Cirkulerande cellfritt DNA - en introduktion Anne Ricksten Equalismöte 2016-11-14
Vad är cirkulerande fritt DNA (cfdna)? Extracellulärt DNA som finns i cirkulationen Fragmenterat DNA, medelstorlek på ca 180 bp Kan detekteras i blod, urin och likvor
Upptäckten av extracellulärt DNA i humant blod gjordes redan 1948 Kommande decennier påvisades DNA extracellulärt hos många levande arter Finns i mkt låga nivåer hos friska personer Förhöjda nivåer vid olika sjukdomstillstånd och trauma 3
Mekanismer bakom cfdna Nekros av celler Apoptos av celler Aktiv frisättning av DNA från viabla celler 4
cfdna kan vara inblandat vid tumörspridning cfdna finns i exosomer Exosomer är små virusliknande partiklar som transporterar genetiskt material och signalsubstanser från en cell till en annan. 6
Förutom DNA frigörs även andra nukleinsyror Mitokondrie DNA mrna Icke-kodande RNA mikrorna 8
Stort intresse för cfdna som ny biomarkör Källa för genetiskt material från: -fostervävnad - solida tumörer - transplanterade organ Tillstånd som tidigare, eller fortfarande, kräver invasiv provtagning 9
Kliniska applikationer NIPT (non-invasive prenatal testing) - i mammans blod finns små mängder DNA från fostret som kan användas för fosterdiagnostik Solida tumörer - upprepad provtagning ger information om tumörstatus, uppföljning av behandlingseffekt, resistensutveckling mm Organtransplantation - vid rejektion ökar mängden cfdna från det transplanterade organet 10
Liquid biopsy 11
Utmaningar med cfdna Förekommer i mycket låga koncentrationer, 2-10 ng/ml plasma hos friska individer Fragmenterat, små DNA molekyler Kort halveringstid pga Dnase aktivitet Hög risk för bakgrund av gdna pga lyserade blodceller 12
Nya tekniker som gör det möjligt att detektera DNA vid mkt låga koncentrationer NGS, djupsekvensering Digital PCR 13
Anders Ståhlberg,GU
Forskningsstudie vid SU Transplantationscentrum på SU Kan cfdna analys ersätta invasiv provtagning? Klinisk användbar markör? 15
Analys av cfdna i blod: egna erfarenheter Preanalytisk hantering av provet Extraktionsmetod Kvantifiering av total mängd cfdna Preamplifiering Analysmetod 17
Preanalytisk hantering av blodprov Stor risk för bakgrund pga genomiskt DNA från lyserade celler Plasma eller serum? Tid från provtagning till hantering? Provtagningsrör? 18
Plasma ger mindre bakgrund än serum EDTA-rör vid snabb hantering Specialrör vid provtagning då provet inte kan tas om hand direkt Undvik frysning! 19
Tvåstegs centrifugering av plasma 2000xg i 10 min överför supernat. med god marginal till Eppendorfrör 16000xg i 15 min överför supernat. till nytt Eppendorfrör Förvaras vid -80C 20
Biobank/serum Forskningsstudier baserade på biobanksprover Biobanksprover är ofta serumprover Medveten om risken med bakgrund Hur länge proverna frysförvarats 21
Extraktionsmetod Vi har testat 3 olika kit för cfdna extraktion Utbyte (tillsätta markör DNA innan extraktion) Fragmentstorlek Inhiberande faktorer 22
Kvantifiering av total mängd cfdna För låga nivåer för att kunna detekteras med UV-kvantifiering Qubit mätning, baserad på fluorometrisk kvantifiering Realtids PCR 23
Koncentrationsbestämning Qubit Qubit (ng/µl) 160324 Qubit (ng/µl) 160414-1 Qubit (ng/µl) 160414-2 Qubit (ng/ul) 160502 Stefan Utbyte totalt (ng/ml plasma) cf-dna normal 1 NORGEN 4 ml 0,94 0,87 10,9 cf-dna normal 2 NORGEN 4 ml 0,43 0,38 4,8 cf-dna normal 3 NORGEN 4 ml 2,02-25 NORGEN 1 ml 0,23 0,22 11 QIAamp 1 ml 2,82 2,69 81 QIAamp circ 1 ml 0,212 6 cf-dna normal 4 NORGEN 4 ml 0,39 0,32 4 NORGEN 1 ml Low 0,066 3,3 QIAamp 1 ml 3,28 1,89 57 QIAamp circ 1 ml 0,154 4,6 cf-dna normal 5 NORGEN 1 ml Low 0,069 3,4 QIAamp 1 ml 1,44 2,02 61 QIAamp circ 1 ml 0,138 4,1 cf-dna normal 6 QIAamp circ 1 ml 0,214 6,4 24
Digital PCR för analys av cfdna 25
Koncentrationsbestämning Qubit Qubit (ng/µl) 160324 Qubit (ng/µl) 160414-1 Qubit (ng/µl) 160414-2 Qubit (ng/ul) 160502 Stefan Utbyte totalt (ng/ml plasma) cf-dna normal 1 NORGEN 4 ml 0,94 0,87 10,9 cf-dna normal 2 NORGEN 4 ml 0,43 0,38 4,8 cf-dna normal 3 NORGEN 4 ml 2,02-25 NORGEN 1 ml 0,23 0,22 11 QIAamp 1 ml 2,82 2,69 81 QIAamp circ 1 ml 0,212 6 cf-dna normal 4 NORGEN 4 ml 0,39 0,32 4 NORGEN 1 ml Low 0,066 3,3 QIAamp 1 ml 3,28 1,89 57 QIAamp circ 1 ml 0,154 4,6 cf-dna normal 5 NORGEN 1 ml Low 0,069 3,4 QIAamp 1 ml 1,44 2,02 61 QIAamp circ 1 ml 0,138 4,1 cf-dna normal 6 QIAamp circ 1 ml 0,214 6,4 26
Optimal mängd plasma vid extraktion: 1-4 ml Större volymer ger inte mer utbyte av cfdna
Kvantifiering av cfdna med realtids PCR
Fragmentstorlek cellfritt DNA Ca 60-500bp fragment 180 bp fragment i majoritet 180 bp Vid vissa tillstånd med uttalad apoptos kan längre cfdna fragment deteketeras (ca 5000bp) 29
PCR analys,1200 bp produkt. gdna (20ng-1ng) och cfdna (2,5 och 4 ng) från samma individ Budget 2014 31
Preamplifiering av cfdna Vi har testat att amplifiera allt cfdna med två olika kit Specifik amplifiering av target Blandade prover med låga allelfrekvenser Slutsats: Ingen linjär amplifiering, dvs vissa alleler amplifieras mer än andra 32
Konsekvenser av att cellfritt DNA är fragmenterat 180 bp Intakt DNA Cellfritt DNA Assay längd Känsliga mätningar kräver korta assays för att undvika onödiga förluster
SNP genotypning med digital PCR
Studiedesign, workflow Identifiering av SNPs homozygota hos patienten, 40 assays, (allel frekvensen är 0,5) på gdna 50% av assays är homozygota för AA eller BB Screening på cfdna från patienten Testa dessa assays på donator gdna Ca 25% (5) går bort pga samma homozygota SNPs Ca 50% (10) är heterozygota hos donatorn AA/AB eller BB/AB Ca 25% (5) är homozygota hos donatorn men heterozygota jämfört med patienten AA/BB eller BB/AA 36
Vi som jobbar med projektet: Carina Wasslavik, Klinisk kemi, SU Julia Asp, Klinisk kemi, SU Jens Böhmer, Kardiologi, SU TATAA-Biocenter,Göteborg
Tack! Budget 2014 38