Länge har serologi med hemagglutination

Transkript

1 Nordiskt referenslaboratorium för genomisk blodgruppstypning finns i Lund AV ÅSA HELLBERG, ANNIKA HULT, MARTIN L OLSSON, OCH ELISABETH SJÖBERG WESTER, BLODCENTRALEN SKÅNE, UNIVERSITETSSJUKHUSET, LUND Länge har serologi med hemagglutination varit den gällande blodgrupperingsmetodiken. Nu är även genteknik tillgänglig och i Lund finns det Nordiska referenslaboratoriet för genomisk blodgruppstypning. I analyssortimentet finns metoder för att detektera de arvsanlag som ger upphov till kliniskt viktiga blodgrupper. Laboratoriet är det första i sitt slag som ackrediterats av SWEDAC. Drygt 90 blodcentraler Vid Sveriges drygt 90 blodcentraler används hemagglutination för att detektera blodgruppsantigen och -antikroppar. Detta sker i dag på nästan samma sätt som på tidigt 1900-tal då Karl Landsteiner, upptäckaren av ABO-systemet, blandade blod från sig själv och sina kolleger i provrör för att se vad som skedde. Nästan 30 blodgruppssystem Blodgrupper bärs av molekyler (proteiner, glykoproteiner, glykolipider) på erytrocytens yta. Ett flertal av dessa molekyler förekommer även på andra cellslag, t.ex. ABO-systemets kolhydratstrukturer som finns på många olika typer av kroppens celler. För att en molekyl ska klassificeras som blodgrupp krävs att den ärvs och förkommer i olika varianter, samt att minst en människa har bildat antikroppar mot ett antigen på molekylen i fråga. Utvecklingen från Karl Landsteiners tid har lett till att idag är 29 olika blodgruppssystem kända. Inom varje system finns olika varianter. Se Figur 1. ABO-systemet är det viktigaste ur klinisk synvinkel då s.k. naturliga antikroppar (anti-a och anti-b) förekommer. Andra viktiga system är t.ex. Rh, Kell, Duffy och Kidd. Blodgruppssystemen har ofta fått sina namn efter upptäckaren eller den patient där upptäckten gjordes. Varje individ har sin unika uppsättning av blodgruppsmolekyler och har ärvt gener för dessa av båda föräldrarna. Varierande frekvens av en viss blodgruppsvariant förekommer i olika populationer, t.ex. blodgrupp A som förekommer i 43% hos vita, 27% hos svarta, 28% hos asiater och i 0% hos latinamerikanska indianer. Med kännedom om detta kan blodgruppering användas för rättsmedicinska och antropologiska studier. Idag är såväl molekyl, gen som i många fall funktion välkänd för flertalet blodgruppssystem och International Society of Blood Transfusion har utarbetat standardiserad numrering och benämning av dessa. Se Figur 2. Blodgruppsantikroppar bildas efter immunisering Förutom ABO-antikropparna kan ytterligare antikroppar bildas p.g.a. transfusion, transplantation och/eller graviditet av den individ som exponeras för en blodgruppsmolekyl som han/hon själv saknar. Antikropparna kan ge upphov till hemolys vid ny transfusion eller hemolytisk sjukdom hos nyfödda (HDN). Den mest välkända orsaken till blodgruppsantikroppar är när en RhD negativ, blivande mamma bildar antikroppar mot sitt RhD positiva foster, som har ärvt sitt RhD-status från pappan. Två serologiska analyser före transfusion Prov 1: ABO och RhD-bestämning utförs både på blodgivare och patient. På givaren sker det i samband med anmälan inför blodgivning och upprepas därefter varje gång en påse blod lämnas. Prov på patienten tas t.ex. i samband med att han/hon sätts på väntelista inför operation. Prov 2: Inför transfusion tas ett nytt prov på patienten. En enkel bekräftelse av blodgrupperingen utförs för att kontrollera patientens identitet. Dessutom utreds om patienten har bildat några blodgruppsantikroppar sedan föregående analys. Testerytrocyter Till skillnad från testreagens som köps från kommersiella fabrikanter, erhålls testerytrocyter till serologin från speciellt utvalda blodgivare. För att kunna detektera blodgruppsantikroppar på ett säkert sätt krävs testerytrocyter från blodgivare av blodgrupp O samt med vissa antigen i homozygot uppsättning. Hur urvalet ska ske regleras via Handbok för Blodcentraler som ges ut av Svensk förening för transfusionsmedicin. Figur 1. Skiss över erytrocyt med olika typer av blodgruppsmolekyler. 6 LABORATORIET 3/2004

2 FENOTYP GENOTYP Vilka blodgruppsmolekyler finns på erytrocytens yta? Frågeställning Vilka blodgruppsgener finns i genomet? Hemagglutination Metod Polymerase Chain Reaction Erytrocyter Viktiga celler i provet Kärnförande celler Erytrocyterna tvättas med koksaltlösning och späds till lämplig koncentration Cellpreparation DNA prepareras fram ur cellkärnan och späds till lämplig koncentration Analys Antikroppar och erytrocyter blandas i ett rör som inkuberas och/eller centrifugeras DNA, primers, nukleotider och DNApolymerasenzym blandas i ett provrör. Mångfaldigande av DNA-sekvens sker via cykliska temperaturförändringar. Positiv reaktion Avläsning Kontrollband Antikroppen har bundit till sitt antigen och erytrocyterna bildar synliga agglutinat. Specifika band Negativ reaktion Positiv reaktion Negativ reaktion Elektrofores på agarosgel. Om sökt DNA-sekvens har mångfaldigats syns detta som ett band då agarosgelen belyses med UV-ljus. Jämförelse mellan fenotypning med hemagglutination och genotypning med PCR-teknik. LABORATORIET 3/2004 7

3 Nr Namn Symbol Gen Alleler# Kromosom Molekyl Funktion 001 ABO ABO ABO A, B, O 9q q34.2 Kolhydrat Okänd 002 MNS MNS GYPA M, N, S, s 4q28 -q31 Glykokonjugat* Okänd GYPB GYPE 004 Rh RH RHD RHD 1p p34 Protein Transport RHCE RHCe, RHcE RHCE, RHce 006 Kell KEL KEL K, k 7q33 Glykoprotein Enzym 008 Duffy FY FY FYA, FYB 1q22 - q23 Glykoprotein Kemokinreceptor 009 Kidd JK JK JKA, JKB 18q q11.2 Glykoprotein Transport 0014 Dombrock DO DO DOA, DOB 12p p12.1 Glykoprotein Okänd Figur 2. Ett urval blodgruppssystem, baserat på de analyser som utförs vid laboratoriet för blodgruppsgenomisk typning. # Endast vanligt förekommande alleler anges. * Glykokonjugat = kolhydrat i glykolipid eller glykoprotein. Utredning av oklarheter Om oklarheter som s.k. svaga blodgruppsvarianter eller antikroppar mot blodgrupper upptäcks, sker en utredning för att förklara fyndet. Fram till för c:a 10 år sedan användes enbart serologi med hemagglutinationsmetodik, men numera finns även molekylärbiologisk metodik att tillgå. Dock används oftast metoderna i kombination då det är en stor fördel att kunna koppla resultat från genotypning med serologi. Blodcentralen Skåne & Avd. för Transfusionsmedicin Vid Lunds Universitet finns Avdelningen för tranfusionsmedicin där forskning bedrivs inom projektet Målmolekyler och skyddsmekanismer vid blodgruppsrelaterad hemolys Genetiska och funktionella studier. Forskningsgruppen som leds av docent Martin L Olsson består f.n. av ytterligare åtta personer: en docent i medicinsk kemi, en post-doc och sex doktorander, varav två läkare och fyra biomedicinska analytiker. Gruppens medlemmar är dessutom verksamma inom Blodcentralen Skåne. Vägen mellan forskning och klinik är därmed mycket kort, i själva verket är mycket av forskningsverksamheten lokaliserad inom Blodcentralens lokaler. För att kvalitetssäkra den kliniskt diagnostiska verksamheten i samma modell som vid övriga Blodcentralen Skåne granskades denna av SWEDAC hösten Flertalet metoder baseras på den egna gruppens forskning. I de fall andra publicerade metoder används har dessa speciellt utprövats, ofta som kandidat- eller magisterprojekt i samverkan med de biomedicinska analytikerutbildningarna vid Lunds Universitet eller Malmö Högskola. När används blodgruppsgenomisk typning? Vanliga indikationer är: bestämning av fosterblodgrupp (foster till immuniserad, gravid kvinna). oberoende analys vid oklara resultat t.ex. vid ABO- eller Rh-gruppering. alternativ till fenotypning om patienten har fått blod (s.k. transfusionsblandbild) eller är positiv med direkt agglutinationsteknik (DAT). bekräftelse av homozygoti, hos: - givare av testerytrocyter, - den blivande pappan för att bedöma risken att fostret kommer att ärva antigenet som mamman är immuniserad mot. Prover från hela världen Vid nordiskt överläkarmöte 2001 utsågs den kliniska verksamheten till Nordiskt referenslaboratorium, men prov anländer även från andra delar av världen. Rutinmässigt tas venprov i rör med EDTA-tillsats. Ur detta kan man utvinna erytrocyter och blodgruppsantikroppar till serologisk analys, men även DNA till genetisk analys. För analys av DNA kan även annat provmaterial användas under förutsättning att det innehåller kärnförande celler. För att fastställa fosterblodgrupp kan provtagning ske från navelsträng, moderkaka eller fostervatten. En speciell remiss är utformad för att säkerställa att all information av vikt medföljer provmaterialet. I denna anges bl.a. typ av provmaterial, patientens etniska tillhörighet och tidigare serologiska resultat. Den kliniskt diagnostiska verksamheten sköts av biomedicinska analytiker från Blodcentralens laboratorium med behörighet att utföra och tolka analyserna. Efter en första svarsformulering i datorsystemet granskas detta av biomedicinsk analytiker med högre behörighet och slutgiltigt godkännande sker av läkare. Blodgruppsgenomisk typning med PCR-teknik I mitten av 1980-talet publicerades Polymerase Chain Reaction (PCR) som kom att revolutionera molekylärbiologin. PCR är en snabb, enkel och relativt billig metod som fått snabb spridning från forskning till klinisk diagnostik. Inom flera verksamheter som klinisk kemi, genetik, mikrobiologi och patologi har användandet av PCR-metoder förenklat och förbättrat befintliga analyser. Detta har skapat förutsättningar för nya analystyper med hög känslighet. Inom transfusionsmedicin har utvecklingen framför allt gällt PCR-baserad HLAtypning och virologiska analyser vid testning av blodgivare, medan antalet blodgruppsrelaterade användningsområden har varit relativt få. På senare år har realtids-pcr, en mycket känslig metod, börjat användas inom transfusionsmedicinen. Med denna kan fritt foster-dna i den gravida kvinnans plasma detekteras. Det innebär att den minimala halten foster-dna kan skiljas från mammans, under förutsättning att de båda har olika varianter av den undersökta genen. Detektion av fritt foster-dna i mammans plasma är under utprövning i Lund enligt den metod som används vid Internationella Referenslaboratoriet (IBGRL) i Bristol U.K. Under 2004 kommer bestämning av RHc och RHD att kunna erbjudas som klinisk analys. Analyssortimentet i Lund Vid rutinanalys används flera principer för att säkerställa resultatet: flera positioner inom varje gen undersöks. 8 LABORATORIET 3/2004

4 Lis Nertsberg är en av de biomedicinska analytiker som har behörighet att utföra blodgruppsgenomisk typning. och /eller kombinationer av metoder så som PCR-ASP och PCR-RFLP utförs. Prover som inte går att lösa inom klinisk rutin går ofta vidare till t.ex. sekvensbestämning för att finna orsaken till det avvikande resultatet. ABO-systemet av ABO utförs för att kunna fastställa patientens blodgrupp då serologisk analys gett oklara resultat. Ofta rör det sig om förvärvade eller ärftliga varianter med svagare uttryck som benämns A- eller B-undergrupper. Dessa kan vara svåra, tidsödande eller omöjliga att definiera via serologin. Exempel på förvärvade ABO-fenotyper är svagt A-uttryck vid blodsjukdom eller förvärvat B-antigen vid exempelvis sepsis då bakterieenzymer kan omvandla A-antigen till B. RH-systemet RH-systemet består av två gener: RHD som avgör RhD positiv/negativ fenotyp och RHCE som ger upphov till antigenen C, E, c och e. Den i vår population vanligaste orsaken till RhD negativ fenotyp är total avsaknad av RHD. I vissa andra populationer förekommer en inaktiv, tyst RHD-gen som kallas RHD-pseudogenen. RH-typning innebär flera analyser där olika varianter (normalt, partiellt och svagt uttryck) av D- och CE-alleler inklusive RHD-pseudo kan detekteras. Det är även möjligt att fastställa om RHD-genen finns i enkel eller dubbel uppsättning (zygositetsanalys), något som inte kan avgöras serologiskt. FY-systemet FY-typning utförs vanligen på provmaterial från foster eller från en transfunderad patient men även typning av testerytrocyter utförs. Med typningen kan svagt uttryckande eller tysta varianter av FY, som kan medföra falskt negativa resultat i serologin, detekteras. Detta minskar risken för att testerytrocyter felaktigt tolkas som homozygoter avseende antigenen Fya och Fyb. KEL-systemet Typning av foster tillsammans med blivande mamma och pappa är den vanligaste orsaken till KEL-typning. PATIENTFALL: Flicka född -92 med β-thalassemia major utreddes första gången i juli Flickan är flykting och multitransfunderad i hemlandet. Transfusionsbehovet är ca en enhet erytrocytkoncentrat var 14:e dag. Misstänkta blodgruppsantikroppar av typ: anti-jka, anti-k. Oklara reaktioner, transfusionsblandbild med anti-a. DAT-positiv. ABO : A/O1 RHCE : RHCe/cE FY : FYA/B JK : JKB/B ABO-gruppen kunde fastställas. Rhoch Fy-antikroppar kunde uteslutas och anti-jka verifierades. Sammantaget identifierades blodgrupp och blodgruppsantikroppar, vilket ger enklare selektion av blodenheter. LABORATORIET 3/2004 9

5 Antikroppar riktade mot KEL-glykoproteinet kan av okända skäl orsaka uttalad hämning av erytropoesen i kombination med hemolys vilket ger upphov till en särskilt fruktad form av HDN med utebliven retikulocytos. Anti-K och Rhantikropparna anti-d och anti-c är de som oftast ger upphov till kliniskt betydelsefull immunisering. JK- och MNS- systemet Analys av JK-genen och genen som styr uttyck av Ss-antigenen (GYPB) görs i ORDLISTA Agglutinat Alleler DAT Fenotyp Genotyp Heterozygoti HDN Homozygoti HLA PCR PCR-ASP PCR-RFLP Primer LÄS MER Erytrocyter sammanbundna av antikroppar Olika varianter av samma gen Direkt agglutinationstest Det som uttrycks av arvsanlagen Individens arvsanlag Enkel uppsättning av en viss allel Hemolytisk sjukdom hos nyfödda Dubbel uppsättning av viss allel Human Leukocyte Antigen Polymerase Chain Reaction PCR med allel-specifik primer PCR följd av klyvning med restriktionsenzym Kort, syntetisk DNA-sträng Vad? Webb-adress Innehåll Blodlänken hemsida för Analyssortiment Blodcentralen Skåne Provtagningsanvisningar Remisser Avd. för transfusionsmedicin Forskningsverksamhet hemsida FÖRFATTARNA: första hand på transfunderade patienter där fenotypen inte kan bestämmas. Inom JK kan även ovanliga tysta varianter fastställas. DO-systemet Reagens för serologisk typning av Dombrock är en bristvara. Därför kan genotypning vara ett alternativ vid analys av såväl patientprov som testerytrocyter. Kvinna född - 52, tidigare ej transfunderad. ABO-fenotyp: AB, men med svaga, blandbildsliknande reaktioner med anti-b. ABO-antikroppar: Serumgrupperingen var positiv mot B-testerytrocyter och negativ mot A-testerytrocyter. ABO : A/B En mutation som tidigare associerats med en svag B-subgrupp detekterades i B-genen. ABO-gruppen kunde fastställas och rekommendationer inför transfusion utfärdas. Kvinna född -73, gravid (v. 28), ett barn sedan tidigare + två missfall. Modern: K fenotyp K- k+ Antikropp: Barnafadern: K fenotyp K+ k+ Anti-K. Antikroppstiter 16. Modern KEL k / k Foster KEL K / k Risken för hemolytisk/anemisk sjukdom hos fostret kunde bekräftas, vilket vid behov kan motivera invasiva åtgärder som provtagning eller transfusion via navelsträngen (något som kan undvikas om barnet är antigen-negativt). Åsa Hellberg doktorand med projektet: Molekylärgenetiska orsaker till P/GLOB-relaterade blodgruppsfenotyper Annika Hult, Laboratoriet med ansvarsområde PCR Martin L. Olsson, Överläkare, Stf. Verksamhetschef, Docent Elisabeth Sjöberg Wester, Universitetsadjunkt, doktorand med projektet: Biokemiska och genetiska blodgruppsstudier av s.k. null-fenotyper 10 LABORATORIET 3/2004