Mendelsk randomisering en ny analysmetod ökar. förståelsen för kausalitet i kardiovaskulära risksamband

Klinik och Vetenskap 13 02 06/PN Final version, accepterad i Läkartidningen Mendelsk randomisering en ny analysmetod ökar förståelsen för kausalitet i kardiovaskulära risksamband Peter M Nilsson, professor, överläkare 1,2 1. Institutionen för kliniska vetenskaper, Lunds universitet samt 2. Internmedicinska kliniken, Skånes Universitetssjukhus, Malmö Korresponderande författare Peter M Nilsson, professor, överläkare Institutionen för kliniska vetenskaper, samt Internmedicinska kliniken Skånes Universitetssjukhus 205 02 Malmö Tel. 040-33 24 15 e-mail: Peter.Nilsson@med.lu.se 1

Antal ord: 2207 (inklusive sammanfattande punkterna med 135 ord), samt 3 tabeller och 2 figurer Antal referenser: 50, varav 20 skall markeras för den tryckta versionen. Jävsdeklaration: Inga relevanta intressekonflikter finns för detta manus. 2

Sammanfattning Analys av kausalitet är den observationella epidemiologins klassiska problem. Detta medför ofta stora svårigheter i att identifiera ett oberoende inflytande på risk av en viss riskmarkör Inom genetiken finns det en metod, mendelsk randomisering, för att undersöka kausalitet. Denna bygger på antagandet om att en specifik genetisk programmering för en viss biomarkör måste motsvaras av ett liknande samband mellan den genetiska markören och det kliniska utfallet för att kunna påstå att biomarkören uppvisar ett äkta samband med utfallet. Baserat på denna metod har man funnit att några riskfaktorer/markörer uppvisar kausalitet med t.ex. risk för hjärtinfarkt (t.ex. LDL kolesterol) medan andra inte förefaller att kunna göra detta (C-reaktivt protein, HDL kolesterol). Dessa förhållanden kan få betydelse inte bara för mekanistisk förståelse av sjukdomsprocesser utan även för utveckling av kausalt riktad preventiv behandling. 3

Inom kardiovaskulär epidemiologi har en lång rad riskmarkörer presenterats under mer än 60 år av forskning, där de klassiska består av hypertoni, hyperlipidemia, rökning och diabetes. Detta baserar sig på pionjärstudier t.ex. från befolkningsundersökningar i Framingham med start i slutet av 1940-talet [1] och har sedan utvecklats i moderna riktlinjer, såväl i Sverige [2] som internationellt [3]. En utmaning som också kan innebära tolkningsproblem är att listan av riskmarkörer nu ökat betydligt, såväl bland biomarkörer som bland genetiska markörer, t.ex. i relation till risk för hjärtinfarkt. Man har, baserat på klassiska kriterier, även krävt att en positiv preventiv effekt kunnat påvisas vid intervention mot en riskmarkör i en eller flera randomiserad, kontrollerad studie, för att denna skall kunna få status som kausal riskfaktor. Många av dessa riskfaktorer tenderar dock att samvariera, t.ex. inom det som kallats metabolt syndrom, baserat på bukfetma samt stegring av glukos och blodtryck liksom förekomst av dyslipidemi (höga triglycerider, lågt HDL kolesterol). Med utvecklingen av den nya kardiovaskulära genetiken [4,5] har analysmetoder presenterats för att närmare kunna analysera kausalitet (kausal inferens) i relation till risk för sjukdom. Dessa bygger på kända metoder och matematiska formler, t.ex. instrumentvariabelanalys, men har nu fått ett nytt användningsområde. En av de mest omskrivna för närvarande är den som kallas mendelsk randomisering, och där ett utvecklingsarbete bedrivits under senare år [6-9]. Denna metod bygger på antagandet att det i populationsbaserade studier av gen-sjukdoms association det är så att den slumpartade fördelningen av alleler vid utformning av könsceller (gameter), den s.k. Mendels andra lag, resulterar i en slumpvis och oberoende association mellan alleler och miljöfaktorer som uppträder senare i livet (Figur 1). I teorin medför detta att det bör bli en liknande fördelning av till sjukdom icke-associerade genetiska markörer mellan individer som senare utvecklar sjukdom och de som förblir friska för denna sjukdom ifråga. Här skall redogöras för några viktiga fynd då mendelsk randomisering tillämpats för 4

att bättre kunna förstå kausalitet vad gäller fr.a. kardiovaskulär risk med fokus på hjärtinfarkt, men även avseende vissa associerade sjukdomar. Man bör dock komma ihåg att denna metod även kan ha vissa svagheter samt förutsätter några definierade kriterieroch att tillräckligt stora befolkningsstudier bildar underlag för analyserna. Avsaknad av samband mellan gen och sjukdom kan även tala för inflytande av omätta miljöfaktorer ledande till gen-miljö eller gengen interaktion som antingen kan förstärka eller försvaga ett samband mellan en viss enskild genetisk markör och ett visst sjukdomsuttryck [10]. Detta kan vara speciellt relevant för subgrupper inom en större population vilket inte alltid kan synliggöras vid analyser av hela populationen i fråga. Förutsättningar för analys med mendelsk randomisering sammanfattas i tabell 1. Det finns likheter mellan mendelsk randomisering och en randomiserad studie (Figur 2) men det är inte alla medicinska frågeställningar som lämpar sig för randomiserade intervention och då kan analys med hjälp av mendelsk randomisering vara ett alternativ. Detta gäller t.ex. analyser av samband mellan olika skadliga agens i livsstil eller miljö då randomisering inte är tillämplig, eller för riskmarkörer där ingen känd intervention existerar. Effekter som ses efter analys med mendelsk randomisering kan ofta vara mer påtagliga än de som kan fås fram i interventionsstudier. En orsak till detta är att genetiska mekanismer följer individen under hela livet men att interventionsstudier, t.ex. i medelåldern endast pågår några få år [7]. Randomiserade studier behövs dock även för att kunna skatta grad av positiva kliniska effekter i relation till biverkningar, liksom kostnadseffektivitet med en viss behandling. Biomarkörer med kausala risksamband Med användande av mendelsk randomisering har flera forskargrupper kunna påvisa kausala samband mellan LDL kolesterol [11,12] och liporotein (a) [13] samt senare uppträdande risk för hjärtinfarkt. Detta har lett till slutsatsen att livlångt låga nivåer av LDL kolesterol kan 5

skydda mot hjärtinfarkt och att detta kan motivera tidig behandling hos riskindivider [12]. Baserat på andra studier har det även visats vara möjligt att beräkna ett genetiskt risk-score för lipidmetabolism relaterad till LDL kolesterol, även oberoende av cirkulerande nivåer av LDL kolesterol [14]. Farmakologisk sänkning av LDL kolesterol har kunnat beläggas ge kardiovaskulär prevention via t.ex. statinbehandling, där dock även andra pleiotropa läkemedelseffekter kan spela roll. Denna effekt är dock lägre än vad som antydds möjligt vid analys med hjälp av mendelsk randomisering av skäl som angivits ovan [7]. På ett motsvarande sätt har man kunnat påvisa kausala samband mellan grad av icke-fastande glukosstegring [15] samt triglyceridnivåer [16] för risk att utveckla hjärtinfarkt. Inflammation har sedan några år diskuterats i genesen för hjärtkärlsjukdom och typ 2 diabetes. En mediator av inflammation är cytokinen interleukin-6 (IL-6), och kausala samband med hjärtinfarktrisk har påvisats för såväl IL-6 receptorn [17] som med cirkulerande nivåer av IL-6 [18]. Det anses att IL-6 systemet (via G-174C polymorfism i IL-6 genen) reglerar leversyntes av C-reaktivt protein (CRP) och därmed styr plasma-nivåerna av CRP, vilken är en i sammanhanget sekundär faktor för samband med hjärtinfarkt. En annan metabol faktor är homocystein som uppvisar kausalt samband med risk för stroke [19] men inte för hjärtinfarkt [20]. Bland nya biomarkörer som analyserats mot bakgrund av kända genetiska samband med sjukdom finns bl.a. preneurotensin, en faktor med association till mättnad och metabolism, och som uppvisar samband med risk för hjärtinfarkt, typ 2 diabetes och bröstcancer hos kvinnor baserat på data från en populations-studie i Malmö [21]. I detta fall utgick man från 6

en kunskap om den genetiska riskmarkören SORT1 och gick sedan vidare i analys av den medierande biomarkören som har samband med riskgenen. Det finns även exempel på hur mendelsk randomisering använts för att studera mekanismer bakom mekanismer för sjukdomsrisk, inte för händelsen i sig. På så sätt har det t.ex. visats att den genetiska markören apo E4 uppvisar oberoende samband med nivåer av riskfaktorerna kolesterol och hypertoni [22], samt att genetiken för urat har samband med hypertoni [23]. Från diabetesområdet har noterats att genetiska markörer för beta-cell funktion har oberoende samband med utvecklingen av typ 2 diabetes, även efter justering för glukosnivåer och annan fenotyp-information som fetma [24]. En sammanfattning av faktorer med påvisad kausalitet för risk att insjukna i hjärtinfarkt eller associerade tillstånd, baserat på mendeliansk randomisering, finns i tabell 2. Biomarkörer med begränsat eget kausalt samband Förhöjt kroppsmasseindex (BMI) är en fenotyp-markör för en rad risktillstånd och med fetma associerade sjukdomar [25]. Med användande av mendelsk randomisering har man funnit att det observerade sjukdomssambandet på genetisk grund för fetma-associerad risk avseende ischemisk hjärtsjukdom är dubbelt så stort (52% per 4 kg/m 2 ökning av BMI) som det observerade sambandet mellan fenotypen i sig och risk (26%). Detta kan förklaras med inflytandet av med till BMI associerade riskfaktorer, t.ex. hypertoni och lipidrubbning [26]. Nya studier har kunnat visa en reversering av kardiovaskulär risk efter fetma-reducerande kirurgi [27], men däremot inte vid intensifierad livsstilsrådgivning hos obesa typ 2 diabetiker i den randomiserade Look AHEAD studien som nyligen avbrutits i förtid p.g.a. avsaknad av effekt på kardiovaskulära sjukdomstillstånd [28]. 7

Biomarkörer utan kausalt samband med risk för sjukdom Det är även av principiellt stor betydelse att undersöka vilka biomarkörer som inte uppvisar sann kausalitet med sjukdom, fr.a. för val av terapeutiska interventioner. Om en viss faktor inte är kausalt relaterad till en viss sjukdom så förefaller det inte meningsfullt att behandlingsmässigt fokusera på denna faktor, om nu analysen inte har interna felkällor. En biomarkör kan dock ändå vara av värde för epidemiologiska beskrivningar samt för riskanalyser även om kausalitet inte föreligger, om syftet inte är intervention. Det har kommit flera uppmärksammande exempel på avsaknad av en förväntad kausalitet i risk för hjärtinfarkt, fr.a. gällande C-reaktivt protein (CRP) [29-34] och ej heller för samband mellan CRP och kronisk lungsjukdom [35], även om CRP kan prediktera en rad olika sjukdomstillstånd och även total mortalitet på ett ospecifikt sätt baserat på populationsstudier [36]. Som tidigare angivits är det regulatorn för syntes av CRP, cytokinen IL-6, som uppvisar det äkta kausala sambandet [17,18]. Ett annat uppmärksammat fynd är att HDL kolesterol inte förefaller vara kausalt relaterat till risk för hjärtinfarkt [37,38]. Detta gäller även avsaknad av kausalt samband mellan urat och risk för typ 2 diabetes [39] samt för bilirubin och risk för hjärtinfarkt [40]. Däremot kan det finnas någon form av kausalt samband mellan steg i metabolismen av triglycerider och risk för hjärtinfarkt [16]. Det råder interna samband mellan hypertriglyceridemi samt lågt HDL kolesterol (dyslipidemi) och hyperurikemi, sannolikt på basen av underliggande insulinresistens. Någon faktor kopplad till störd glukosmetabolism och nedsatt insulinkänslighet, med uttrycket av störd triglyceridomsättning, är därför sannolikt kausalt relaterad till risk för hjärtinfarkt, medan det ser ut som om färändringar av HDL kolesterol i sammanhanget skulle kunna vara ett sekundärt fenomen. Detta antagande har dock inte tagit 8

hänsyn till de subklasser av HDL kolesterol som även finns varför vidare forskning behövs. Exempel på faktorer från studier där kausalitet inte kunnat påvisas med mendeliansk randomisering anges i tabell 3. Betydelse för vidare forskning och utveckling av nya läkemedel Baserat på den nya förståelsen av kausalitet i riskfaktoranalyser så har det hävdats att utvecklingen av nya terapier, fr.a. läkemedel, bör inriktas på att modifiera sanna kausala sjukdomsmekanismer. Ett sådant exempel skulle kunna vara den mekanism som biomarkören preneurotensin beskriver samt även här beskrivna IL-6 associerade mekanismer. Här krävs dels vidare studier för en detaljerad kartläggning av den molekylära och receptormedierade mekanismen ifråga, och dels olika farmakologiska försök att manipulera denna mekanism. Därefter bör vidare studier hos försöksdjur och människa kunna planeras. Detta kan vara ett kostnadseffektivt sätt att screena för relevanta angreppspunkter för nya läkemedel under utveckling. Motsatsen kan också vara mycket relevant, att inte lägga stora summor på nya läkemedel som har som målsättning att ingripa i mekanismer om inte förefaller kausalt associerade till den typ av händelser man vill förebygga. Återigen utgör debatten om HDL kolesterol ett intressant exempel. Det har hittills visat sig vara svårt att åstadkomma kardiovaskulär prevention med riktad terapi för att höja HDL kolesterol, t.ex. via niacinbehandling som inte gett avsedd effekt i två aktuella randomiserade interventionsstudier, AIM-HIGH [41] och Heart Protection Study-2 [42]. En ny generation läkemedel verkar på enzymet CETP vars hämning ökar nivån av HDL kolesterol, vilket även kan ses naturligt i samband med genetiska mutationer associerade med mycket låga nivåer av CETP [43]. En sådan substans, torcetrapib, stoppades för några år sedan p.g.a. oönskade sidoreffekter [44], medan en annan substans, anaceptrapib, visat mer lovande egenskaper [45] och f.n. testas i en stor randomiserade kardiovaskulär preventiv 9

studie vars resultat avvaktas [46]. Ett annat läkemedelsföretag har dock i maj 2012 avbrutit en randomiserad studie med en snarlik substans, dalcetrapib, vilket illustrerar de signaler av tveksamhet som ackumulerats av nya kritiska studier avseende kausalitet för HDL kolesterol som bygger på analys enligt mendelsk randomisering [37,38]. Den avbrutna studien ifråga kunde inte påvisa någon effekt på kardiovaskulär prevention hos patienter med tidigare akut koronart syndrom trots en markant ökning av HDL kolesterol (30-40%) dock utan ändring av LDL kolesterol [47]. Sammanfattning Det kan sannolikt vara så att den nya kardiovaskulära genetiken kommer att betyda mera för förståelse av kausala sjukdomsmekanismer, och därmed utgöra en grund för utveckling av nya terapier [50], än för riskprediktion på individnivå även om en sådan kan tänkas vara möjlig vid hög samlad genetisk risk, något som dock är ovanligt i befolkningen [14]. Nya analysmetoder som inkluderar mendelsk randomisering kan kasta nytt ljus över vilka epidemiologiska samband som är kausala och vilka som inte är det. Detta vetenskapliga fält rör sig nu mot att använda redan gjorda helgenom undersökningar (GWAS) för att titta på effekter av vissa genetiska markörer (SNP-utfall). Man strävar dessutom till att använda sammanvägda genetiska index (scores) uppbyggda av tusentals SNP:ar för att rätt kunna estimera de biologiska effekterna med snäva konfidensintervall. Fortfarande kan det dock finnas svagheter i resonemanget som bör närmare undersökas, t.ex. vilken roll som gen-miljö och gen-gen interaktioner spelar för påvisade samband. Dessutom behövs det stora befolkningsstudier med biobanker för att kunna göra dessa studier eftersom det behövs stora antal av individer med både genotypning och fenotypning. Detta låter sig inte göras på samma sätt hos grupper av etablerade patienter eftersom då fenotyp och biomarkörnivåer redan hunnit avsevärt påverkas av sjukdomsprogress och inflytande av given 10

behandling. För patienter kan istället prognostik samt risk för biverkningar vara betydelsefullt och där kan den nya genetiken bidra på annat sätt. Slutsatsen av detta är att det krävs stora befolkningsstudier, biobanker samt avancerad molekylär epidemiologi i kombination med uppgifter om miljöexposition. Detta stöds av formuleringar i den nya Forskningspropositionen från regeringen ( Forskning och innovation, Prop. 2012/13:30) samt regeringens övriga satsningar på livsvetenskaperna. Lagstiftningen håller på att ses över och under 2013 förväntas bl.a. en ny biobankslag ( En ny biobankslag, SOU 2010:81). 11

Tabell 1. Kriterier som måste vara uppfyllda för att beräkningar med Mendelsk randomisering skall var giltig (kausal inferens), i annat fall kan fel insmyga sig i analysen [7]. 1. En genetisk variant måste vara direkt relaterad till den riskmarkör (biomarkör) som analysen handlar om, och inte vara relaterad till olika riskmarkörer (pleiotropi) 2. Denna genetiska variant delar en studiepopulation i de individer som har den (bärare) och de som inte har den (icke-bärare) utan inflytande av andra faktorer 3. Den genetiska varianten påverkar utfallet (sjukdomen, fenotypen) endast via den biomarkör som avses och inte på annat sätt 12

Tabell 2. Faktorer med påvisad kausalitet för risk att insjukna i hjärtinfarkt eller associerade tillstånd, baserat på mendeliansk randomisering. - LDL kolesterol (för hjärtinfarkt samt utveckling av hypertoni) - Lipoprotein (a) - Interleukin- 6 receptorn, cirkulerande IL-6 - Proneurotensin (för kvinnor) - Hyperglykemi - Defekt beta-cell funktion (för utveckling av typ 2 diabetes) - Hypertriglyceridemi - Homocystein (för stroke, men ej för hjärtinfarkt) - Urat för blodtryckssänkning 13

Tabell 3. Exempel på faktorer från studier där kausalitet inte kunnat påvisas med mendeliansk randomisering. - C-reaktivt protein (för risk att insjukna i hjärtinfarkt samt KOL, samt risk för diabetes och metabola syndromet) - HDL kolesterol (talande för att risk associerad med lågt HDL-K är sekundärt till ökade triglycerider, glukosmetabol rubbning) - Urat (för risk att insjukna i typ 2 diabetes) - LDL kolesterol (för risk att insjukna i cancer) - Bilirubin och hjärtinfarkt 14

Referenser (20 skall utväljas för publicering i LT, markerade med #, resten på nätet) 1. Dawber TR, Kannel WB. An epidemiologic study of heart disease: the Framingham study. Nutr Rev. 1958;16:1-4. 2. Att förebygga aterosklerotisk hjärtkärlsjukdom. Läkemedelsverket Informerar, 2006 3. Perk J, De Backer G, Gohlke H, Graham I, Reiner Z, Verschuren M, et al. European Guidelines on cardiovascular disease prevention in clinical practice (version 2012). The Fifth Joint Task Force of the European Society of Cardiology and Other Societies on Cardiovascular Disease Prevention in Clinical Practice (constituted by representatives of nine societies and by invited experts). Developed with the special contribution of the European Association for Cardiovascular Prevention & Rehabilitation (EACPR). Eur Heart J 2012;33:1635-701. 4.# O'Donnell CJ, Nabel EG. Genomics of cardiovascular disease. N Engl J Med. 2011; 365:2098-109. 5. Nilsson PM, Orho-Melander M, Melander O. Nyheter inom kardiovaskulär genetik öppnar för nya terapimöjligheter. Läkartidningen 2011; 108: 540-3. 6.# Davey Smith G, Ebrahim S. What can mendelian randomisation tell us about modifiable behavioural and environmental exposures? BMJ 2005; 330:1076-9. 7. Burgess S, Thompson SG; CRP CHD Genetics Collaboration, Burgess S, Thompson SG, Andrews G, Samani NJ, et al. Bayesian methods for meta-analysis of causal relationship estimated using genetic instrumental variables. Stat Med. 2010;29:1298-311. 8.# Sheehan NA, Meng S, Didelez V. Mendelian randomisation: a tool for assessing causality in observational epidemiology. Methods Mol Biol 2011;713:153-66. 15

9. Burgess S, Thompson SG, Genetics Collaboration CC. Methods for meta-analysis of individual participant data from Mendelian randomisation studies with binary outcomes. Stat Methods Med Res 2012 Jun 19. [Epub ahead of print] PubMed PMID: 22717643. 10. Little J, Kouhry MJ. Mendelian randomisation: a new spin or real progress? Lancet 2004; 362: 930-1. 11.# Linsel-Nitschke P, Götz A, Erdmann J, Braenne I, Braund P, Hengstenberg C, et al; Wellcome Trust Case Control Consortium (WTCCC); Cardiogenics Consortium. Lifelong reduction of LDL-cholesterol related to a common variant in the LDL-receptor gene decreases the risk of coronary artery disease--a Mendelian Randomisation study. PLoS One. 2008;3:e2986. 12.# Ference BA, Yoo W, Alesh I, Mahajan N, Mirowska KK, Mewada A, et al. Effect of Long-Term Exposure to Lower Low-Density Lipoprotein Cholesterol Beginning Early in Life on the Risk of Coronary Heart Disease: A Mendelian Randomization Analysis. J Am Coll Cardiol. 2012 Oct 9. doi:pii: S0735-1097(12)04773-0. 10.1016/j.jacc.2012.09.017. [Epub ahead of print]. 13.# Tsimikas S, Hall JL. Lipoprotein(a) as a potential causal genetic risk factor of cardiovascular disease: a rationale for increased efforts to understand its pathophysiology and develop targeted therapies. J Am Coll Cardiol. 2012;60:716-21. 14.# Kathiresan S, Melander O, Anevski D, Guiducci C, Burtt NP, Roos C, et al. Polymorphisms associated with cholesterol and risk of cardiovascular events. N Engl J Med. 2008; 358:1240-9. 15.# Benn M, Tybjaerg-Hansen A, McCarthy MI, Jensen GB, Grande P, Nordestgaard BG. Non-fasting glucose, ischemic heart disease, and myocardial infarction: a Mendelian randomization study. J Am Coll Cardiol 2012;59:2356-65. 16.# Triglyceride Coronary Disease Genetics Consortium and Emerging Risk Factors 16

Collaboration, Sarwar N, Sandhu MS, Ricketts SL, Butterworth AS, Di Angelantonio E, Boekholdt SM, et al. Triglyceride-mediated pathways and coronary disease: collaborative analysis of 101 studies. Lancet. 2010;375:1634-9. 17.# Interleukin-6 Receptor Mendelian Randomisation Analysis (IL6R MR) Consortium, Hingorani AD, Casas JP. The interleukin-6 receptor as a target for prevention of coronary heart disease: a mendelian randomisation analysis. Lancet 2012;379:1214-24. 18. Niu W, Liu Y, Qi Y, Wu Z, Zhu D, Jin W. Association of interleukin-6 circulating levels with coronary artery disease: a meta-analysis implementing mendelian randomization approach. Int J Cardiol 2012;157:243-52. 19. Casas JP, Bautista LE, Smeeth L, Sharma P, Hingorani AD. Homocysteine and stroke: evidence on a causal link from mendelian randomisation. Lancet 2005;365:224-32. 20. Clarke R, Bennett DA, Parish S, Verhoef P, Dötsch-Klerk M, Lathrop M, et al; MTHFR Studies Collaborative Group. Homocysteine and coronary heart disease: meta-analysis of MTHFR case-control studies, avoiding publication bias. PLoS Med. 2012;9:e1001177. 21.# Melander O, Maisel AS, Almgren P, Manjer J, Belting M, Hedblad B, et al. Plasma proneurotensin and incidence of diabetes, cardiovascular disease, breast cancer, and mortality. JAMA 2012; 308:1469-75. 22. Niu W, Zhang X, Qi Y. Association of an apolipoprotein E polymorphism with circulating cholesterols and hypertension: a meta-based Mendelian randomization analysis. Hypertens Res. 2012;35:434-40. 23. Parsa A, Brown E, Weir MR, Fink JC, Shuldiner AR, Mitchell BD, et al. Genotype-based changes in serum uric acid affect blood pressure. Kidney Int 2012;81:502-7. 24. Song Y, Yeung E, Liu A, Vanderweele TJ, Chen L, Lu C, et al. Pancreatic beta-cell function and type 2 diabetes risk: quantify the causal effect using a Mendelian randomization approach based on meta-analyses. Hum Mol Genet 2012;21:5010-8. 17

25. Nilsson P, Berglund G. Fetma är farligt - men vad händer vid viktnedgång? Läkartidningen 2002;99:3178-81. 26.# Nordestgaard BG, Palmer TM, Benn M, Zacho J, Tybjaerg-Hansen A, Davey Smith G, et al. The effect of elevated body mass index on ischemic heart disease risk: causal estimates from a Mendelian randomisation approach. PLoS Med 2012;9:e1001212. 27. Sjöström L, Narbro K, Sjöström CD, Karason K, Larsson B, Wedel H, et al; Swedish Obese Subjects Study. Effects of bariatric surgery on mortality in Swedish obese subjects. N Engl J Med. 2007;357:741-52. 28.# Weight loss does not lower heart disease risk from type 2 diabetes. National Institute of Health (NIH), October 19, 2012 (http://www.nih.gov/news/health/oct2012/niddk-19.htm). 29.# Timpson NJ, Lawlor DA, Harbord RM, Gaunt TR, Day IN, Palmer LJ, et al. C-reactive protein and its role in metabolic syndrome: mendelian randomisation study. Lancet 2005;366:1954-9. 30. Casas JP, Shah T, Cooper J, Hawe E, McMahon AD, Gaffney D, et al. Insight into the nature of the CRP-coronary event association using Mendelian randomization. Int J Epidemiol. 2006;35:922-31. 31. CRP CHD Genetics Collaboration. Collaborative pooled analysis of data on C-reactive protein gene variants and coronary disease: judging causality by Mendelian randomisation. Eur J Epidemiol 2008;23:531-40. 32. Brunner EJ, Kivimäki M, Witte DR, Lawlor DA, Davey Smith G, Cooper JA, et al. Inflammation, insulin resistance, and diabetes Mendelian randomization using CRP haplotypes points upstream. PLoS Med. 2008;5:e155. 33. Elliott P, Chambers JC, Zhang W, Clarke R, Hopewell JC, Peden JF, et al. Genetic Loci associated with C-reactive protein levels and risk of coronary heart disease. JAMA 2009;302:37-48. 18

34.# C Reactive Protein Coronary Heart Disease Genetics Collaboration (CCGC), Wensley F, Gao P, Burgess S, Kaptoge S, Di Angelantonio E, Shah T, et al. Association between C reactive protein and coronary heart disease: mendelian randomisation analysis based on individual participant data. BMJ. 2011;342:d548. doi: 10.1136/bmj.d548. 35. Dahl M, Vestbo J, Zacho J, Lange P, Tybjærg-Hansen A, Nordestgaard BG. C reactive protein and chronic obstructive pulmonary disease: a Mendelian randomisation approach. Thorax 2011;66:197-204. 36. Emerging Risk Factors Collaboration, Kaptoge S, Di Angelantonio E, Lowe G, Pepys MB, Thompson SG, Collins R, et al. C-reactive protein concentration and risk of coronary heart disease, stroke, and mortality: an individual participant meta-analysis. Lancet. 2010;375:132-40. 37.# Voight BF, Peloso GM, Orho-Melander M, Frikke-Schmidt R, Barbalic M, Jensen MK, et al. Plasma HDL cholesterol and risk of myocardial infarction: a mendelian randomisation study. Lancet 2012;380:572-80. 38.# Haase CL, Tybjærg-Hansen A, Qayyum AA, Schou J, Nordestgaard BG, Frikke-Schmidt R. LCAT, HDL cholesterol and ischemic cardiovascular disease: a Mendelian randomization study of HDL cholesterol in 54,500 individuals. J Clin Endocrinol Metab 2012;97:E248-56. 39. Pfister R, Barnes D, Luben R, Forouhi NG, Bochud M, Khaw KT, et al. No evidence for a causal link between uric acid and type 2 diabetes: a Mendelian randomisation approach. Diabetologia 2011;54:2561-9. 40. Stender S, Frikke-Schmidt R, Nordestgaard BG, Grande P, Tybjaerg-Hansen A. Genetically elevated bilirubin and risk of ischaemic heart disease: three Mendelian randomization studies and a meta-analysis. J Intern Med. 2012 Jul 16. doi: 10.1111/j.1365-2796.2012.02576.x. [Epub ahead of print]. 19

41. Michos ED, Sibley CT, Baer JT, Blaha MJ, Blumenthal RS. Niacin and statin combination therapy for atherosclerosis regression and prevention of cardiovascular disease events: reconciling the AIM-HIGH (Atherothrombosis Intervention in Metabolic Syndrome With Low HDL/High Triglycerides: Impact on Global Health Outcomes) trial with previous surrogate endpoint trials. J Am Coll Cardiol. 2012;59:2058-64. 42. Newsletter 20/12/2012. Merck Announces HPS2-THRIVE Study of TREDAPTIVE (Extended-Release Niacin/Laropiprant) Did Not Achieve Primary Endpoint. (www.merck.com). 43.# Calabresi L, Nilsson P, Pinotti E, Gomaraschi M, Favari E, Adorni MP, et al. A novel homozygous mutation in CETP gene as a cause of CETP deficiency in a Caucasian kindred. Atherosclerosis. 2009;205:506-11. 44. Barter PJ, Caulfield M, Eriksson M, Grundy SM, Kastelein JJ, Komajda M, et al; ILLUMINATE Investigators. Effects of torcetrapib in patients at high risk for coronary events. N Engl J Med 2007;357:2109-22. 45. Cannon CP, Shah S, Dansky HM, Davidson M, Brinton EA, Gotto AM, et al; Determining the Efficacy and Tolerability Investigators. Safety of anacetrapib in patients with or at high risk for coronary heart disease. N Engl J Med 2010;363:2406-15. 46. Treatment of HDL to Reduce the Incidence of Vascular Events HPS2-THRIVE. Study design (http://www.clinicaltrial.gov) 47.# Schwartz GG, Olsson AG, Abt M, Ballantyne CM, Barter PJ, Brumm J, et al; the dal- OUTCOMES Investigators. Effects of Dalcetrapib in Patients with a Recent Acute Coronary Syndrome. N Engl J Med. 2012 Nov 5. [Epub ahead of print]. 48.# Pikula A, Beiser AS, DeCarli C, Himali JJ, Debette S, Au R, et al. Multiple biomarkers and risk of clinical and subclinical vascular brain injury: the Framingham Offspring Study. Circulation. 2012;125:2100-7. 20

49. Vassy JL, Shrader P, Jonsson A, Fox CS, Lyssenko V, Isomaa B, et al. Association between parental history of diabetes and type 2 diabetes genetic risk scores in the PP P-Botnia and Framingham Offspring Studies. Diabetes Res Clin Pract 2011;93:e76-9. 50.# Khera AV, Rader DJ. Discovery and validation of new molecular targets in treating dyslipidemia: the role of human genetics. Trends Cardiovasc Med 2009;19:195-201. 21