BD Haemophilus Test Medium Agar (HTM)

Transkript

1 PA BRUKSANVISNING FÄRDIGA ODLINGSPLATTOR PA Rev.: April 2013 BD Haemophilus Test Medium Agar (HTM) AVSEDD ANVÄNDNING BD Haemophilus Test Medium Agar (HTM) används i den antimikrobiella diskdiffusionsproceduren för resistensbestämning av kliniska isolat av Haemophilus-arter enligt beskrivningen i Approved Standard M2, som publicerats av Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). 1 PRINCIPER FÖR OCH FÖRKLARING AV METODEN Mikrobiologisk metod. Mueller Hinton Agar kompletterad med 1 % hemoglobin och 1 % IsoVitaleX Enrichment (Mueller Hinton chokladagar) var det medium som tidigare rekommenderades för Haemophilus influenzae. 2 Omfattande studier utförda av Jorgensen och hans kollegor ledde till utvecklingen av Haemophilus Test Medium (HTM). 3,4 Detta medium är Mueller Hinton-agar kompletterad med X-faktor (hemin eller hematin), V-faktor (nikotinamidadenindinukleotid, NAD) samt jästextrakt. En stor fördel med HTM Agar jämfört med Mueller Hinton chokladagar är optimal klarhet, som möjliggör zondiametermätning från botten av skålen på samma sätt som i standardtestproceduren för icke-svårodlade organismer på Mueller Hinton Agar. Dessutom innehåller HTM Agar lägre nivåer tymidin och är därför lämpligt för testning av trimetoprim/sulfametoxazol. Tolkningskriterier för bestämningen av antibiotikaresistens för Haemophilus tillhandahålls i CLSI-dokument M100 (M2), vilket är inkluderat i CLSI-dokument M2. 1 Detta dokument bör konsulteras för ytterligare detaljer. BD Haemophilus Test Medium-agar består av Mueller Hinton-agar kompletterad med X-faktor (hemin eller hematin), V-faktor (nikotinamidadenindinukleotid, NAD) och jästextrakt. REAGENSER BD Haemophilus Test Medium-agar (HTM) Sammansättning* per liter aqua purif. Nötextrakt 2,0 g Kaseinhydrolysat 17,5 Stärkelse 1,5 Agar 17,0 Jästextrakt 5,0 Hematin 0,015 Nikotinamidadenindinukleotid (NAD) 0,015 ph 7,3 ± 0,1 *Justerad och/eller kompletterad efter behov för att uppfylla prestandakriterierna. FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER. Endast för professionellt bruk. Plattorna får inte användas om de visar tecken på mikrobiell kontamination, missfärgning, uttorkning, sprickbildning eller annan försämring. Svår krympning av detta mediet på grund av uttorkning kan leda till falska känslighetsresultat. Se skriften ALLMÄN BRUKSANVISNING för information om aseptiska förfaranden vid hantering, biorisker och bortskaffning av använd produkt. FÖRVARING OCH HÅLLBARHET Förvara plattorna mörkt vid 2 till 8 C i originalomslaget efter mottagandet fram till dess de skall användas. Överhettning och nedfrysning skall undvikas. Plattorna kan inokuleras fram till

2 utgångsdatum (se etiketten på förpackningen) och inkuberas under rekommenderad inkubationsperiod. Plattor från öppnade 10-plattförpackningar kan användas i en vecka vid förvaring i ren miljö vid 2 till 8 C. KVALITETSKONTROLL UTFÖRD AV ANVÄNDAREN För användarkvalitetskontroll, bör CLSI 1 eller, om tillämpligt, nationella standarder konsulteras. Principiellt bör procedurerna beskrivna nedan under Testförfarande utföras med användning av referensstammarna nämnda under Material som ej medföljer. BD Haemophilus Test Medium-agar (HTM) plattor och de antimikrobiella diskerna som används bör testas åtminstone två gånger i vecka för korrekt prestanda. Utseende av icke-inokulerat medium: ljust bärnstensfärgad. FÖRFARANDE Tillhandahållet material BD Haemophilus Test Medium-agar (90 mm Stacker-plattor). Mikrobiologiskt kontrollerade. Material som ej medföljer 1. Inokulationsbuljong i rör, såsom BD Trypticase Soy Broth (BD Trypticase sojabuljong) (soyabönskaseinspjälkad buljong) eller Mueller Hinton II-buljong (katjonjusterad), i rör med 5 ml-volymer för beredningen av ett standardinokulat och steril buljong eller koksalt för spädning av inokulat. 2. Bariumsulfat, jämförande standard (0,5 ml 0,048 M BaCl 2 [1,175 % vikt/volym BaCl 2. 2H 2 O] till 99,5 ml 0,18 M [0,36 N] H 2 SO 4 [1 % volym/volym]). 3. Fotometrisk utrustning för justering av inokulatsuspensionens grumlighet till motsvarande 0,5 McFarland standard. 4. Som ett alternativ till ovanstående material (1-3), kan BD Prompt Inoculation System (BBL Prompt Inoculation-systemet) (utrustning för volumetrisk beredning av inokulat) användas. 5,6 5. Kontrollodlingar - Haemophilus influenzae ATCC 49247, ATCC och ATCC Papperslappar impregnerade med specificerade mängder antimikrobiella ämnen, såsom BD Sensi-Disc-lappar för resistensbestämning. 7. Applikator, såsom BD Sensi-Disc 6-platsapplikator. 8. Linjal eller annan mätutrustning för att mäta zonstorlek i millimeter. 9. En inkubator som producerar luft som innehåller 5 % CO 2, eller annan utrustning som producerar CO 2 -anrikad aerob luft. 10. Ett reagens för att utföra en snabb ß-laktamastest såsom BD Cefinase-lappar. 11. Extra odlingsmedier, reagenser och laboratorieutrustning efter behov. Provtyper Denna produkt används för resistensbestämning av rena kulturer av Haemophilus som har isolerats i kliniska prover (se även KLINISKA PRESTANDA OCH PROCEDURENS BEGRÄNSNINGAR). Testförfarande 1. Bered en Gram-färgning före resistensbestämningstestens början för att kontrollera odlingens renhet och preliminär identifikation av Haemophilus. 2. Använd flera välisolerade odlingar, tagna direkt från en chokladagarplatta som stått över natten (helst 2024 h) som inokulatkälla. 3. Använd en snabb ß-laktamastest för snabb detektion av stammar som är resistenta mot penicillin, ampicillin eller amoxicillin. 4. Bered en suspension av testorganismen i Mueller Hinton buljong, Mueller Hinton II buljong eller 0,9-procentig koksaltlösning. Denna suspension skall justeras till 0,5 McFarland-standardens grumlighet med fotometrisk utrustning. Suspensionen kommer att innehålla cirka 1-4 x 10 8 CFU/mL. Försiktighet måste iakktagas vid beredning av denna suspension på grund av att högre inokulatkoncentrationer kan leda till falskt resistenta PA

3 resultat med några ß-laktamantibiotika, speciellt när ß-laktamasproducerande stammar av H. influenzae testas Alternativa metoder för beredning av inokulat som involverar anordningar vilka tillåter direkt standardisering av inokulat utan justering av grumlighet, såsom BD Prompt Inoculation-systemet, har befunnits vara acceptabla för rutinmässiga analyseringssyften inkluderande testning av H. influenzae. 5,6 6. Inom 15 minuter efter det att inokulatets grumlighet har justerats skall en steril provpinne doppas i det korrekt spädda inokulatet, pressas och vridas ordentligt mot rörets övre insida flera gånger, så att överskottsvätska pressas ut. 7. Inokulera BD Haemophilus Test Medium-agar plattans hela agaryta tre gånger, vrid plattan 60 mellan utstryken för en jämn inokulation. 8. Locket kan lämnas på glänt i 35 minuter medan plattan förvaras i rumstemperatur, men inte längre än 15 minuter, så att eventuell fukt på ytan kan absorberas innan de läkemedelsimpregnerade lapparna appliceras. 9. Applicera lapparna med hjälp av en applikator för antimikrobiella lappar under iakttagande av aseptiska försiktighetsåtgärder. De flesta antimikrobiella ämnen producerar större hämningszoner när de testas mot Haemophilus jämfört med andra organismer. Följaktligen bör inte fler än fyra antimikrobiella lappa placeras på en enda 100-m platta, inkluderande inte fler än sex av de följande lapparna: tredje generationens cefalosporiner (t.ex. cefotaxim, ceftazidim, ceftriaxon, ceftizoxim), aztreonam, imipenem, eller ciprofloxacin. Efter att lapparna har placerats på agarn skall de tryckas ned med en steril nål eller pincett så att de har fullständig kontakt med mediets yta. 10. Inom 15 min efter lapparna har applicerats skall plattorna vändas och inkuberas i h vid 35 C i aerob luft anrikad med 5 % koldioxid. 11. Stryk på H. influenzae ATCC på en platta med BD Haemophilus Test Mediumagar och inkubera tillsammans med plattorna för resistensbestämning för att fastställa om mediet främjar tillräcklig tillväxt. Resultat 1. Undersök plattorna efter 16 till 18 h inkubering. En sammanflytande matta av tillväxt bör erhållas. Om endast isolerade kolonier växer var inokulatet för tunt och bestämningen bör göras om. 2. Mät diametern på zonerna med fullständig hämning (enligt bedömning med blotta ögat), inklusive lappens diameter, till närmaste hela millimeter med ett skjutmått, en linjal eller mall som iordningsställts i detta syfte. Mätinstrumentet hålls på baksidan av plattan, vilken hålls över en svart, icke-reflekterande bakgrund och belyses från ovan. 3. Slutpunkten skall tas där området inte visar någon tydlig tillväxt som kan detekteras med blotta ögat. Bortse från svag tillväxt av små kolonier som kan detekteras med svårighet nära hämningszonens markerade kant. Bortse därför från en lätt tillväxt (20 % eller mindre av tillväxtmattan) med trimetoprim och sulfonamider, eftersom spår av antagonister i mediet kan möjliggöra en viss svag tillväxt. Mät den mer markerade kanten för att bestämma zondiametern. Beräkning och tolkning av resultat Se CLSI-dokument M100 (M2) för tolkning av resultat som erhålls med kliniska Haemophilusisolat. 1 Resultat kan rapporteras som resistent, intermediärt eller känsligt, beroende på den zondiameter som erhålls. Organismer som testats positiva för ß-laktamasproduktion bör betraktas som resistenta mot ampicillin oavsett vilken zondiameter som erhålls. Det bör noteras att ampicillin- Resistenta stammer av H. influenzae som saknar ß-laktamasaktivitet har beskrivits. 7 Följaktligen, om zondiametern visar resistens för ampicillin, bör isolatet rapporteras som resistent för detta läkemedel, även om ß-laktamastestet är negativ. Kontrollodlingar bör inkluderas varje gång en resistensbestämning utförs eller veckovis om tillfredsställande prestanda kan dokumenteras enligt CLSI standard M2 vilken inkluderar tabellerna (M100) med de korrekta zondiametrarna. 1 Obs! Tilläggstabeller till CLSI-dokument M2, som innehåller reviderade versioner med reviderade tabeller för antimikrobiella lappar och tolkningsstandarder, publiceras regelbundet. De senaste PA

4 tabellerna bör konsulteras för information om aktuella rekommendationer. Den fullständiga standarden och tilläggstabellerna kan beställas från Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, PA USA. Tel.: KLINISKA PRESTANDA OCH METODENS BEGRÄNSNINGAR A. Reproducerbarhetsstudie 8 Tre produktionspartier av BD Haemophilus Test Medium-agar utvärderades med den bestämning av antibiotikaresistens via lappmetod (M2-A4) som rekommenderades av NCCLS vid den tidpunkten. 9 Totalt 12 antimikrobiella ämnen (amoxicillin/clavulanat, ampicillin, ampicillin/sulbaktam, cefaklor, cefonicid, ceftriaxon, cefuroxim, kloramfenikol, ciprofloxacin, rifampin, tetracyklin, trimetoprim/sulfametoxazol) och 14 stammar H. influenzae användes i studien. Sju av de 14 stammarna var American Type Culture Collection (ATCC) -stammar och de övriga sju stamkulturer, vilket inkluderade sex kliniska isolat och en industriell kvalitetskontrollkultur. Zondiametrarna som erhölls med var och en av de tre mediumpartierna jämfördes med tolkningskriterierna (tabell 2A) i M2-A4. 9 I endast sex fall erhölls zoner i ett parti som skulle ge en annan tolkningskategori vid en jämförelse med de andra två partierna. Fyra av de sex diskrepanserna uppstod med tetracyklin, en med cefaklor och en med cefuroxim. I fallet med tetracyklin skulle resultatet ha gett antingen tolkningskategorin känslig eller indeterminant (smärre fel). Skillnaden på 1 mm som uppstod med cefaklor och cefuroxim skulle ha resulterat i antingen en indeterminant eller resistent kategori, också det ett smärre fel. Det fanns fem stammar av H. influenzae som producerade -laktamas i studien. Varje HTM-parti producerade, med var och en av dessa stammar, zondiametrar med ampicillin som skulle tolkas som resistenta. Två av de fem stammarna producerade också kloramfenikol acetyltransferas (CAT). Kloramfenikolzonerna som erhölls med dessa två stammar skulle vara förenliga med kloramfenikolresistens. 10,11 B. Jämförelse med Mueller Hinton chokladagar 8 NCCLS lappmetoden utfördes med 213 kliniska isolat av H. influenzae på HTM-agar och Mueller Hinton chokladagar. 9,12 De antimikrobiella ämnena som testades var ampicillin, ampicillin/sulbaktam, amoxicillin/clavulanat och kloramfenikol. Dessa var de enda antimikrobiella ämnen för vilka tolkningskriterier för zondiameter hade definierats för Mueller Hinton chokladagar. 13,14 Följande resultat erhölls. Mueller Hinton chokladagar Överensstämmelse 99.6% BD Haemophilus Test Medium-agar S I R S I R S = Känslig I= Indeterminant R= Resistent Två större fel och ett mindre fel förekom med ampicillin. I de båda större felen producerade BD Haemophilus Test Medium-agar ett resistent resultat, medan Mueller Hinton chokladagar producerade ett känsligt resultat. Dessa båda isolat var beta-laktamaspositiva. Därför var det resistenta resultatet alltså korrekt. Det mindre felet uppstod med ett isolat som producerade ett indeterminant resultat på HTM Agar och ett känsligt resultat på Mueller Hinton Chocolate Agar. C. Procedurens begränsningar Vid vissa kombinationer av organismer/antimikrobiella ämnen har hämningszonen inte alltid en skarpt avgränsad kant, vilket kan leda till feltolkning. Felaktig inokulatkoncentration kan producera felaktiga resultat. Hämningszonerna kan vara för små om inokulatet är för tungt och för stora och svåra att mäta om inokulatet är för lätt. Felaktig förvaring av antimikrobiella lappar kan orsaka försvagad läkemedelskoncentration och ett falskt resistent resultat. En organisms känslighet in vitro mot ett specifikt antimikrobiellt ämne betyder inte nödvändigtvis att ämnet kommer att vara effektivt in vivo. Se tillämpliga texter avseende vägledning vid resultattolkning. 2,15 PA

5 REFERENSER 1. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, formerly NCCLS). Approved standard: M2. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests. CLSI, Wayne, PA, USA.Search for latest version at 2. Thornsberry, C., T.L. Gavan, E.H. Gerlach Cumitech 6, New developments in antimicrobial agent susceptibility testing. Coordinating ed., J.C. Sherris. American Society for Microbiology, Washington, D.C 3. Jorgensen, J.H., J.S. Redding, L.A. Maher, and A.W. Howell Improved medium for antimicrobial susceptibility testing of Haemophilus influenzae. J. Clin. Microbiol. 25: Jorgensen, J.H., A.W. Howell, and L.A. Maher Antimicrobial susceptibility testing of less commonly isolated Haemophilus species using Haemophilus test medium. J. Clin. Microbiol. 28: Baker, C.N., C. Thornsberry, and R.W. Hawkinson Inoculum standardization in antimicrobial susceptibility testing: evaluation of overnight agar cultures and the rapid inoculum standardization system. J. Clin. Microbiol. 17: Marsik, F., G. Evans, J. Fowler, and L. Thompson Comparison of the BBL Prompt system, Abbott A-Just, and visual method for the preparation of Haemophilus influenzae inoculum for the Bauer-Kirby procedure, abstr. C-67, p Abstr. 89th Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol Doern, G.V., J.H. Jorgensen, C. Thornsberry, D.A. Preston, T.A. Tubert, J.S. Redding, and L.A. Maher A national collaborative study of the prevalence of antimicrobial resistance among clinical isolates of Haemophilus influenzae. Antimicrob. Agents Chemother. 32: Data on file. BD Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA. 9. National Committee for Clinical Laboratory Standards Approved standard: M2-A4. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests, 4th ed. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, Pa. 10. Azemun, P., T. Stull, M. Roberts, and A.L. Smith Rapid detection of chloramphenicol resistance in Haemophilus influenzae. Antimicrob. Agents Chemother. 20: Doern, G.V., G.S. Daum, and T.A. Tubert In vitro chloramphenicol susceptibility testing of Haemophilus influenzae: disk diffusion procedures and assays for chloramphenicol acetyltransferase. J. Clin. Microbiol. 25: National Committee for Clinical Laboratory Standards Approved standard: M2-A3. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests, 3rd ed. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, Pa. 13. National Committee for Clinical Laboratory Standards Second Informational Supplement: M100-S2. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, Pa. 14. Doern, G.V. and R.N. Jones Antimicrobial susceptibility testing of Haemophilus influenzae, Branhamella catarrhalis, and Neisseria gonorrhoeae. Antimicrob. Agents Chemother. 32: Woods, G.L., and J.A. Washington Antibacterial susceptibility tests: dilution and disk diffusion methods, p In P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, and R.H. Yolken (ed.), Manual of clinical microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. USA. FÖRPACKNINGAR/TILLGÄNGLIGHET BD Haemophilus Test Medium Kat.nr Färdiga odlingsplattor, 20 st. per förpackning YTTERLIGARE INFORMATION Kontakta närmaste BD-representant för ytterligare information. PA

6 Becton Dickinson GmbH Tullastrasse 8 12 D Heidelberg/Germany Phone: Fax: Reception_Germany@europe.bd.com Prompt is a trademark of 3M ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection BD, BD Logo and all other trademarks are the property of Becton, Dickinson and Company BD PA