Utvärdering av snabb resistensbestämning för Staphylococcus aureus och Streptococcus pneumoniae direkt från positiv blododlingsflaska

Fakulteten för hälso- och livsvetenskap Examensarbete Utvärdering av snabb resistensbestämning för Staphylococcus aureus och Streptococcus pneumoniae direkt från positiv blododlingsflaska Författare: Rebecka Aniansson Ämne: Biomedicinsk laboratorievetenskap Nivå: Grundnivå

Utvärdering av snabb resistensbestämning för Staphylococcus aureus och Streptococcus pneumoniae direkt från positiv blododlingsflaska Rebecka Aniansson Examensarbete i biomedicinsk laboratorievetenskap 15 högskolepoäng Filosofie Kandidatexamen Handledare: Examinator: Annika Wistedt Överläkare, specialist i klinisk bakteriologi, Medicine doktor Monika Filipsson Universitetslektor Britt-Inger Marklund Universitetslektor Klinisk mikrobiologi Länssjukhuset Hus 17, plan 4 391 85 Kalmar Linnéuniversitetet, Institutionen för biologi och miljö Hus Vita 392 31 Kalmar Linnéuniversitetet, Institutionen för kemi och biomedicin Hus Vita 392 31 Kalmar Examensarbetet ingår i programmet Biomedicinska analytikerprogrammet. Sammanfattning Sepsis är ett livshotande tillstånd som orsakas av bakterier i blodbanan. Tidig och korrekt antibiotikabehandling är viktig, antibiotikaresistens är ett ökande problem och resistensbestämning är därför essentiell. Vid sepsisdiagnostik med blododling krävs ofta minst två dygn innan resistensbesked kan ges. Antibiotikabehandling måste därför påbörjas innan odlingssvar. Rutinmetod för resistensbestämning vid svenska mikrobiologiska laboratorier är diskdiffusionsmetoden som är standardiserad av European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST). Vid diskdiffusion odlas bakterier på agarplattor och hämningszoner kring pappersdiskar med antibiotika används som mått på antibiotikaeffekt. Metoden kräver framväxta bakteriekolonier på agarplattor som ursprungsmaterial och utförandet tar 16-20 timmar. EUCAST har vidareutvecklat diskdiffusionsmetoden för snabb resistensbestämning (Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing, (RAST)). Resistensbestämning med diskdiffusion utförs då direkt från positiv blododlingsflaska och hämningszoner mäts redan efter 4, 6 och 8 timmar. I metoden används olika brytpunkter för känslighetskategorisering vid de olika tidpunkterna. Syftet med studien var att

undersöka hur väl RAST fungerade för Staphylococcus aureus och Streptococcus pneumoniae genom att undersöka bakterieisolat inokulerade i blododlingsflaskor. Totalt 31 isolat; 23 S.aureus och 8 S.pneumoniae undersöktes varav en hög andel med betalaktamresistens. Till båda bakteriearterna användes 5 sorters antibiotika. Zondiametrar mättes av två personer oberoende av varandra och resultaten jämfördes med de från standardiserad diskdiffusion. För S.aureus var vid 4 timmar 102/184 (55 %) avläsningar kategoriseringsbara, vid 6 timmar 164/184 (89 %) och vid 8 timmar 174/184 (95 %). Sammanlagt inträffade 7 felkategoriseringar varav 5 gällde underskattning av klindamycinresistens vid 4 timmar. S.pneumoniae hade sämre tillväxt och metoden var därför svårare att tillämpa. För S.pneumoniae var vid 4 timmar 74/80 (92 %) avläsningar kategoriseringsbara, vid 6 timmar 73/80 (91 %) och vid 8 timmar 77/80 (96 %). Resistens överskattades vid 21 zonmätningar vid 4 timmar. RAST fungerade väl för S.aureus efter 6 timmar. För S.pneumoniae kan sannolikt bedömning av penicillinresistens efter 6 timmar fungera men ytterligare undersökningar krävs. Nyckelord: MRSA, PNSP, diskdiffusion, blododling, antibiotikaresistens, RAST

Abstract Bacteria in the bloodstream may cause sepsis, therefore early and correct treatment is important. Antibiotic resistance is an increasing problem and antimicrobial susceptibility testing (AST) is essential for the patients survival. In sepsis with diagnosis based on blood culture, at least two days are required for results from AST. Routine AST-method in Swedish microbiological laboratories is the disc diffusion method standardized by the European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST). In disc diffusion, bacteria are grown on agar plates and inhibition zones around paper disks with antibiotics are used to measure the antibiotic effect. The method requires bacterial colonies as source material and takes 16 20 hours. EUCAST has further developed the method for Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing (RAST). RAST is performed directly from positive blood culture bottles and inhibition zones are measured at 4, 6 and 8 hours. The method uses different breakpoints for categorization at the different timepoints. The purpose of the study was to evaluate RAST for Staphylococcus aureus and Streptococcus pneumoniae by examining bacterial isolates inoculated into blood culture bottles. Zone diameters were measured, and results were compared with those of standardized disk diffusion. For S.aureus, at 4 hours 102/184 (55%) readings were categorizable, at 6 hours 164/184 (89%) and at 8 hours 174/184 (95%). A total of 7 error categorizations occurred, 5 of which were underestimation of clindamycin resistance at 4 hours. For S.pneumoniae at 4 hours, 74/80 (92%) readings were categorizable, at 6 hours 73/80 (91%) and at 8 hours 77/80 (96%). Resistance was overestimated at 21 zone measurements at 4 hours.. RAST showed good results for S.aureus after 6 hours. For S.pneumoniae, further studies are required but RAST may work after 6 hours for penicillin resistance assessment.

Förkortningar APB AST ATP ATU CCUG erm EUCAST MALDI-TOF MS ME MH-agar MHF-agar MLSB MRSA PBP PCR PNSP R ROS RAST S VME Adsorbent Polymeric Beads Antimicrobial Susceptibility Testing Adenosintrifosfat Area of Technical Uncertainty Culture Collection University of Gothenburg Erytromycin Ribosomal Methylase European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry Major Error Mueller Hinton-agar Mueller Hinton Fastidious-agar Makrolid-Linkosamid-Streptogramin B MeticillinResistent Staphylococcus aureus PenicillinBindande Protein Polymerase Chain Reaction Penicillin-Non-Susceptible Pneumococci Resistent Reaktiva syreföreningar Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing Sensitiv Very Major Error

Innehållsförteckning 1 Introduktion 1 1.1 Sepsis 1 1.2 Blododlingsprocess 2 1.3 Staphylococcus aureus 2 1.4 Streptococcus pneumoniae 3 1.5 Antibiotika 4 1.6 Resistensbestämning eller Antimicrobial Susceptibility Testing (AST) 5 1.7 Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing 7 1.8 Syfte 8 2 Material och metod 8 2.1 Stammar 8 2.2 Förberedelser 9 2.3 Rapid antimicrobial susceptibility testing 10 2.4 Viable count 13 2.5 Avläsningsvariation 13 2.6 Standardiserad diskdiffusion 13 2.7 Etik 14 3 Resultat 14 3.1 Staphylococcus aureus 14 3.1.1 Kontroller 14 3.1.2 Kliniska isolat 16 3.2 Streptococcus pneumoniae 17 3.2.1 Kontroller 17 3.2.2 Kliniska isolat 19 3.1 Avläsningsvariation 20 4 Diskussion 21 4.1 Avläsningsvariation 21 4.2 Staphylococcus aureus 22 4.3 Streptococcus pneumoniae 23 4.4 Ekonomiska aspekter och klinisk relevans 24 4.5 Slutsats 25 Referenser 26 Bilaga I Rådata Staphylococcus aureus kontrollstammar Bilaga II Rådata Staphylococcus aureus mätvärden Bilaga III Rådata Streptococcus pneumoniae kontrollstammar Bilaga IV Rådata Streptococcus pneumoniae mätvärden

1 Introduktion Bakterier kan orsaka flera olika typer av infektioner (1). Ett exempel är sepsis (blodförgiftning) som utan en snabb och korrekt behandling kan vara dödligt (2). Dagens behandling vid bakterieinfektion är antibiotika, men resistens mot antibiotika hos bakterier är ett allt mer ökande problem (1). För att avgöra om en bakterie i blodet är resistent används vanligen metoder som ofta tar minst två dygn från att patienten provtagits för sepsis (3). Då mortaliteten vid sepsis ökar med varje timme utan korrekt behandling är det viktigt med en snabb utredning (2). I detta arbete kommer därför en ny alternativ metod utvärderas och jämföras mot en standardmetod, och dess tillämpbarhet kommer diskuteras. 1.1 Sepsis Vid vissa allvarliga infektioner kan bakterier nå blodbanan (bakteriemi). I många fall innebär det mycket allvarliga symptom (sepsis) och en risk för septisk chock med en livshotande organdysfunktion som följd av infektionen och immunsvaret på denna (2). Sepsis orsakar årligen runt 6 miljoner dödsfall i världen. Organdysfunktion som uppstår vid sepsis orsakas av syrebrist i organen på grund av ett flertal reaktioner från immunförsvaret. Exempel på organ som påverkas är lungorna, njurarna, magtarmkanalen, levern och dessutom ses nedsatt funktion hos blod-hjärnbarriären (4). Bakterierna kan komma från bland annat lungorna, urinvägarna eller via en hudinfektion och några av de vanligaste patogenerna som orsakar sepsis är Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes och Streptococcus pneumoniae (5). Snabb och korrekt behandling i ett tidigt skede vid sepsis är mycket viktigt. Om korrekt antibiotikabehandling sätts in inom den första timmen av septisk chock är överlevnadschanserna ca 80 % och enligt flera studier ökar mortaliteten för varje timme med fördröjd antibiotikabehandling (2). Riskerna vid försenad behandling är högre ju mer allvarligt sjuk patienten är, och det är inte enbart den första antibiotikadosen som kan vara livsavgörande utan även de efterföljande (6). För att ställa sepsisdiagnosen görs odlingar från patientens blod. Direkt efter att blodprovet tagits sätts en bred antibiotikabehandling in utan att invänta odlingsresultatet (7). 1

1.2 Blododlingsprocess Vid misstanke om sepsis görs vanligtvis blododlingar i fyra flaskor om två par där varje par består av en aerob och en anaerob flaska (8). Vid det kliniskt mikrobiologiska laboratoriet vid länssjukhuset i Kalmar län används blododlingssystemet BacT/ALERT Virtuo från biomérieux. I botten på blododlingsflaskorna finns en ph-indikator som ändrar färg vid en ph-sänkning. Då mikroorganismer tillväxer produceras koldioxid vilket leder till en ph-förändring. Flaskorna placeras i ett så kallat blododlingsskåp där de inkuberas i värme. I blododlingsskåpet läses färgförändringen på ph-indikatorn av och flaskan indikeras som positiv då en ph-förändring registrerats. Om ingen förändring registreras efter ett bestämt antal dagar bedöms flaskan som negativ (9). I flaskorna finns det Adsorbent Polymeric Beads (APB) som binder och hämmar vissa typer av antibiotika (10). Flaskorna innehåller dessutom bland annat peptonextrakt, antikoagulanter, vitaminer, kolkällor och spårelement (11, 12) samt en blandning av gaserna koldioxid, syre och kväve i den aeroba flaskan (11) och koldioxid och kväve i den anaeroba flaskan (12). Vid det kliniskt mikrobiologiska laboratoriet på länssjukhuset i Kalmar län utförs en gramfärgning på material från den positiva blododlingsflaskan för att bedöma gramreaktion och morfologi. Innehåll från flaskan appliceras även på agarplattor som inkuberas (13). När tillväxt skett på agarplatta (ofta inom 4-8 timmar) görs en artbestämning av bakterien med instrumentet Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectometry (MALDI-TOF MS) och beroende på resultatet utförs en antibiotikaresistensbestämning med diskdiffusionsmetoden eller gradienttest (se avsnitt 1.5) av bakterien (14). Resistensbestämningen läses av dagen därpå (3) men för vissa snabbväxande gramnegativa stavar kan gradienttest användas för en snabb bedömning av resistensen inom 4-8 timmar (15). 1.3 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus är en grampositiv kock som växer i klasar (1). Bakterien koloniserar ca 10 40 % av alla vuxna (5). S.aureus kan bland annat orsaka hudinfektioner, sepsis och pneumoni (lunginflammation) (1). För att diagnostisera en S.aureus-orsakad infektion görs bakterieodlingar. I Sverige består 2

behandling av isoxazolylpenicilliner eller andra betalaktamasstabila antibiotika som förstahandsalternativ (5). Anledningen till att de ska vara betalaktamasstabila är att ca 90 % av alla S.aureus producerar betalaktamas (16) som binder till betalaktamringen som finns i alla penicilliner, karbapenemer och cefalosporiner, vilket leder till nedbrytning av antibiotika (se avsnitt 1.5). Om patienten är allergisk mot penicillin kan exempelvis klindamycin ges (5). Meticillinresistenta Staphylococcus aureus (MRSA) upptäcktes i början av 1960-talet. Genen som ger meticillinresistens kallas för meca (16). De betalaktamasstabila penicillinerna som är verksamma mot vanliga S.aureus verkar genom att binda till penicillinbindande protein (PBP) i bakteriens membran. meca kodar för en annan typ av PBP (PBP2a) som de flesta betalaktamantibiotika inklusive isoxazolylpenicilliner inte kan binda till (5). År 2017 upptäcktes 37 fall med MRSA per 100 000 invånare i Sverige och i Kalmar län 72 fall per 100 000 invånare (17). Enligt lokal statistik vid kliniskt mikrobiologiska laboratoriet på länssjukhuset i Kalmar län var det år 2018 158 patienter som diagnosticerats med S.aureus i blodet varav 2 MRSA. 1.4 Streptococcus pneumoniae Streptococcus pneumoniae är en grampositiv kock som ofta växer i par (diplokocker) eller kedjor (1, 5). Bakterien koloniserar främst yngre barn (18). Den kan bland annat orsaka svåra sjukdomar som lunginflammation, öroninflammation, meningit (hjärnhinneinflammation), endokardit (inflammation i hjärtklaffarna) och sepsis (1). Behandlingen vid pneumokockinfektioner består vanligtvis av penicilliner. Pneumokockerna kan utveckla en penicillinresistens och då kan behandlingen istället ske med erytromycin eller klindamycin (5). Då pneumokockerna utvecklat en resistens mot penicillin kallas de för pneumokocker med nedsatt känslighet för penicillin (PNSP, Penicillin-Non-Susceptible Pneumococci). År 2017 upptäcktes 0,6 fall med resistenta S.pneumoniae per 100 000 invånare i Sverige och i Kalmar län 0,82 fall per 100 000 invånare (19). Enligt lokal statistik vid kliniskt mikrobiologiska laboratoriet på länssjukhuset i Kalmar län hade år 2018 39 patienter S.pneumoniae i blodet varav 2 PNSP. 3

1.5 Antibiotika Vid behandling av bakteriella infektioner används antibiotika eller så kallade antimikrobiella medel (1). Det finns en stor variation av antibiotika med olika breda spektrum och olika verkningsmekanismer. De kan bland annat påverka DNA-syntesen på olika sätt, påverka RNA-syntesen, hämma proteinsyntesen och blockera cellväggssyntesen (20). β-laktamantibiotika är ett exempel på antibiotika som blockerar cellväggssyntesen hos bakterier. Till gruppen β-laktamantibiotika hör bland annat penicillinerna och cefalosporiner. Vid bakteriernas cellväggssyntes är ett membranbundet transmembranprotein aktivt som katalysator. Detta protein är ett PBP och hämmas av β-laktamantibiotika där en β-laktamring är den aktiva komponenten. Hämningen av proteinet leder till att vissa reaktioner som ska ske vid cellväggssyntesen hämmas, cellväggen blir då instabil och bakterien lyserar (20). β-laktamantibiotika är ofta förstahandsvalet för behandling vid infektioner av bland annat S.aureus och S.pneumoniae (5). Vid penicillinallergi är behandling med klindamycin ett alternativ (5). Klindamycin tillhör antibiotikagruppen makrolid-linkosamid-streptogramin B (MLSB) (21) som verkar genom att binda till ribosomen och stoppa proteinsyntesen (22). Att bakterierna utvecklar resistens mot antibiotika är ett ökande problem (5). Olika typer av resistensmekanismer har utvecklats hos bakterier, bland annat flera mekanismer som leder till en nedsatt känslighet för β-laktamantibiotika (23). Exempelvis kan de ibland producera enzymet β-laktamas. Enzymet binder till β-laktamringen i β-laktamantibiotika och spjälkar β-laktamringen och inaktiverar därmed antibiotikan. Detta är den vanligaste resistensmekanismen mot β-laktamantibiotika (20). En annan resistensmekanism mot β- laktamantibiotika är att PBP förändras vilket förekommer hos både S.aureus och S.pneumoniae. Förändringen hos PBP leder till en låg affinitet för betalaktamer (20). S.aureus får en förändring av PBP genom att genen meca kodar för en annan typ av PBP (5). Hos S.pneumoniae utvecklas resistensen med flera stegvisa punktmutationer istället (20). 4

Som svar på β-laktamasorsakad resistens utvecklades isoxazolylpenicilliner som har en isoxazolylgrupp som skyddar β-laktamringen och därmed gör antibiotikan mer betalaktamasstabil. Dock fungerar dessa antibiotika inte om bakterien utvecklat ett nytt eller förändrat PBP (20). Vissa bakterier kan ha en så kallad inducerbar klindamycinresistens. Det ser då ut som att den är känslig för klindamycin vid resistensbestämning in vitro, samtidigt som den är resistent mot makroliden erytromycin (21). Detta beror på att en förändring skett på ribosomerna tack vare en erytromycin ribosomal metylas (erm)-gen. När en makrolid (exempelvis erytromycin) binder till bakterien uttrycks erm-genen och en resistens mot bland annat klindamycin uppstår då bindningsstället på ribosomen förändras (22). För att upptäcka denna resistensmekanism måste resistensbestämningen anpassas (24) (se avsnitt 1.6). 1.6 Resistensbestämning eller Antimicrobial Susceptibility Testing (AST) Antimicrobial Susceptibility Testing (AST) är metoder för att undersöka antibiotikaresistensmönstret hos olika bakterier. Exempel på en metod för detta är diskdiffusionsmetoden. Diskdiffusionsmetoden baseras på att pappersdiskar impregnerats med en känd mängd antibiotika. Disken placeras på en agarplatta med nyutstrukna bakterier och antibiotika diffunderar ut i agarn och bildar en koncentrationsgradient. Om bakterien är känslig mot antibiotikan kan den inte växa nära disken (1). Detta ses som en klar zon där bakterierna inte växer. Zonen mäts och zondiametern jämförs med bestämda SIR-brytpunkter (sensitiv, intermediär, resistent) för att klassificera om bakterien är möjlig att behandla eller inte (25). Sensitiv innebär att bakterien är känslig, intermediär står för att bakterien är känslig vid ökad exponering och att bakterien är resistent innebär att den inte är känslig trots höga antibiotikakoncentrationer (26). EUCAST (EUropean Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) har tagit fram en standardiserad metod med bestämda brytpunkter 5

för diskdiffusion. Metoden är kalibrerad mot referensmetoden buljongspädning (25). Den standardiserade diskdiffusionsmetoden innebär att bakteriekolonier från en övernattskultur slammas i 0,9 % NaCl tills suspensionen, som mäts turbidimetriskt når 0,5 ± 0,1 McFarland. Suspensionen sprids tätt på Mueller Hinton (MH) agar eller Mueller Hinton fastidious (MHF) agar för hand eller med rotator helst inom 15 min och absolut inom 60 min. Inom 15 minuter ska antibiotikadiskarna appliceras på plattan och då detta har gjorts ska plattan inom 15 minuter placeras i 35 ± 1 C i 16 20 h. MH-plattorna inkuberas i luft och MHF-plattorna i 5 ± 1 % CO2 i inkubator. Vid avläsning bör en tydlig matta med bakterier ses så att zonerna runt diskarna är tydliga (25). Vid felaktiga resultat används uttrycken major error (ME) som innebär att isolatet felaktigt bedöms som resistent och very major error (VME) som innebär att isolatet felaktigt bedöms som känsligt (27). För att upptäcka inducerbar klindamycinresistens kan en klindamycindisk och en erytromycindisk placeras nära varandra på agarplattan. Erytromycinet inducerar då klindamycinresistensen och på agarplattan kan en skarp kant ses mellan erytromycin och klindamycin ( D-zon ) (24) se figur 1. Figur 1 Inducerad klindamycinresistens där en "D-zon" kan ses med en kant på klindamycinzonen på den sida som är mot erytromycindisken. Bild tagen under det laborativa arbetet. 6

Ett annat exempel på en resistensbestämningsmetod är gradienttest. Metoden baseras likt diskdiffusionsmetoden på att antibiotika diffunderar ut i agarn på en platta med nyutstrukna bakterier. Istället för pappersdiskar med antibiotika används en plastremsa som är impregnerad med en antibiotikagradient och bakteriens känslighetsnivå kan bedömas genom att avläsa vid vilken antibiotikakoncentration bakterieväxten tangerar plastremsan. Detta jämförs med förutbestämda värden för att avgöra om bakterien är resistent eller känslig (1). 1.7 Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing Det finns även snabba metoder för resistensbestämning, exempelvis Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing (RAST). EUCAST har tagit fram en snabb metod för resistensbestämning direkt från blododlingsflaskor och metoden innebär att 100 150 μl av innehållet i blododlingsflaskan droppas på en MH- eller MHF-platta och stryks ut tätt över hela plattan. Utvalda antibiotikadiskar beroende på bakterieart placeras på plattan. Plattorna inkuberas i samma miljöer som vid den standardiserade diskdiffusionsmetoden och efter 4 timmar ± 5 minuter avläses plattorna. De får enbart vara ute i rumstemperatur i 10 minuter och zonerna ska ha tydliga avgränsningar för att kunna mätas. Om avläsning inte kan ske återinkuberas plattorna och de kan då läsas av efter 6 eller 8 timmar istället. För varje avläsningstillfälle (4, 6 och 8 timmar) och art finns specifika brytpunkter framtagna. Brytpunkterna blir något större för varje avläsningstillfälle, dvs att en ökning av zonstorleken ses under de första timmarna. Dessa brytpunkter är för tillfället endast bestämda för 8 olika bakteriearter och bara vissa specifika antibiotika. Plattorna ska avläsas framifrån utan lock, med ljus reflekterande i plattan och i ca 45 graders vinkel, MH-plattan mot mörk bakgrund och MHF-plattan mot ljus bakgrund (28). Mellan brytpunkterna för känslighet och resistens finns Area of Technical Uncertainty (ATU) där resultatet är osäkert och inget resultat kan lämnas ut vid den aktuella tidpunkten (25). En annan variant av snabb resistensbestämning direkt från positiva blododlingsflaskor är PCR (Polymerase Chain Reaction) för specifika resistensgener (29). Det finns också en snabb resistensbestämningsmetod direkt från positiva blododlingsflaskor för enbart gramnegativa stavar som redan används vid det kliniskt mikrobiologiska laboratoriet på 7

länssjukhuset i Kalmar län. Metoden som används är gradienttest på en agarplatta där blodkulturen strukits ut och resultatet avläses efter tidigast 4 timmar (15). 1.8 Syfte Syftet med undersökningen var att utvärdera EUCAST s metod Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing (RAST) för Staphylococcus aureus samt Streptococcus pneumoniae och jämföra resultaten med de från den standardiserade diskdiffusionsmetoden. Arbetet avser att besvara följande frågeställningar: 1. Är resultaten från EUCAST s metod RAST likvärdiga med resultat från standardiserad diskdiffusionsmetod? 2. Kan metoden tillämpas på ett säkert och effektivt sätt i klinisk rutindiagnostik på det kliniskt mikrobiologiska laboratoriet vid Länssjukhuset i Kalmar? 2 Material och metod 2.1 Stammar Under det praktiska arbetet användes två kontrollstammar till försöken med S.aureus. Stammarna kom från Culture Collection University of Gothenburg (CCUG). CCUG15915 är en S.aureus från sår, vilken ofta rekommenderas som känslig referensstam (30). CCUG35600 är en S.aureus som är resistent mot meticillin/oxacillin, tetracyklin, erytromycin, klindamycin och känslig för gentamicin (31). För kontrollstammen CCUG15915 fanns bestämda målvärden och målintervall för zonstorlekarna bestämda av EUCAST. Andra stammar som användes var från patientprover tagna från olika lokaler (sår, blod m fl.) samt stammar som skickats till laboratoriet för kvalitetskontroll. Av isolaten var det 16 kända MRSA-stammar som användes samt 7 känsliga S.aureus. De resistenta stammarna hämtades från -80 C frys och de känsliga stammarna hämtades från den dagliga rutinen på laboratoriet. Samtliga stammar var sedan tidigare bekräftade S.aureus samt resistensbestämda med diskdiffusion. Samtliga MRSA-stammar var verifierade med meca- 8

PCR. Av stammarna var 1 gentamicinresistent, 3 norfloxacinresistenta samt 7 klindamycinresistenta varav 5 hade inducerbar klindamycinresistens. Kontrollstammarna som användes vid försöken med S.pneumoniae var CCUG33638 som är en penicillinresistent S.pneumoniae från sputum (32) samt en stam som tidigare erhållits som extern kontroll på laboratoriet. Den var alltså inte inköpt utan skickad till laboratoriet som kontroll och hade sedan sparats och saknade därför stambeteckning. Den var känslig för penicillin. För kontrollstammen CCUG33638 fanns bestämda målvärden och målintervall för zonstorlekarna bestämda av EUCAST. Kliniska isolat utgjordes av 6 penicillinresistenta stammar samt 2 penicillinkänsliga stammar. Stammarna var frysta i -80 C och bestod av isolat från patientprover samt stammar som skickats till laboratoriet för kvalitetskontroll. Av stammarna var 2 resistenta mot trimethoprim-sulfamethoxazol, 1 stam var klindamycinresistent, 4 erytromycinresistenta och alla stammar var känsliga för norfloxacin. 2.2 Förberedelser De frysta stammarna som skulle användas togs från frys och spreds på blodagarplattor (Columbia Blood Agar Base, Acumedia 7125, NEOGEN Lansing, USA) med bomullspinne medan de stammar som hämtades från den dagliga rutinen spreds med 1 µl platinös. Kolonier av kontrollstammarna plockades från blodagarplattor i en kyl på laboratoriet. Isolaten spreds på blodagarplattor med 1 μl-platinös. Alla plattor placerades i termostat 34-36ºC över natt. Kolonier från stammar som inkuberats över natt slammades i 1,5 ml NaCl 0,9 % tills 0,5 McFarland uppnåtts, vilket kontrollerades med DensiCheck plus (biomérieux, Inc, Durham, USA). Tre rör per stam fylldes med 1,089 ml NaCl 0,9 %. Av de slammade bakterierna pipetterades 11 μl till ett av dessa rör för att uppnå en spädning på 1:100. Röret vortexades (Vortex-Genie 2, Scientific Industries, New York, USA) och 11 μl togs från detta rör och tillfördes till nästa rör vilket gav en spädning på 1:10 000. Detta upprepades till det sista röret vilket gav en slutlig spädning på 1:1 000 000. Mellan varje spädning vortexades rören noggrant. 9

Aeroba blododlingsflaskor (BACT/ALERT FA Plus, lot 4052283, biomérieux, Inc, Durham, USA) till S.aureus och anaeroba blododlingsflaskor (BacT/ALERT FN Plus Anaerob, lot 4051919, biomérieux, Inc, Durham, USA) till S.pneumoniae märktes upp. Gummimembranet på flaskorna steriliserades genom att 99,9 % etanol droppades på det och brändes av. Spruta 5 ml Omnifix S med kanyl, injektion 1,2 x 50 mm rosa, Sterican 18 G x2 användes för att dra upp 5 ml defibrinerat hästblod (Håtunalab AB; Håtunaholm, Sverige). Blodet sprutades ner i flaskorna. Gummimembranet på flaskorna desinficerades igen. Spruta 1 ml MX Omnifix S med kanyl användes för att dra upp och spruta ner 1 ml av de spädda bakteriesuspensionerna i flaskorna. Gummimembranen desinficerades och brändes av igen och placerades i instrumentet BacT/ALERT Virtuo (biomérieux, Inc, Durham, USA). Metoden ovan följde rekommenderad Quality control (QC) -metod från EUCAST (27). Första dagen ympades enbart dubbelprover av de två kontrollstammarna av S.aureus, där det sista spädningssteget utfördes i två rör för att uppnå en tillräcklig mängd. Under första perioden av studien analyserades S.aureus och därefter S.pneumoniae; 2 4 av de kliniska isolaten samt de två kontrollstammarna av samma art som de kliniska isolaten analyserades varje dag. 2.3 Rapid antimicrobial susceptibility testing De positiva flaskorna togs ur blododlingsskåpet på morgonen, flaskorna hade indikerats positiva 5 11 timmar innan de hämtades. Gummimembranet på flaskorna steriliserades genom att 99,9 % etanol droppades på det och brändes av. En steril ventilationsnål (sterile airway needle/subculture units) stacks i flaskorna och ca 6 droppar blod blandat med flaskinnehåll droppades på en MH-platta (agarbas från OXOID, Basingstoke, UK) för S.aureus och på en MHF-platta för S.pneumoniae. Antalet droppar från de positiva blododlingsflaskorna som skulle användas beräknades genom att ett visst antal droppar från en blododlingsflaska droppades i ett rör. Innehållet i röret sögs upp med en 1 ml spruta och volymen noterades. Målet var volymen 100 150 µl. 10

Provet spreds tätt på plattorna med bomullspinne när plattorna stod på en plattrotator (Retro C80, biomérieux, Marcy-l'Étoile, Frankrike). Antibiotikadiskar i tabell I applicerades på MH-plattan enligt figur 2 och antibiotikadiskarna i tabell II applicerades på MHF-plattorna enligt figur 3. För att detektera MRSA användes cefoxitin (33) och för att detektera PNSP användes oxacillin (34). Klockslaget för inkubering antecknades och MHplattorna placerades i termostat 34-36ºC och MHF-plattorna placerades i 34-36ºC i en inkubator (BINDER, Tuttlingen, Tyskland) med 5 % CO2 atmosfär. Tabell I De antibiotikadiskar som använts för resistensbestämning av S.aureus. Antibiotika Styrka (µg) Förkortning Tillverkare Lot Cefoxitin 30 FOX OXOID, Basingstoke, UK 2369739 Norfloxacin 10 NOR OXOID, Basingstoke, UK 2307141 Gentamicin 10 CN OXOID, Basingstoke, UK 2384907 Klindamycin 2 DA OXOID, Basingstoke, UK 2127202 Erytromycin 15 E OXOID, Basingstoke, UK 2322760 Figur 2 Schema för antibiotikadiskarnas placering på Mueller-Hintonplattorna S.aureus odlades på. NOR står för norfloxacin, DA står för klindamycin, E står för erytromycin, FOX står för cefoxitin och CN för gentamicin. 11

Tabell II De antibiotikadiskar som använts för resistensbestämning av S.pneumoniae. Antibiotika Styrka (µg) Förkortning Tillverkare Lot Oxacillin 1 OX OXOID, Basingstoke, UK 1836707 Norfloxacin 10 NOR OXOID, Basingstoke, UK 2307141 Klindamycin 2 DA OXOID, Basingstoke, UK 2127202 Erytromycin 15 E OXOID, Basingstoke, UK 2322760 Trimethoprim-sulfamethoxazole 25 SXT OXOID, Basingstoke, UK 2412888 Figur 3 Schema för antibiotikadiskarnas placering på Mueller-Hinton-fastidiousplattorna S.pneumoniae odlades på. NOR står för norfloxacin, DA står för klindamycin, E står för erytromycin, OX står för oxacillin och SXT för trimethoprim-sulfamethoxazol. Plattorna togs ut från termostaten och eventuella zoner runt diskarna mättes av två personer oberoende av varandra. Till hjälp i detta arbete användes den personal på laboratoriet som för dagen var placerad på arbetsstationen för blododlingar. Detta innebar att totalt 8 olika personer med behörighet för resistensavläsning deltog vid zonregistreringarna. Således erhölls 2 zonregistreringar för varje platta efter 4 timmars inkubering ± 5 min. Inom 10 min återinkuberades plattorna. Proceduren upprepades efter 6 och 8 timmar. Zondiametrarna jämfördes med brytpunkterna för bedömning vid RAST enligt tabell från EUCAST (35). För S.aureus-isolaten mättes inte zonerna runt erytromycindisken då brytpunkter inte är framtagna. Erytromycin användes enbart för att upptäcka inducerbar klindamycinresistens (28). 12

Alla uppmätta zondiametrar registrerades i ett diagram i Excel för att kunna ställa resultatet från RAST mot resultaten från standardiserad diskdiffusion. 2.4 Viable count Vid ett tillfälle per bakterieart kontrollerades tätheten i inokulatet vid bakterietillsats till blododlingsflaskorna. Vid korrekt spädning skulle det vara 100-200 colony forming units (CFU)/ml. Spädning utfördes på samma sätt som då bakterier skulle sättas till blododlingsflaskor. Från röret med spädningen 1:1 000 000 pipetterades 100 μl upp med automatpipett och spreds på blodagarplatta. Plattorna inkuberades i termostat 34-36ºC över natt och därefter räknades kolonierna på plattan. Det skulle vara 10 20 kolonier på plattan för att spädningen skulle kunna godkännas. 2.5 Avläsningsvariation Avläsningsvariationen mellan personal på laboratoriet kontrollerades genom att ytterligare en platta för snabb resistensbestämning inokulerades. Denna platta användes för obereoende zonavläsning av 6 personer efter 6 timmars inkubering. Uppmätta zondiametrar antecknades. 2.6 Standardiserad diskdiffusion Standardiserad diskdiffusion enligt EUCAST s metod användes för att bestämma bakteriernas resistens eller känslighet. Kolonier från blodagar av stammar som odlats över natt slammades i 1,5 ml NaCl 0,9 % tills 0,5 ± 0,1 McFarland uppnåtts, vilket kontrollerades med DensiCheck plus. En steril bomullspinne användes för att jämnt stryka ut de slammade S.aureus på en MH-platta och S.pneumoniae på en MHF-platta med hjälp av plattrotator (24). Antibiotikadiskarna i tabell I placerades enligt schemat i figur 2 på MH-plattorna, antibiotikadiskarna i tabell II placerades enligt figur 3 på MHF-plattorna. MH-plattorna placerades i termostat i 34-36ºC och MHF-plattorna i 34-36ºC med 5 % CO2 i 16 20 h. 13

2.7 Etik Under hela försöket har de isolat som använts inte kopplats till någon patientinformation. Detta leder till att patientens integritet skyddas. Vid tillfällen där patientdata varit synlig, exempelvis vid kontroll av tidigare resultat gäller sekretessen (offentlighets- och sekretesslagen, ((2009:400 OSL) kap 25, 1 ). Etikprövning krävs inte för laboratorieundersökningar med enbart bakterier. 3 Resultat 3.1 Staphylococcus aureus 3.1.1 Kontroller Mätvärden från RAST av kontrollstammen CCUG15915 (känslig S.aureus) jämfördes med av EUCAST bestämda målvärden och målintervall. Sammanlagt 5 gånger var resultat utanför målintervallet, norfloxacin efter 4 timmar och klindamycin vid alla mättillfällen. 30 mätningar utfördes per mättillfälle och antibiotikadisk. Av de beräknade medianerna var klindamycin under målvärdet efter 4 timmar och gentamicin under målvärdet efter 6 timmar, se tabell III. För rådata se bilaga I tabell X, XI och XII. 14

Tabell III Tabellen visar medianen och de högsta och lägsta värdena från resultatet för kontrollstammen CCUG15915 (S.aureus) vid de dagliga mätningarna efter 4, 6 och 8 timmar samt av EUCAST bestämda målvärden och målintervall. Röd färg indikerar att medianen inte stämde överens med målvärdet eller att högsta/lägsta värden inte låg inom målintervallet. Antibiotika Målvärde (mm) Zondiameter (median, Målintervall (mm) Lägsta uppmätta värde (mm) Högsta uppmätta värde (mm) mm) 4h Cefoxitin 17 17 15 19 15 18 Norfloxacin 15 15 13 17 13 18 Gentamicin 16 17 16 14 19 14 19 Klindamycin 17 18 16 15 20 14 18 6h Cefoxitin 19 20 20 17 22 18 21 Norfloxacin 16 17 17 14 19 14 19 Gentamicin 18 17 15 21 15 19 Klindamycin 20 19,5 17 23 16 23 8h Cefoxitin 21 22 22 19 24 21 23 Norfloxacin 17 18 18 15 20 15 20 Gentamicin 18 18 15 21 16 20 Klindamycin 21 21 18 24 17 22 För kontrollstammen CCUG35600 (MRSA) saknas bestämda målvärden och målintervall vid RAST-metoden. Av 30 mätningar per mättillfälle och antibiotika skedde en felkategorisering för cefoxitin efter 4 timmar. För beräknad median, högsta och lägsta värde efter 4, 6 och 8 timmar se tabell IV. För rådata se bilaga I tabell XIII, tabell XIV och tabell XV. 15

Tabell IV Tabellen visar medianen och de högsta och lägsta värdena från resultatet för kontrollstammen CCUG35600 (MRSA) vid de dagliga mätningarna efter 4, 6 och 8 timmar. Till höger visas EUCAST s brytpunkter. Röd färg innebär att en felkategorisering skett. Antibiotika Zondiameter Lägsta Högsta S ATU R < (median, mm) uppmätta värde (mm) uppmätta värde (mm) 4h Cefoxitin 14 12 16 16 15 15 Norfloxacin 14 11 16 13 12 - Gentamicin 13 11 16 14 12 13 12 Klindamycin 7 7 7 16 15-6h Cefoxitin 14,5 13 16 18 17 17 Norfloxacin 16 14 18 14 13 13 Gentamicin 14,5 13 16 15 13 14 13 Klindamycin 7 7 7 19 16 18 16 8h Cefoxitin 15 13 16 19 18 18 Norfloxacin 18 16 20 15 14 14 Gentamicin 15 14 17 16 14 15 14 Klindamycin 7 7 7 19 16 18 16 3.1.2 Kliniska isolat Resultatet från RAST-metoden visar att inga av de testade kliniska stammarna felkategoriserades för norfloxacin, cefoxitin eller gentamicin efter sammanlagt 414 mätningar (tabell V). För klindamycin har 5 mätningar visat VME efter 4 timmar, och en mätning efter 6 timmar. En stam hade även ett ME efter 6 timmar. För rådata från RAST samt den standardiserade diskdiffusionsmetoden se bilaga II tabell XVI. Efter 4 timmar var det sammanlagt 63 av 184 avläsningar på 23 plattor som inte kunde bedömas. Efter 6 och 8 timmar kunde samtliga zoner läsas av. 92 zoner bedömdes av två personer vid tre tidpunkter. Vid 4 timmar var 102/184 (55 %) avläsningar kategoriseringsbara (utanför ATU). Vid 6 timmar var 164/184 (89 %) avläsningar 16

kategoriseringsbara. Vid 8 timmar var 174/184 (95 %) kategoriseringsbara. Av de sammanlagt 552 mätningarna var alltså 440 kategoriseringsbara. Samtliga MRSA kunde detekteras redan vid 6 timmar. Tabell V Resultatet för 23 S.aureus-stammar med 4 antibiotikadiskar som lästes av vid 3 avläsningstillfällen. Vid varje avläsningstillfälle har 2 separata registreringar av varje zon gjorts av 2 oberoende avläsare. Gul färg innebär att avläsning inte kunnat utföras eller att zonen hamnat i ATU-zonen och därmed inte ger ett rapporteringsbart resultat. Röd färg innebär att en felkategorisering skett. D står för D-zon. Siffrorna visar antalet mätningar. Cefoxitin 4h 6h 8h R ATU S Ej läsbar R ATU S Ej läsbar R ATU S Ej läsbar Totalt Förväntat resistenta 25 0 0 5 30 0 0 0 30 0 0 0 30 Förväntat känsliga 0 1 10 5 0 1 15 0 0 0 16 0 16 Norfloxacin 4h 6h 8h Ej läsbar R ATU S Ej läsbar R ATU S Ej läsbar Totalt R ATU S Förväntat resistenta 0 1 0 5 6 0 0 0 6 0 0 0 6 Förväntat känsliga 0 3 23 14 0 2 38 0 0 0 40 0 40 Gentamicin 4h 6h 8h Ej läsbar R ATU S Ej läsbar R ATU S Ej läsbar Totalt R ATU S Förväntat resistenta 0 0 0 2 2 0 0 0 2 0 0 0 2 Förväntat känsliga 0 7 27 10 0 2 42 0 0 3 41 0 44 Klindamycin 4h 6h 8h Ej läsbar R D ATU S Ej läsbar R D ATU S Ej läsbar Totalt R D ATU S Förväntat resistenta 1 0 3 5 5 5 8 0 1 0 4 10 0 0 0 14 Förväntat känsliga 0 0 4 11 17 1 0 16 16 0 0 0 7 25 0 32 3.2 Streptococcus pneumoniae 3.2.1 Kontroller För kontrollstammen CCUG33638 (PNSP) var medianen vid 9 tillfällen lägre än målvärdet. Detta gällde all testad antibiotika efter 4 timmar och alla utom oxacillin efter 8 timmar. Sammanlagt 10 mätvärden var lägre än målintervallet efter 4 timmar, varav 5 för 17

erytromycin (se tabell VI). För rådata se bilaga III tabell XVII, XVIII och XIX. Tabell VI Tabellen visar medianen och de högsta och lägsta värdena från resultatet för kontrollstammen CCUG33638 (PNSP) från 30 mätningar per antibiotika på 15 plattor efter 4, 6 och 8 timmar i relation till angivet målvärde och accepterat målintervall från EUCAST. Röd färg indikerar att medianen inte stämde överens med målvärdet eller att högsta/lägsta värden inte låg inom målintervallet. Antibiotika Målvärde (mm) Zondiameter (median, mm) Målintervall (mm) Lägsta uppmätta värde (mm) Högsta uppmätta värde (mm) 4h Oxacillin 10 9 8 12 8 10 Trimethoprimsulfamethoxazol 16 14 13 19 12 16 Norfloxacin 14 15 12 12 17 10 13 Klindamycin 17 18 15 15 20 14 16 Erytromycin 19 14,5 16 22 12 16 6h Oxacillin 11 11 9 13 10 11 Trimethoprimsulfamethoxazol 17 16,5 14 20 15 18 Norfloxacin 15 16 15 13 18 14 15 Klindamycin 18 19 18 16 21 17 19 Erytromycin 21 20,5 18 24 20 21 8h Oxacillin 11 12 11 9 14 10 12 Trimethoprimsulfamethoxazol 17 16 14 20 14 19 Norfloxacin 16 15 13 19 14 16 Klindamycin 19 17,5 16 22 16 18 Erytromycin 22 20,5 19 25 19 22 Den känsliga kontrollstammen saknar bestämda målvärden och målintervall. Efter 4 timmar gjordes vid 10 tillfällen felkategoriseringar med överskattning av resistens för framförallt klindamycin men även erytromycin och norfloxacin. För lägsta och högsta värde samt median se tabell VII. För rådata se bilaga III tabell XX, tabell XXI och tabell XXII. 18

Tabell VII Tabellen visar den medianen och de högsta och lägsta värdena från resultatet för den känsliga kontrollstammen (S.pneumoniae) från 30 mätningar per antibiotika på 15 plattor efter 4, 6 och 8 timmar. Till höger visas EUCAST s bestämda brytpunkter. Röd färg innebär att en felkategorisering skett. Zondiameter (median, mm) Lägsta uppmätta värde (mm) 4h Högsta uppmätta värde (mm) S ATU R < Oxacillin 16 14 16 16 14 15 14 Trimethoprimsulfamethoxazol 14,5 11 15 12 10 11 10 Norfloxacin 11,5 6 13 11 9 10 9 Klindamycin 14 12 16 17 15 16 15 Erytromycin 16,5 14 20 19 17 18 17 6h Oxacillin 18 18 19 19 17 18 17 Trimethoprimsulfamethoxazol 18 17 19 12 10 11 10 Norfloxacin 13,5 12 15 12 10 11 10 Klindamycin 18 17 20 17 15 16 15 Erytromycin 21,5 19 22 19 17 18 17 8h Oxacillin 20,5 19 22 20 18 19 18 Trimethoprimsulfamethoxazol 21 17 22 12 10 11 10 Norfloxacin 15 13 16 12 10 11 10 Klindamycin 20 18 22 17 15 16 15 Erytromycin 24 21 25 19 17 18 17 3.2.2 Kliniska isolat Resultatet för RAST-metoden visar att inga av de testade kliniska stammarna uppvisat VME eller ME för oxacillin. För Trimethoprim-sulfamethoxazol var det efter 4 timmar och 80 avläsningar en felkategorisering, för norfloxacin 2, klindamycin 13 och erytromycin 5. Det var sammanlagt 21 felkategoriseringar vid 224 kategoriseringsbara mätningar på 8 stammar. 40 zoner bedömdes av två personer vid tre tidpunkter. Vid 4 timmar var 74/80 (92 %) avläsningar kategoriseringsbara (utanför ATU). Vid 6 timmar var 73/80 (91 %) avläsningar kategoriseringsbara. Vid 8 timmar var 77/80 (96 %) kategoriseringsbara. Samtliga PNSP kunde detekteras efter 4 timmar. För rådata från RAST samt den standardiserade diskdiffusionsmetoden se bilaga IV tabell XXIII. 19

Tabell VIII Resultatet för 8 S.pneumoniae-stammar med 5 antibiotikadiskar som lästes av vid 3 avläsningstillfällen. Vid varje avläsningstillfälle har 2 separata registreringar av varje zon gjorts av 2 oberoende avläsare. Gul färg innebär att avläsning inte kunnat utföras eller att zonen hamnat i ATU-zonen och därmed inte får svaras ut. Röd färg innebär att en felkategorisering skett. Siffrorna visar antalet mätningar. Oxacillin 4h 6h 8h R ATU S Ej läsbar R ATU S Ej läsbar R ATU S Ej läsbar Totalt Förväntat resistenta 12 0 0 0 12 0 0 0 12 0 0 0 12 Förväntat känsliga 0 0 4 0 0 0 4 0 0 0 4 0 4 Trimethoprimsulfamethoxazol 4h 6h 8h R ATU S Ej läsbar R ATU S Ej läsbar R ATU S Ej läsbar Totalt Förväntat resistenta 4 0 0 0 2 2 0 0 3 1 0 0 4 Förväntat känsliga 1 0 11 0 0 0 12 0 0 0 12 0 12 Norfloxacin 4h 6h 8h R ATU S Ej läsbar R ATU S Ej läsbar R ATU S Ej läsbar Totalt Förväntat resistenta 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Förväntat känsliga 2 4 10 0 0 0 16 0 0 0 16 0 16 Klindamycin 4h 6h 8h R ATU S Ej läsbar R ATU S Ej läsbar R ATU S Ej läsbar Totalt Förväntat resistenta 2 0 0 0 0 2 0 0 0 1 1 0 2 Förväntat känsliga 12 1 1 0 0 3 11 0 0 1 13 0 14 Erytromycin 4h 6h 8h R ATU S Ej läsbar R ATU S Ej läsbar R ATU S Ej läsbar Totalt Förväntat resistenta 8 0 0 0 8 0 0 0 8 0 0 0 8 Förväntat känsliga 5 1 2 0 0 0 8 0 0 0 8 0 8 3.1 Avläsningsvariation Variationen i avläsningen undersöktes genom att personal på laboratoriet efter 6 timmar läste av samma platta. Avläsningsvariationen var olika för olika antibiotika (tabell IX). Variationen var överlag liten men var störst för norfloxacin som gav en dubbel zon och klindamycinzonen som hade något otydlig zonkant. 20

Tabell IX Tabellen visar resultatet från undersökningen av avläsningsvariationen. Sex personer i personalen som har behörighet för resistensbestämning mätte zonerna på samma platta efter 6 timmars inkubering. Antibiotika Uppmätta zondiametrar (mm) Intervall (mm) Cefoxitin 12 11 11 11 11 11 11 12 Norfloxacin 9 6 8 9 8 8 6 9 Gentamicin 12 11 11 11 11 11 11 12 Klindamycin 19 24 20 19 21 19 19 24 4 Diskussion Syftet med studien var att undersöka hur väl RAST-metoden fungerade på S.aureus och S.pneumoniae jämfört med EUCAST s standardiserade diskdiffusionsmetod. Resultaten var varierande då metoden fungerade relativt väl för S.aureus när resultaten jämfördes med de från standardiserad diskdiffusion medan det för S.pneumoniae skedde ett stort antal felkategoriseringar. 4.1 Avläsningsvariation Avläsningsvariationen bland laboratoriepersonalen kan påverka resultat. Under studien var det mycket få tillfällen där endast en av avläsarna felkategoriserat. Den undersökning av avläsningsvariation som utfördes visade att personalen som mest mätte med 5 mm skillnad på en disk medan skillnaderna var mycket små på två av diskarna. På laboratoriet finns dokument där kontrollstammar resistensbestämts med diskdiffusion vid upprepade tillfällen och då är den största variationen 4 mm för S.aureus. Zonerna är svårare att läsa av vid RAST då bakterien haft kort tid att växa och för att kunna se zoner kan det vara nödvändigt att hitta en väldigt exakt vinkel i förhållande till ljuset. Detta är något personalen inte är vana vid vilket kan ha bidragit till variationen. Vid vissa tillfällen inträffade det att en av avläsarna tolkade det som att bakterierna växte intill disken även då 21

ingen växt var synlig. Materialet från blododlingsflaskan misstolkades alltså som tillväxt vilket ledde till felkategorisering. Under första försöksdagen upptäcktes det att rotator till spridning på agarplatta var nödvändigt då zonerna var svårare att tyda om spridning gjordes för hand. Det var även viktigt att sprida proverna på agarplattorna snabbt då blodet rann ut från mitten av plattan och sjönk ner i agarn och färgen störde avläsningen. 4.2 Staphylococcus aureus Resultaten för S.aureus visade att 35 % av zonerna inte kunde mätas efter 4 timmar. Av dessa var majoriteten de där ingen av de två avläsarna kunde se några zoner. Vid de övriga tillfällen då zon inte kunnat läsas av var det bara en person som inte kunde se en zon. Majoriteten av dessa gällde klindamycinzonen. Efter 4 timmar var det dessutom 5 resultat med felkategoriseringar med underskattning av resistens för klindamycin. Alla resultat kunde läsas av efter 6 och 8 timmar även om det var 21 mätvärden av 184 i ATU-zonen efter 6 timmar och 10 mätvärden av 184 i ATU-zonen efter 8 timmar. Detta innebär att resultatet inte skulle kunna svaras ut om metoden användes i rutinarbetet på laboratoriet. De 5 mätvärden som efter 4 timmar gjorde att stammarna bedömdes som känsliga trots att de var resistenta berodde på inducerbar klindamycinresistens. Efter 4 timmar var Dfenomenet inte synligt vilket ledde till felaktig bedömning. Efter 6 timmar var det vid ett mättillfälle där den inducerbara klindamycinresistensen inte upptäcktes. Att mäta zoner efter 4 timmar kan efter denna studie bedömas osäkert då den inducerbara klindamycinresistensen inte upptäcks samt att flera zoner inte kan läsas av. Vid 36 tillfällen kunde cefoxitinzonen läsas av redan efter 4 timmar och vid endast 10 tillfällen var den inte avläsningsbar. Därför skulle det eventuellt vara möjligt att använda RAST för enbart cefoxitin efter 4 timmar. 22

4.3 Streptococcus pneumoniae För S.pneumoniae var det större problem än för S.aureus med felkategoriseringar. Detta gällde både kontrollstammarna och de kliniska isolaten. Vid mätningar efter 4 timmar skedde 20 ME vid 80 mätningar för de kliniska isolaten. Av dessa 80 mätningar skulle 26 mätvärden påvisa resistens och ME kan därmed inte uppstå för dem. Detta innebär att 20 av 54 mätningar resulterade i felkategoriseringar med överskattning av resistens. Efter 6 timmar skedde inga felkategoriseringar och efter 8 h erhölls ett enstaka avvikande resultat som inte kontrollerats vidare. Det är oklart varför så många fel uppstått för RAST vid analys av S.pneumoniae men bakterien har varit något mer problematisk än S.aureus under arbetet. S.aureus i blododlingsflaskor har varit i blododlingsskåpen i ca 19 timmar innan de resistensbestämts med RAST. Odlingarna har larmat positiva efter 9 11 h men plockats ur ytterligare 10 h senare då de blivit positiva under natten. När S.pneumoniae hanterades på samma sätt överlevde de inte till morgonen och inget kunde växa vid RAST. För att öka överlevnadschanserna placerades flaskorna i blododlingsskåpet senare på dagen i aeroba flaskor och då ökade överlevnaden men tillväxten var fortfarande så dålig att inget kunde avläsas efter 4 timmar. Nya försök utfördes med anaeroba flaskor istället för aeroba som sattes ännu senare på eftermiddagen och togs ur tidigare på morgonen. De befann sig då enbart ca 3 5 timmar i blododlingsskåpet efter larmtid och zoner kunde läsas av efter 4 timmar. Endast dessa resultat med urladdning max 3-5 timmar efter positivt larm har redovisats i studien. En möjlighet är att bakterierna i den positiva blododlingsflaskan påverkats negativt av den förlängda inkubationstiden i flaskan. Det är välkänt på laboratoriet att Streptococcus pneumoniae har en sämre återväxt jämfört med de flesta andra bakteriearter efter en tids förvaring på fasta eller i flytande medier (36). Något som stärker teorin men inte bekräftar den är att det sista provet (se rådata i bilaga IV) är det enda som uppvisat en känslig klindamycinzon redan efter 4 h. Detta specifika prov kom från en flaska som till skillnad från alla andra inte var positiv då de skulle tas ur på morgonen utan blev positiv senare och därmed kunde hanteras direkt efter positivt larm. 23

Inga felkategoriseringar gjordes för oxacillin. Oxacillin används för att upptäcka PNSP (35) och det skulle därför vara önskvärt att kunna använda metoden för enbart oxacillin men då endast två oxacillinkänsliga stammar samt kontrollstammen använts finns inte tillräckligt mycket data för att säkerställa att felkategoriseringar inte kan ske för oxacillin. Med fortsatta undersökningar kan metoden förhoppningsvis användas för oxacillinresistensbestämning efter 6 timmar. 4.4 Ekonomiska aspekter och klinisk relevans Då mortaliteten ökar varje timme efter att septisk chock uppstått (2) kan det vara livsavgörande att en resistens upptäcks så pass mycket tidigare som den gör vid RAST än med standardmetoden. Det kan också tilläggas att en sepsispatient som intensivvårdas kostar ca 300 000 kr (5) vilket innebär att en snabbare vård som leder till ett tidigare tillfrisknande även är positivt ur ett ekonomiskt perspektiv. Under 2018 var det enligt lokal statistik endast 4 fall av MRSA och PNSP, vilket innebär att metoden i många fall kommer vara onödig för att en korrekt behandling ska ges i tid eftersom den primära sepsisbehandlingen då fungerar. Men metoden är viktig för de patienter som är drabbade, även om Sverige har relativt få fall. Infektioner av resistenta bakterier är det betydligt vanligare i andra länder där det ibland kan vara över hälften av alla S.aureus-infektioner som orsakas av MRSA (5). Om det blir lika vanligt i Sverige kan det vara viktigt att redan ha en väl fungerande metod för snabb diagnostik. Under studien användes en stor mängd engångsmaterial i form av blododlingsflaskor, sprutor och kanyler. Då de kontaminerades med bakterier kunde de inte sorteras miljövänligt enligt material utan i gula avfallsbackar för smittförande material samt stickande/skärande material. Övrigt material sorterades som plast och papper. Vid användning av metoden kliniskt används endast en liten mängd material (agarplattor och antibiotikadiskar). Fortsatt undersökning av metoden skulle förutom att inkludera fler oxacillinkänsliga S.pneumoniae kunna innefatta ytterligare försök för att se skillnaderna mellan aeroba och 24