seino et al, J Immunol Meth 1993, Paixao-Cavalcante et al, Kidney Int 2012) C3 Faktor B, faktor D, patientprov Konjugat Substrat ELISA, Lund 10 mm Mg 2+ Serum värmeinaktiverat Stor variation mellan plattor vid högre absorbansnivåer semikvantitativ analys Bakgrundskontroll: bindning till C3 Risk för falskt positivt resultat: 1 patient med faktor H-antikroppar är svagt positiv 56

Antikroppar mot faktor H vid ahus Binder C-terminala delen av faktor H Stör faktor H:s funktion sänkt C3-halt, ökad aktivering av komplement på cellytor Utöver ahus även beskrivet vid vissa reumatiska sjukdomar OCH DDD C3b C3b/C3c C3b/C3d NH 2 SCR 1 SCR 20 COOH SCR = short consensus repeat Silalinsyra, sulfaterade polyanjoner (celler) 57

Analys av antikroppar mot faktor H (ELISA) Harmonisering mot internationella enheter (Watson R, Lindner S, Bordereau P, Hunze EM, Tak F, Ngo S, Zipfel PF, Skerka C, Dragon-Durey MA, Marchbank KJ. Standardisation of the factor H autoantibody assay. Immunobiology. 2014) Ingår i Standardization of complement anlysis (pos/neg) Tycks kunna korsreagera i hemolystest för C3NeF (ökad hemolys) Hos vissa ahus-patienter med anti-faktor H är majoriteten av antikropparna i cirkulationen i komplex med faktor H implikationer för analys? Utöver ahus även beskrivet vid vissa reumatiska sjukdomar och C3- glomerulopati (binder N-terminala faktor H) 58

Till sist några nyheter Lektinvägsaktivering: Komplex av MASP-1 resp. MASP-2 med C1INH eller FXII MASP-1 och MASP-2 i komplex m C1INH eller FXII ökade hos hjärtinfarktpatienter och SLE-patienter med trombotisk/kardiovaskulär sjukdom (Kozarcanin H, Lood C, Munthe-Fog L, Sandholm K, Hamad OA, Bengtsson AA, Skjoedt MO, Huber-Lang M, Garred P, Ekdahl KN, Nilsson B. The lectin complement pathway serine proteases (MASPs) represent a possible crossroad between the coagulation and complement systems in thromboinflammation. J Thromb Haemost. 2016 Mar;14(3):531-45. ) Microarray/screening (Hamsten C, Skattum L, Truedsson L, von Döbeln U, Uhlén M, Schwenk JM, Hammarström L, Nilsson P, Neiman M. Heat differentiated complement factor profiling. J Proteomics. 2015 Aug 3;126:155-62.) Ny analysprincip för C1-inhibitorfunktion (Joseph K, et al, Allergy 2015) Kurs: Komplementsystemet biologisk funktion och klinisk diagnostik 6-9 dec, Lund 59

Tack! 60