Endokrinmöte Stockholm 2017-09-22
Steroider Lc-Ms/Ms vs Immunkemi? Benny Larsson
Kallners diskussionsforum Det är bra att nyttan av ackrediteringen diskuteras. Jag har länge irriterat mig över att inadekvata metoder, speciellt immunologiska metoder för bestämning av steroidhormoner, ackrediteras trots att vi länge känt till att de ofta ger värdelösa och t.o.m. vilseledande resultat. Prof, Ulf-Håkan Stenman, Helsingfors
Med risk att sticka ut hakan ännu en gång! Utan att göra anspråk på att vara vare sig endokrinolog eller expert inom den endokrinologiska delen av klinisk kemi, så är jag beredd att hålla med Ulf-Håkan Stenman i sitt inlägg om att immunlogiska metoder har sina klara begränsningar och att LC-MS- MS- (men även GC-MS-MS-) tekniker många gånger är att föredra. Lennart Nilsson Bedömare Swedac
Utvecklingstrender Steroidmetoder Äldre metoder: Extraktions RIA, mer specifika, mindre interferenser Arbetskrävande, tar lång tid att upparbeta prover Dagens metoder: Direktimmunoassay, snabb metodik, mer interfenser och korsreaktioner höga CV och Bias, fungerar på vissa Steroider ex Testo män, men ej ner i pmol/l-området LcMsMs, mer arbetskrävande än ovan, men med betydligt högre specificitet och precision pmol/l Framtidens metoder:???
Varför analysera Steroider på Lc-Ms/Ms Cortisol Testo Män Testo kvinnor Progesterone >1ng/mL Progesterone <1ng/mL Androstendione DHEA 17-OH-Prog
Dagens meny Steroider Testosteron Androstendion 17-OH-Progesteron Östradiol Aldosteron
Rackväxlare 12 MTP Autoinjektor Sciex 5500 QTrap ESI + APCI jonisering Tvättpumpar 2 st för online extraktion Gradientpumpar 2 st Kolonnugn 6 pos Online extraktion System-controller HPLC
Provupparbetning Steroider: Testosteron, Androstendione, 17-OH-Prog 100µL prov fälles med 200µL Zinksulfat(0,25%) i MeOH innehållande IST Rören mixas alt skakas 30 sek Frys -20ºC i 10 min Rören mixas alt skakas 30 sek Centrifugering 13.000rpm 10 min Injektion100µL av ovanfasen Analyskolonn, Dionex Acclaim C 18,3µ Provet renas ytterliggare genom On-line extraktion i instrument, Strata C 18 Analystid: 6 min
Biocrates kalibrator 17 steroider 0.1 nmol/l 28 nmol/l 0.15 nmol/l 151 nmol/l 35 pmol/l 35 nmol/l
Steroider 2D kromatografi Prov renas On-line ex Separation analyskolonn Strata Analyskolonn Prov 100µL injiceras Till slask Vid reningssteg Ms APCI Gradient pumpar A= 0,1% Myrsyra/H 2 O (v/w) B= 0,1% Myrsyra/Acetonitril(v/w) Renat Prov Tvättpump A=20% Acetonitril/H 2 O (v/w) Gradient
Androstendione kal-kurva r=1.000
Androstendione LcMs Immulite 2000
Prestanda Androstendion LcMs 6 mån 2016/17 Total CV Nivå 3,6% 2,4nmol/L 2,9% 8nmol/L Mätområde:0,1-28 nmol/l (0,1-140 nmol/l efter spädning) Tidigare metod Immulite 2000: Total CV Nivå 13% 8,5nmol/L 10% 21nmol/L
Testosteron kal-kurva r=1,0000
Cobas (nmol/l) Testosteron kvinnor, barn, män LcMs - Cobas Testosteron kvinnor,barn,män 45 40 y = 1.1337x - 0.2454 R 2 = 0.9902 35 30 25 20 15 10 5 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 LcMs (nmol/l)
Cobas (nmol/l) Testosteron Kvinnor Testesteron Kvinnor LcMs - Cobas 3 2.5 y = 1.138x - 0.1008 R 2 = 0.5697 2 1.5 Testosterone 1 0.5 0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 LcMs (nmol/l)
17-OH-Prog kal-kurva r=0,9999
30 25 20 15 10 5 0 RfB Referenzintitut fur Bioanalytik Externkontroller 17-OH-prog 2016-2017 Targetvärde åsatt av referensmetod RfB 17-OH-Progesteron 2016-2017 167 deltagare 17-OH-Progesterone nmol/l Target Min Max Diff CV% 5,14 2,05 8,23 6,18 22,7 16,4 6,56 26,3 19,74 20,8 Target 6,43 2,57 10,3 7,73 20,2 9,68 3,87 15,5 11,63 16,4 Max 12,7 5,08 20,4 15,32 17,7 Min 2,41 0 6,41 6,41 28,3 2,91 0 5,91 5,91 28 0 0 2,9 7,33 2,93 11,8 8,87 2,422,4 0 2,41 0 7,86 7,86 35,6 2,91 1,16 8,66 Serie1 Serie3 Serie5 7,5 30,6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
E2 Östradiol Lc-Ms/Ms Dåvarande rutinmetod ospecifik lägre konc ca 3 ggr förhöjda (DELFIA) Behöver mätas ner till ca 5 pmol/l Negativ ESI Additiv av fluorid Extraktionskolonn, Supelquard LC-8-DB 3µ Analyskolonn, Supelcosil LC-8DB 3µ Nytt sätt att öka känsligheten, 5 identiska fragment användes i beräkningarna InHouse kalibrator
Biocrates kalibrator 17 steroider 138pmol/L InHouse kalibrator Aldosterone + Östradiol 73pmol/L
LcMsMs ESI APCI Kollision cell 5 ggr simultant HPLC
Kalibreringskurva 11-1200pmol/L Quantifier Östradiol r=0,9999
Kalibreringskurva 11-75pmol/L Quantifier r=0,9998
Kalibrator Östradiol 11,4pmol/L Single mätning 5 summerade mätningar 550 2500 Ca 4,5 ggr högre signal Diverter
Pat-prov 2 pmol/l Single mätning 5 summerade mätningar S/N 3,5
Single mätning 2 pmol/l 5 summerade mätningar 1050 230 3x Smoothing 3x Smoothing
Prestanda Ultrakänligt Östradiol LcMs 8 mån 2017 Total CV Nivå 5,2% 11,8pmol/L 2,9% 211pmol/L Mätområde: 6-486 pmol/l (prover >486 pmol/l lämnas över till Roche Cobas) Tidigare manuell metod: Total CV Nivå 15% 67pmol/L 10% 292pmol/L
Aldosteron Lc-Ms/Ms Siemens dragit in reagens till manuell RIA Behöver mätas ner till ca 10 pmol/l Befintliga metoder RsB sprider stort (Referenzinstitut fur Bioanalytik) Negativ ESI Ether extraktion följt av Online extraktion Nya sättet att öka känsligheten, 5 identiska fragment användes i beräkningarna InHouse kalibrator
3000 2500 RfB Referenzintitut Aldosteron fur Bioanalytik RfB 2016-2017 Externkontroller Aldosteron 2016-2017 Targetvärde åsatt av referensmetod Aldosterone pmol/l TargetMax Min Max Diff CV% Min 1220 683 1760 1077 23,1 674 377 971 594 22,1 1730 968 2500 1532 18,3 424 237 611 374 22,6 427 239 615 376 20,7 729 408 1050 642 16,5 500 1330 744 1920 1176 20,3 227 90,8 364 273 28,5 729 408 1050 642 21,6 0 1330 744 Serie1 1920 Serie3 Serie5 1176 20,4 2000 1500 1000 Target 200 deltagare 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Aldosteron Kal 55pmol/L 5 mätningar s/n 8 Aldosteron-d4 (IST)
Kal-kurva 27 8900pmol/L y=0,00422 r=1,0000
Kalibr 27pmol/L
Kalibr 27+55pmol/L Kal 27pmol/L IST Kal 55 pmol/l IST
Tack för visat intresse Frågor? Benny.larsson@skane.se