Framtida möjligheter för blodgruppsgenomisk typning. Åsa Hellberg BMA, PhD BMA, PhD Klinisk immunologi och transfusionsmedicin Labmedicin Skåne

Transkript

1 Framtida möjligheter för blodgruppsgenomisk typning Åsa Hellberg BMA, PhD BMA, PhD Klinisk immunologi och transfusionsmedicin Labmedicin Skåne

2 Blodgruppssystem Table 1. Blood group systems according to ISBT classification guidelines. Carbohydrate blood group systems are marked in grey. No. System name System Gene Antigens Chromosomal symbol name(s)* location CD number 001 ABO ABO ABO 4 9q MNS MNS GYPA, GYPB, GYPE 46 4q31.21 CD P1PK P1PK A4GALT 2 22q13.2 CD Rh RH RHD, RHCE 59 1p36.11 CD Lutheran LU LU 22 19q13.32 CD Kell KEL KEL 35 7q34 CD Lewis LE FUT3 6 19p Duffy FY DARC 6 1q23.2 CD Kidd JK SLC14A1 3 18q Diego DI SLC4A q21.31 CD Yt YT ACHE 2 7q Xg XG XG, MIC2 2 Xp22.33 CD Scianna SC ERMAP 7 1p Dombrock DO ART4 4 12p12.3 CD Colton CO AQP1 7 7p Landsteiner- Wiener LW ICAM4 7 19p13.2 CD Chido/Rodgers CH/RG C4A, C4B 7/2 6p H H FUT1 1 19q13.33 CD Kx XK XK 1 Xp Gerbich GE GYPC 12 2q14.3 CD Cromer CROM CD q32.2 CD Knops KN CR1 9 1q32.22 CD Indian IN CD p13 CD Ok OK BSG 3 19p13.3 CD Raph RAPH CD p15.5 CD John Milton Hagen JMH SEMA7A 6 15q24.1 CD I I GCNT2 1 6p Globoside GLOB B3GALNT1 1 3q Gill GIL AQP3 1 9p Rh-associated glycoprotein RHAG RHAG 3 6p21-qter CD antigen SNP= Single Nucleotide Polymorphism tex T>A

3 Indikationer för genomisk typning oberoende analys vid oklara resultat t.ex. vid ABO eller Rh gruppering alternativ till fenotypning om patienten har fått blod (s.k. transfusionsblandbild) eller är positiv med direkt agglutinationsteknik (DAT) Thalassemi / Sickle cell bekräftelse av homozygoti hos: * givare av testerytrocyter, * den blivande pappan för att bedöma risken att fostret kommer att ärva antigenet som mamman är immuniserad mot. bestämning av fosterblodgrupp foster till immuniserad, gravid kvinna foster till RhD neg, gravid kvinna alternativ när blod ej finns

4 Givartypning Serologi Tidskrävande Kostsamma reagens Icke tillgängliga reagens Typas CcEeK Matchas K neg till fertila kvinnor Vid antikroppar Önskvärt Storskalig automatiserad typning som medger matchning thi mottagare givare till låg kostnad och med kort hands on time Resultat Färre immuniseringar Rätt blod snabbare The right blood to the right person at the right time

5 Vanliga metoder PCR RFLP 5' SNP T/C 3' PCR ASP Genspecifika primers Realtids PCR allel A oklippt FY YB/FYB FYA YA/FYB FY YB/FYB FYA YA/FYB YA/FYA YA/FYA T Allelic Discrimination allel l B C

6 Vanliga metoder PCR RFLP PCR ASP Realtids PCRl K1 ASP SNP 5' T/C K2 ASP Allelspecifik l primer M Internkontroll 3' Allelic Discrimination

7 Vanliga metoder PCR RFLP PCR ASP Forward R Q primer Reverse primer 3 5 Realtids PCR Allelic Discrimination

8 Vanliga metoder PCR RFLP PCR ASP P 2 P 2 Realtids PCRl Controls P 1 P 1 P 1 P 2 Allelic Discrimination

9 Sverige Stockholm: Screen fetalt RHD realtids PCR Lund: ABO, RH, FY, JK, MNS, KEL, FUT1/2, P1PK, GLOB PCR SSP, PCR RFLP, realtids PCR och AD Övriga Norden Köpenhamn: Fetalt RHD/RHc, RH, KEL, ABO, HPA realtids PCR, BAGene Nationell screening införd i: Danmark (flera orter) Holland (Amsterdam) Länder på gång: England (Bristol) Norge Sverige? Århus: ABO, RH, HPA, FY, JK, KEL PCR SSP BAGene, In house TaqMan chemistry, Oslo: RH, DO, HPA realtids PCR

10 Sverige Stockholm: Screen fetalt RHD realtids PCR Luminex ID Core och ID HPA Lund: ABO, RH, FY, JK, MNS, KEL, FUT1/2, P1PK, GLOB PCR SSP, PCR RFLP, realtids PCR och AD Övriga Norden Köpenhamn: Fetalt RHD/RHc, RH, KEL, ABO, HPA realtids PCR, BAGene Århus: ABO, RH, HPA, FY, JK, KEL PCR SSP BAGene, In house TaqMan chemistry, Open array Odense: Bloodchip ref ID Core och ID HPA Oslo: RH, DO, HPA realtids PCR, snart fetal screening Helsingfors: Luminex ID Core och ID HPA

11 Microarrays (kallas även mikromatriser eller mikrochips) Expressions (cdna) arrays vanligast Hög eller lågdensitets chips beroende på spotting upplösning etc Kan t.ex. användas för att undersöka hur mycket gener uttrycks i normal och cancervävnad Inte aktuellt för blodgruppering SNP arrays Oligonukleotider som inkluderar den polymorfa nukleotiden av intresse Fångar (blodgrupps ) SNPs Protein arrays Målproteinet sitter på chipset Fångar (blodgrupps ) antikroppar Glykan arrays y Målsackariden sitter på chipset Fångar (blodgrupps ) antikroppar

12 Vad finns på marknaden? Företag Plattform Antal Analystid CE antigen prov/tim Bloodchip Progenika glas 128* 20/10 x ID CORE+ Progenika beads/luminex 33 48/5 x ID CORE ID HPA GenomeLab Beckman Coulter 384 hålsplatta /36 SNPstream Beadchip BioArray Solutions/Immucor beads 32 96/ 5 x *inkl HPA modifierad från Veldhuisen B, Vox Sang Oct;97(3):

13 Bloodchipv Detekterar ABO, RH, KEL, JK, FY, MNS, DI, DO, CO, HPA Totalt 128 SNPs Fördelar CE märkt för alla antigen Nackdelar Specialutrustning Dyr

14 Hur fungerar det? Komplementära oligonukleotidprobes tillverkas och sätts fast på ett mikroskåpglas Många replikat av samma oligo Kapacitet >3000 spots Oligonucleotide probes Glas

15 Hur fungerar det? Multiplex PCR Klyvning Inmärkning Hybridisering Avläsning med en scanner + Ett program analyserar datan och ger genotypsresultat med predikterad fenotyp

16 ex BloodChip Microarray

17 Luminex XMAP (Multi Analyte( Profiling) fluidic microarry system Detekterar ABO, RH, KEL, JK, FY, MNS, DI, DO, CO, HPA Totalt: ID Core 23 antigen Fördelar ID Core+ 33 antigen ID HPA 12 antigen CE märkt Plattform för många andra analyser Kapacitet 2x96 prov /dag Nackdelar Mycket hands on tid Filterplattor

18 Beckman Coulter GenomeLab SNPstream Detekterar RH, MNS, KEL, FY, JK, DI, HPA totalt 19 antigen Fördelar/kapacitet SNP/dag Nackdelar Kräver specialutrustning Dyr Används HemaQuebec ( givare typade, Perrault et al Vox Sang 2009)

19 HEA BeadChip Detekterar CO, DI, DO, FY, JK, LU, MNS, SC, LW, RHD HbS Totalt 24 alleler/32 antigen Fördelar CE märkt ej för RHD/HPA Fungerar med låg konc. av DNA (poster ASH 2010, Lin et al.) Kapacitet 96 prov/5 timmar Nackdelar Kräver specialutrustning Dyr Används USA

20 BeadChip Bead Functionalization 4,000 ENCODED BEADS 0.3 mm Bead Synthesis & Encoding Pooling Array Assembly BeadChip Wafer

21

22 Analys Chip Analysis Bar Chart DNA Analysis\ Δ Chart (for each probe pair) SNP = FY-GATA ( FY -33T>C) AA "AB "BB

23 Fenotyp ChipName Sample WarnMsg c C e E K k Fya Fyb Jka Jkb M N S s Lua Lub Doa Dob Jo(a) Hy LWa LWb Dia Dib Coa Cob Sc1 Sc2 HgbS Silencing FY ) Fyx[Fy(b+w) Cmmnt HEA04961_11 A No HEA04961_2 A No No HEA04961_3 A No HEA04961_4 A HEA04961_5 A No HEA04961_6 A No HEA04961_7 A No No HEA04961_8 A No

24 TaqMan OpenArray Genotyping Instrument Platform Detekterar TaqMan SNPGenotyping Assays Custom TaqMan SNP Genotyping Assays Fördelar Kräver liten volym Snabb 256 SNPs i 1500 prov /dag Lågt pris/ analys Kundanpassas Nackdelar Specialutrustning

25 Andra möjligheter Maldi TOF MS(matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry) Kan detektera skillnader på en nukleotid Metoder för HPA och KEL (fetal diagnostik) publicerade Inga kommersiella aktörer? Next generation sekvensering Mycket utvecklingsbart område Måste förenklas

26 Risker falskt negativa (givare) orsakas av primer eller probes ej binder in pga en mutation kliniska studier (Bloodchip) visar att de är väldigt få falskt positiva (mottagare) kan orsakas av null alleler Problem

27 Önskvärt Storskalig automatiserad typning som medger matchning mottagare givare till låg kostnad och med kort hands on time Mjukvara som behandlar, överför till labsystem och väljer blod Markör för vem som är benägen att bilda antikroppar Plattformar som kombinerar virusdetektion, antikroppsdetektion, pp och antigen/gen detektion

28 Referenser Technologies involved in molecular blood group genotyping F. Monteiro et al. ISBT Science Series(2011) 6, 1 6 Blood group genotyping: from patient to high throughput donor screening B. Veldhuisen et al. Vox Sanguinis (2009) 97, Noninvasive genotyping fetal Kell blood group (KEL1) using cell free fetal DNA in maternal plasma by MALDI TOF mass spectrometry Y.Li et al. Prenat Diagn 2008; 28: Tack!

29 Discrimination med allele specific elongation MATCH T G C T A G T T C T A A C G A T C A A G A T G Assay Image MISMATCH X A C G A T C G C T A T A C G T A A T G DNA Polymerase emap

30 Avläsning Decoding Image Automated Snapshot Array Imaging Assay Image