Bestämning av tu-kortisol med LC-MS/MS samt arbete för nytt referensintervall Maria Nilsson Ulla Rüetschi Klinisk Kemi, Sahlgrenska Universitetssjukhuset
Varför mäta tu-kortisol? Indikation (S-och/eller tu-kortisol): Utredning för misstänkt rubbning i binjurebarkfunktion tu-kortisol: fr.a. överproduktion (Cushing) S-Kortisol: fr.a. Addisons sjukdom Förhöjda värden: Cushing syndrom, behandling med ACTH, kortisol, kortison eller på grund av stress Sänkta värden: Binjurebarksinsufficiens. Tillförsel av syntetiska glukokortikoider. Laboratoriet Sahlgrenska analyserar ca -4 tu-kortisol/vecka
Metodbyte tu-kortisol Före år : RIA-metod Plötsligt reagensproblem från tillverkaren Testade då två andra immunkemiska metoder Valde Abbott Architect, som dock angav ett mycket brett referensintervall (-46 nmol/l). Därför samkördes prover mot Lund (LC-MS/MS) och detta referensintervall användes efter omräkning av medelnivåer. I dagsläget rekommenderad metod LC-MS/MS
Abbott Architect / LC-MS/MS (Lund) Architect nmol/l Dock problem med spridning av resultat fr.a. kring referensgränserna Referensintervall tu-kortisol: Architect: 55-5 nmol/4h LC-MS/MS: - 7 nmol/4h LC-MS/MS nmol/l
LC-MS/MS Prov: dygnsurin utan tillsatser Upparbetning med SLE (supported liquid extraction), extrahera med MTBE Reversed phase kromatografi, Aquity BEH kolonn.x5 mm; A=.% myrsyra i H O och B=.% myrsyra i acetonitril. Gradient från -9% B över 4 min och substansen eluerar vid. min, ~5% B. ESI+, 6./. (Quant). Optimerade MS-parametrar: - Capillary voltage kv - Cone Voltage 4 V - Collision energy 7 - Dwell time. ger punkter över toppen Kalibrerkurva -5 nm i 6 punkter, spädes i xpbs IS nm d4-hydrokortison
Interferenser KORT_549a_UR_6 %.99 U-kortisol.6 55.97 nmol/l MRM of channels,es+ 6.5 >..56e+4 kortisol.76 KORT_549a_UR_9.5.5.75..5.5.75..5.5.75.99 U-kortisol.6 54. nmol/l min MRM of channels,es+ 6.5 >..4e+4 -alfa-dihydrokortisol %.76 %.5.5.75..5.5.75..5.5.75 KORT_549a_UR_4 %.75.99 U-kortisol.5 5.65 nmol/l.5.5.75..5.5.75..5.5.75 KORT_549a_UR_4 %.76.99 U-kortisol.6 5.5 nmol/l min MRM of channels,es+ 6.5 >..47e+4.5.5.75..5.5.75..5.5.75 KORT_549a_UR_4.76. U-kortisol.5 5.97 nmol/l min MRM of channels,es+ 6.5 >..664e+4 min MRM of channels,es+ 6.5 >..749e+4 -beta-dihydrokortisol -alfa-hydrokortison Prednisolone.5.5.75..5.5.75..5.5.75 min
LC-MS/MS SU/S Riktighet jmfr. LC-MS/MS-LUND 4 tu-kortisol Riktighet y =,46x -,4 R² =,994 6 4 4 6 4 LC-MS/MS LUND MARIA NILSSON/ULLA RÜETSCHI KLINISK KEMI SAHLGRENSKA UNIVERSITETSSJUKHUSET
Sammanställning av referensintervall Oslo 45-7 Karolinska 4-7 Akademiska 4-7 Lund -7 Helsingfors -44 Barrett YC et al. 5- Mayo -4 5 5 5 tu-kortisol, nmol/l
Inklusionskriterier Referensmaterial dygnsurin - Subjektivt friska individer - Ingen behandling med receptbelagda läkemedel senaste månaden (undantag östrogensubstitution) - 4-timmarsurin utan tillsatser Exklusionskriterier - Graviditet - Ålder < 6 år - Volym.5-. L Samarbete med Patrick Johansson, NÄL
SU/S + NÄL 7 individer (46 SU+ 6 NÄL) Åldersintervall, 6-67 år Könsfördelning, K=4 M=9 Urinvolym/4h, U-Kortisol, U-Kreatinin Urinvolym/4h Medelvärde U-kortisol Medelvärde Män.7 L 66. nmol/l Kvinnor. L 9.6 nmol/l MARIA NILSSON/ULLA RÜETSCHI KLINISK KEMI SAHLGRENSKA UNIVERSITETSSJUKHUSET
6 6 Resultat Referensmaterial Frequency distribution, n=7 tu-kortisol (nmol/4h) 6 4 Ej normalfördelat 6 4 4 6 4 6 4 6 Medelvärde nmol/4 h (Median 7).5 % percentil nmol/4h 97.5 % percentil 95 nmol/4h D'Agostino & Pearson omnibus normality test
5 6 4 5 4 Könsfördelning Frequency distribution Kvinnor, n=4 tu-kortisol (nmol/4h) Frequency distribution Män, n=9 tu-kortisol (nmol/4h) 6 9 4 7 6 5 4 6 4 4 6 4 6 4 6 4 6 Medelvärde 66 nmol/4 h (Median 6) Medelvärde nmol/4 h (Median 94).5 % percentil nmol/4h 97.5 % percentil 5 nmol/4h.5 % percentil nmol/4h 97.5 % percentil 4 nmol/4h D'Agostino & Pearson omnibus normality test
4 5 5 7 6 7 9 Könsfördelning Log Frequency distribution Kvinnor, n=4 Åldersintervall 9-6 år Frequency distribution Män, n=9 Åldersintervall 6-67 år Frekvens Frekvens 9 7 7 6 6 5 5 4 4,,, 4, 5, 6, 7,, 9,,, F L E R, 5, 6, 7,, 9,,,, 4 F L E R Medelvärde 5 nmol/4 h (Median 6) Medelvärde 9 nmol/4 h (Median 94).5 % percentil nmol/4h 97.5 % percentil 5 nmol/4h.5 % percentil nmol/4h 97.5 % percentil nmol/4h
Beräknat referensintervall SU Män - SU Kvinnor -5 Oslo 45-7 Karolinska 4-7 Akademiska 4-7 Lund -7 Helsingfors -44 Barrett YC et al. 5- Mayo -4 5 5 5 tu-kortisol, nmol/l
Mayo Män -66 SU Män - Mayo Kvinnor -9 SU Kvinnor -5 5 5 5 tu-kortisol, nmol/l MARIA NILSSON/ULLA RÜETSCHI KLINISK KEMI SAHLGRENSKA UNIVERSITETSSJUKHUSET
CLSI rekommendationer för referensintervall > individer Detta bör minst anges: Antal Kön Ålder Etnicitet (om relevant) Percentiler som används för cut off
Beskrivning av referensintervall Reagens Standarder Instrumentering Analyt som analyseras Antal individer (ålder, kön etc.) Konfidensintervall
Överföring av referensintervall En subjektiv bedömning Ett statistiskt test på ett relativt litet antal referensindivider (n=) En utvärdering av ett större antal individer (men mindre än, som rekommenderas för att utföra en referensintervallstudie)
Diskussion referensintervall Könsskillnader Hur skiljer sig våra olika laboratoriemetoder i nivå? Möjligheter för samarbete/överföring av referensintervall