BACTEC 12B Mycobacteria Culture Vials Middlebrook 7H12

Transkript

1 BACTEC 12B Mycobacteria Culture Vials Middlebrook 7H12 PP116JAA 2007/06 Svenska AVSEDD ANVÄNDNING Det kvalitativa BACTEC 12B Mycobacteria Medium rekommenderas för odling och påvisning av mykobakterier från kliniska prover, sputum, ventrikelsköljvätska, urin, vävnad, mukopurulenta prover eller andra kroppsvätskor eller respirationssekret, vid differentiering av Mycobacterium tuberculosis-komplexet från andra mykobakterier och bestämning av läkemedelsresistens mot M. tuberculosis. SAMMANFATTNING OCH FÖRKLARING BACTEC Radiometric Technique har i stor utsträckning använts för snabb påvisning av mykobakterier i sputum eller andra kliniska prover. 1-4 Alla typer av kliniska prover, pulmonella såväl som extrapulmonella, kan behandlas med BACTEC för primär isolering på ett liknande sätt som med konventionella metoder. 2,5-7 Detaljer återfinnes i CDC Manual, i avsnittet Förfarande för isolering och indentifiering av mykobakterier. 3 Provet som skall testas inokuleras i en eller flera flaskor med 12B Mycobacteria Medium med en spruta genom gummimembranet, och inkuberas. Odlingsflaskan sätts regelbundet in i BACTEC 460TB System Instrument för testning, vilket består av aspiration av gasen i flaskans gasutrymme och analys av dess radioaktiva innehåll. En positiv avläsning indikerar förekomst av viabla mikroorganismer i flaskan. PRINCIPER FÖR METODEN BACTEC 12B Mycobacteria Medium är en Middlebrook 7H9-berikad buljongbas. Om mikroorganismer förekommer i provet som inokulerats i BACTEC-flaskan, nyttjar de ett 14 C-märkt substrat (fettsyra) som förekommer i mediet och 14CO 2 frigörs i atmosfären ovanför mediet. När flaskorna testas på BACTEC 460TB systeminstrumentet bestäms gasen som aspireras från flaskan kvantitativt och 14 CO 2 -radioaktivitet utrycks i siffror på en skala från 0 till 999. Dessa siffror benämns Growth Index (GI, tillväxtindex). Dessa GI-siffror visas av BACTEC 460TB System instrumentet och skrivs också ut tillsammans med siffrorna för identifiering av flaskor och flaskställ (100 GI-enheter motsvarar cirka 0,025 µci). Den dagliga ökningen av GI är direkt proportionell mot frekvens och mängd tillväxt i mediet. Om en inhiberande substans tillförs mediet, indikeras hämning av metabolism med en reducerad produktion 14CO 2 vid jämförelse med ett kontrollmedium utan inhiberande substans. Denna grundläggande princip tillämpas för resistensbestäming av läkemedel och vid differentiering av M. tuberculosis-komplexet från andra mykobakterier. BACTEC 460TB systeminstrumentet måste användas med en speciell TB-kåpa vid mykobakteriologiska procedurer. TB-kåpan tillhandahåller HEPA-filtrerad utblåsningsluft och negativt tryck i provområdet. Dessutom är TB-kåpan utrustad med en ultraviolett ljuskälla i testområdet. Enheten är utformad för automatisk testning av odlingsflaskor och får inte användas för inokulation eller fortsatt odling istället för ett biologiskt skåp. REAGENSER BACTEC 12B Medium odlingsflaskor innehåller följande reaktiva beståndsdelar före användning: Mängd som tillsätts per liter behandlat vatten 7H9 buljong ,7 g Kaseinhydrolysat ,0 g Bovint serumalbumin ,0 g Katalas enheter 14 C-substrat µci Sammansättningen kan ha justerats för att uppfylla specifika funktionskrav. Varningar och försiktighetsbeaktanden: Avsedd för in vitro-diagnostik. Denna produkt innehåller torrt naturgummi. Patogena mikroorganismer, inklusive hepatitvirus och humant immunbristvirus, kan förekomma i kliniska prover. Allmänna försiktighetsbeaktanden 8-11 och institutionens riktlinjer bör följas vid hantering av alla föremål som kontaminerats med blod eller andra kroppsvätskor. Utför alla förfaranden, inklusive beredning av prover, förberedelse av utstryk eller inokulat, spädning, inokulation av medier, fortsatt odling etc. i ett lämpligt biologiskt säkerhetsskåp i ett rum med fullgott ventilationssystem enligt rekommendationer från CDC. 3 Använd lämplig skyddsrock, munskydd och handskar vid hantering av prover och odlingar med potentiella patogener. Följ rekommendationerna från CDC och OSHA. Före användning skall varje flaska undersökas för tecken på skada, försämring eller kontamination, såsom grumlighet, buktande eller indraget membran. Flaskor som uppvisar tecken på kontamination FÅR EJ användas. Det kan vara övertryck i en kontaminerad flaska. Flaskkontamination är inte alltid tydligt synlig. Grumliga, kontaminerade eller missfärgade (mörka) flaskor bör inte användas. Flaskor som visar tecken på skada skall kasseras före inokulation. I sällsynta fall kan sprickor ha uppstått i glasflaskan och halsen kan gå sönder när

2 locket dras av eller under hantering. Det kan också i sällsynta fall förekomma att flaskan inte är fullständigt förseglad. I båda fallen kan flaskans innehåll läcka eller spillas ut, speciellt om flaskan vänds upp och ned. Om flaskan har inokulerats skall det utläckta eller spillda materialet hanteras med försiktighet eftersom det kan innehålla patogena organismer/agens. Alla ympade flaskor skall steriliseras i autoklav innan de kasseras. Positiva odlingsflaskor för fortsatt odling eller infärgning, m.m.: Före uttagning av prov ur flaskan måste den gas som kan ha bildats av den mikrobiella metabolismen släppas ut. Inokulation och provtagning bör utföras i ett biologiskt skåp och lämplig skyddsklädsel, inklusive handskar och munskydd, skall bäras. Se avsnittet Förfarande för ytterligare information om fortsatt odling. För att minimera risken för läckage vid inokulation av prover på odlingsflaskor, skall sprutor med permanent fastsatta nålar eller säkert anslutna Luer-Lok-spetsar användas. Flaskans gummimembran skall desinficeras varje gång innan nålen förs in i flaskan. Rengör locket på varje flaska med ett desinfektionsmedel, därefter med 70-procentig alkohol. Använd ett lämpligt desinfektionsmedel för rengöring av arbetsområdet, avtorkning av flaskans membran och andra ytor. CDC påpekar: Med så många tillgängliga desinfektionsmedel är det viktigt att rådfråga produktbroschyrerna för att säkerställa att desinfektionsmedlet är bakteriedödande för mykobakterier. 12 Arbete med spruta och nål kräver speciell uppmärksamhet och försiktighetsåtgärder. Använd sprutor med permanent fastsatta nålar eller ordentligt fästa Luer-Lok-spetsar. Sprutan skall hanteras med tillämplig försiktighet. Sätt inte tillbaka nålskyddet efter användning. Sprutor skall kasseras i behållare för vassa instrument och dessa behållare skall hanteras med försiktighet. Se godkänd riktlinje M29 från NCCLS, Protection of Laboratory Workers from Occupationally Acquired Infections. 8 Förvaringsanvisningar Flaskorna med BACTEC 12B Mycobacteria skall förvaras torrt vid 2 25 C. Mediumflaskorna är stabila vid rekommenderade förvaringsförhållanden fram till angivet utgångsdatum. Det är en god metod att åtskilja radioaktivt material genom att förvara detta i ett skåp som endast auktoriserad personal har tillgång till. Skåpet skall märkas med orden Varning: Radioaktivt material. Mediet får inte exponeras för direkt, stark belysning. Testa alltid varje 12B-flaska initialt på BACTEC 460TB systeminstrumentet för att etablera en 5 10 % CO 2 luft i flaskan och för att sortera bort flaskor med höga bakgrundsavläsningar. Om en flaska avläses GI 20 eller mer vid den initiala screeningen skall den kasseras. PROVTAGNING Provtagning och hantering skall ske i enlighet med standardmetoder som återges i CDC användarmanual 3 och i BACTEC 460TB System Product and Procedure Manual (MA-0029). FÖRFARANDE Tillhandahållet material: BACTEC 12B Medium Material som krävs men ej medföljer: BACTEC PANTA PLUS Kit BACTEC NAP Differentiation Kit BACTEC 460TB Instrument Tuberkulinspruta med permanent fastsatt nål Desinfektionslösning 70-procentig isopropylalkoholtork Steril nål med filter Provbehandling: Ett flertal procedurer för nedbrytning och dekontaminering har rekommenderats och efterföljs i olika laboratorier. Vissa förfaranden är endast kompatibla med äggbaserade medier och är inte lämpliga för användning med BACTEC-metoden. Natriumhydroxid (NaOH) och N-acetyl-L-cystein-NaOH (NALC) metoder rekommenderas för BACTEC 460TB-systemet. Andra metoder kan vara kompatibla med BACTEC-proceduren, men det finns inte tillräckligt med data för att kunna påvisa detta med säkerhet. Ingen dekontaminering krävs för prover som tagits med aseptisk metod. Se BACTEC 460TB System Product and Procedure Manual vad gäller detaljer. Inokulation av 12B Medium: Dra av locket från BACTEC-flaskan och inspektera flaskan före inokulation, med avseende på sprickor, kontamination, uttalad grumlighet och buktande eller indraget membran. Flaskan FÅR EJ användas om någon defekt noteras. Testa alla 12B Medium-flaskor på BACTEC 460TB-systemet för att utesluta flaskor med höga bakgrundsavläsningar (GI 20) och för att etablera en CO 2 -berikad luft i flaskan. 12B Medium kan användas som ensamstående medium för påvisning av mykobakterier. För maximal påvisning av mykobakterier kan dock ett rör med Lowenstein-Jensen (LJ), andra modifieringar av LJ-medium, eller 7H10/7H11 (vanlig eller dubbel platta) också inkluderas tillsammans med 12B-flaskan. 13 Beslut om att använda 12B-mediet ensamt eller tillsammans med ytterligare konventionella medier skall tas efter granskning av varje institutions egen erfarenhet och krav, samt efter genomgång av publicerade data. 4-7,14,15 Kontamination kan reduceras genom att mediet kompletteras med en blandning av antimikrobiella substanser före inokulationen. 16 PANTA Supplement, som innehåller polymyxin B, amfotericin B, nalidixinsyra, trimetoprim och azlocillin, finns tillgängligt i frystorkad form (se BACTEC 460TB System Product and Procedure Manual vad 2

3 gäller detaljer). Inokulation av provet måste utföras inom 2 timmar efter tillsatsen av PANTA i 12B mediumflaskan. Reconstituting Fluid (RF) innehåller en tillväxtfrämjande substans, POES (polyoxyetylenstearat). 17 När PANTA inte används rekommenderas det därför att endast 0,1 ml RF tillsätts till 12B Medium före inokulationen av provet. Använd en ny steril spruta med en permanent fastsatt nål eller en Luer-Lok-spets för varje prov och inokulera 0,5 ml av det väl blandade provkoncentratet på varje 12B mediumflaska. En större volym kommer att påverka mediets ph pga. inokulatets höga ph. Prover som tas aseptiskt och inte dekontamineras kan dock inokuleras med så mycket som 1,0 ml. Större volymer än 1,0 ml kommer att späda mediet vilket kan påverka tillväxten. Desinficera gummimembranet på varje flaska med ett lämpligt desinfektionsmedel efter inokulationen eller efter uttagning av alikvota delar från en inokulerad flaska. Rengör med en 70-procentig alkoholtork. Inokulerade flaskor skall inkuberas vid 37 C ± 1 C utan att skakas och testas i ett BACTEC 460TB System instrument med 5 10 % CO 2 i luften. Testa flaskorna varannan eller var tredje dag de första två veckorna och därefter en gång i veckan i totalt sex veckor. Testningsschemat kan variera beroende på laboratoriets arbetsbörda. Om ett prov misstänks innehålla mykobakterier som kräver en annan optimal temperatur än 37 C (t.ex. M. marinum och M. chelonae kräver 30 C), skall två satser media inokuleras; ett för inkubation vid 37 C och ett annat för en mer optimal temperatur. Förbered ett utstryk från en BACTEC 12B mediumflaskan vid tillväxtindex på Om det är positivt för AFB skall det rapporteras som odlingspositivt, identifiering pågår. Fortsatt odling på fast medium. Alla fortsatta odlingar skall inkuberas vid 37 C ± 1 C. TB-differentiering: Utför BACTEC NAP-testen i enlighet med rekommenderat förfarande när tillväxtindex i 12B mediumflaskan når 50. Detta kommer att differentiera TB-komplex från andra mykobakterier än tuberkulos (MOTT). Artbestämning av mykobakterier skall utföras med konventionella metoder i enlighet med rekommendationer från Centers för Disease Control and Prevention. 3 Fortsatt odling: Innan provtagning, fortsatt odling eller infärgning utförs skall flaskan ställas upprätt och en alkoholtork läggas över membranet. För att avlasta trycket i flaskan sticks en steril nål med lämpligt filter eller kompress in genom alkoholtorken och membranet. Avlägsna nålen efter trycket har avlastats och innan prov tas från flaskan för fortsatt odling. Nålen bör föras in och dras ut rakt; undvik vridrörelser. Bestämning av läkemedelsresistens: Varje test för bestämning av läkemedelsresistens kan iordningställas med ett tillväxtindex på ytterligare dag av inkubering eller tillväxtindex 500 (se BACTEC 460TB System Product and Procedure Manual för detaljer). KVALITETSKONTROLL Odlingsflaskorna FÅR EJ användas efter utgångsdatum. Spruckna eller defekta odlingsflaskor FÅR EJ användas utan skall kasseras på föreskrivet sätt. Kvalitetskontrollbevis medföljer varje låda odlingsmedier. Kvalitetskontrollbevisen anger testorganismer, inklusive ATCC-kulturer specificerade i NCCLS-standarden Quality Assurance for Commercially Prepared Microbiological Culture Media (kvalitetskontroll för kommersiellt tillverkade mikrobiologiska odlingsmedier). 18 Som en del i det dagliga underhållsschemat skall Performance Test-flaskor (BACTEC Performance Test Kit) testas på BACTEC 460TB-instrumentet. Om låga avläsningar erhålls, trots korrekt testning av Performance Test-flaskor, kan det tyda på möjliga instrumentproblem (se BACTEC PTK förpackningsinlaga PP-046JAA). Kvalitetskontroll måste utföras i enlighet med gällande bestämmelser eller ackrediteringskrav samt laboratoriets etablerade procedurer för kvalitetskontroll. Användaren hänvisas till relevanta riktlinjer från NCCLS och bestämmelser från CLIA gällande tillämpliga rutiner för kvalitetskontroll. RESULTAT Instrumentet avläses direkt på en skala på 0 999, ett så kallat tillväxtindex. Inga beräkningar krävs. Tillväxtindex är ett mått på den 14 CO 2 -radioaktivitet som aspireras in i jonkammaren och är direkt proportionell mot mängden aktiv tillväxt i flaskan. Aktuella gällande bestämmelser (CLIA 88, USA) kräver att instrumentets utskrift av testresultatet samordnas med det korrekta patientprovet. Dessa utskrifter måste sparas under en period på minst två år. Gällande lokala eller statliga bestämmelse kan vara mer restriktiva än federala krav (USA). Rådfråga dessa bestämmelser vad gäller ytterligare uppfyllande av dessa krav. När tillväxtindex når 10 eller mer skall odlingen betraktas som presumptivt H-positiv och flaska skall testas dagligen. AFB-utstryket är viktigt för bekräftelse av förekomst av mykobakterier. Om syrafasta stavar observeras på utstryket från en positiv odlingsflaska kan provet rapporteras som odlingspositivt för ABF (identifiering pågår). Negativa odlingar skall rapporteras efter sex veckors inkubering. Detektionstiden för en positiv odling varierar avsevärt beroende på sådana faktorer som provtyp, antal organismer som förekommer i provet, patientens behandlingsstatus och inkuberingstemperatur. Metodskillnader, speciellt i dekontamineringsmetoden, kan spela en viktig roll vad gäller detektionstiden. Genomsnittlig detektionstid för M. tuberculosis från kliniska prover (utstryk negativt eller utstryk positivt) har rapporterats vara 7 till 12 dagar. MOTT-baciller detekteras vanligtvis två till tre dagar tidigare än M. tuberculosis. 4,6,7,14,15 Incidensen av kontamination varierar från laboratorium till laboratorium, beroende på den dekontamineringsprocedur som används. Kontamination i 12B isoleringsflaskan är vanligtvis lägre än vad som rutinmässigt observeras i konventionella medier där en kontaminationsfrekvens på upp till 5 % accepteras. Anteckna kontaminationsresultaten och beräkna frekvensen för kontamination regelbundet. Granska protokollet för provbehan- 3

4 dling och justera vid behov. En kontaminerad flaska med 12B Medium kan steriliseras, se BACTEC 460TB System Product and Procedure Manual vad gäller förfarande. METODENS BEGRÄNSNINGAR Försiktighet skall iakttagas så att kontamination av provet under provtagning och inokulation på BACTEC-flaskan förhindras. En kontaminerad flaska kan ge en positiv instrumentavläsning men indikerar inte ett kliniskt relevant positivt prov. Användaren måste avgöra huruvida provet är kontaminerat eller ej, på grundval av sådana faktorer som typ av påvisad organism, uppträdande av samma organism i flera odlingar, patientens anamnes, lämpliga kontroller av utrustningen etc. Kontamination kan också uppstå från felaktigt underhåll av BACTEC-nålar och slangar, dålig rengöring av membranet eller felfunktion hos BACTEC nålvärmningsenhet (se BACTEC 460TB Operation and Maintenance Manual). Tillväxtindex reflekterar frekvens och mängd tillväxt i mediet, men kan inte kvantifieras lika noggrant som fastställning av antalet odlingar på fast medium. Kolonimorfologi och pigmenteringsegenskaper kan endast bestämmas på fasta medier. På grund av de i odlingsmedier ingående biologiska materialens natur och organismernas variabilitet, bör användaren vara medveten om möjligheten för varierande resultat vid påvisning av vissa mikroorganismer. KLINISKA PRESTANDA I en studie av Tortoli et al. jämfördes påvisning av mykobakterier i två automatiska och ett manuellt system. Vid användning av BACTEC 460-systemet och 12B Mycobacteria Medium erhölls 201 isolat, jämfört med 190 isolat vid användning av BACTEC MGIT 960-systemet och 167 isolat vid användning av Lowenstein-Jensen-medium. Genomsnittlig tid till detektion med BACTEC 460 och 12B-medium var 14,8 dagar. 19 TABELL 1. Påvisning av mykobakterier med individuella system och kombinationer av system a Totalt antal (%) påvisade Mykobakterier Samtliga BACTEC MGIT BACTEC 460 Lowenstein-Jensen BACTEC MGIT 960 BACTEC 460 eller prover medier 960 system system medium system + system + Lowenstein-Jensen Lowenstein-Jensen medium medium Samtliga (80) 201 (85) 167 (71) 212 (90) 225 (95) M. tuberculosis komplex (88) 153 (92) 124 (74) 158 (94) 160 (95) M. xenopi (54) 11 (46) 17 (71) 21 (87) 22 (92) M. avium komplex (95) 22 (100) 16 (73) 21 (95) 22 (100) Övriga MOTT b 21 7 (33) 15 (71) 10 (48) 12 (57) 21 (100) Utstryk positivt (53) 121 (53) 103 (45) 125 (55) 127 (56) Utstryk negativt (63) 80 (74) 64 (59) 87 (80) 98 (91) a Oftare förekommande bakteriestammar betraktas separat, även prover med utstryk positivt och utstryk negativt. b MOTT, Mycobacteria Other Than Tuberculosis (andra mykobakterier än M. tuberculosis). TILLGÄNGLIGHET Kat. nr. Beskrivning BACTEC 12B Medium, 4 ml, 100 per kartong BACTEC PANTA Plus Kit, frystorkat antimikrobiellt supplement (PANTA), 5 flaskor; Reconstituting Fluid, 10 ml, 5 flaskor BACTEC NAP Differentiation Kit, 5 µg NAP per flaska, 10 flaskor per kartong BACTEC 460TB System Instrument BACTEC SIRE Drug Kit (100 tester) BACTEC Diluting Fluid (10 tester) Isoniazid, 1 flaska PZA Test Medium (5 tester) BACTEC PZA Drug/Reconstituting Fluid Kit (50 tester) REFERENSER 1. Middlebrook, G. et al. Automated radiometric detection of growth of Mycobacterium tuberculosis in selective media. Am. Rev. Respir. Dis. 115: , Bannister, E.R. et al. Comparison of detection, identification and drug susceptibility testing of mycobacteria by using the BACTEC radiometric method and conventional methods. Abstract C260, A.S.M. Annual Meeting, Las Vegas, Kent, P.T. et al. Public health mycobacteriology, a guide for the level III laboratory. Centers for Disease Control, Division of Laboratory Training and Consultation. Atlanta, GA, Roberts, G.D. et al. Evaluation of BACTEC radiometric method for recovery of mycobacteria and drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis from acid-fast smear-positive specimens. J. Clin. Microbiol. 18: ,

5 5. Fadda, G. et al. Recovery and susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis from extrapulmonary specimens by the BACTEC radiometric method. J. Clin. Microbiol. 19: , Morgan, M.A. et al. Comparison of a radiometric method (BACTEC) and conventional culture media for recovery of mycobacteria from smear-negative specimens. J. Clin. Microbiol. 18: , Takahashi, H. et al. Detection and recovery of mycobacteria by a radiometric procedure. J. Clin. Microbiol. 17: , National Committee for Clinical Laboratory Standards Approved Guideline M29-A2. Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections, 2nd ed. NCCLS, Wayne, PA. 9. Garner, J.S Hospital Infection Control Practices Advisory Committee, U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention. Guideline for isolation precautions in hospitals. Infect. Control Hospital Epidemiol. 17: U.S. Department of Health and Human Services Biosafety in microbiological and biomedical laboratories, HHS Publication (CDC) 4th ed. U.S. Government Printing Office, Washington, D.C. 11. Directive 2000/54/EC of the European Parliament and of the Council of 18 September 2000 on the protection of workers from risks related to exposure to biological agents at work (seventh individual directive within the meaning of Article 16(1) of Directive 89/391/EEC). Official Journal L262, 17/10/2000, p Kent, P.T. et al. Public health mycobacteriology: Centrifugal efficiency and digestant toxicity. Abstract U-2. A.S.M. Annual Meeting, St. Louis, MO, Libonati, J.P. et al. The role of solid media in the BACTEC system for mycobacterial isolation and identification. Abstract U-71. A.S.M. Meeting, Atlanta, GA, Kirihara, J. M. et al. Improved detection times of Mycobacterium avium complex and M. tuberculosis with the BACTEC radiometric system. J. Clin. Microbiol. 22: , Park, C.H. et al. Rapid recovery of mycobacteria from clinical specimens using automated radiometric technique. Am. J. Clin. Path. 81: , Siddiqi, S.H. et al. A new antimicrobial mixture (polymyxin B, amphotericin B, nalidixic acid, trimethoprim and azlocillin) for effective suppression of non-mycobacterial contamination during primary isolation of mycobacteria. Abstract U-35. A.S.M. Meeting, Washington, D.C., Siddiqi, S.H. Studies to further enhance mycobacterial growth in radiometric 7H12 Medium. Abstract U-46. A.S.M. Annual Meeting, Las Vegas, NV, National Committee for Clinical Laboratory Standards Approved Standard M22-A2, Quality assurance for commercially prepared microbiological culture media, 2nd ed., NCCLS, Wayne, PA. 19. Tortoli, E., P. Cinchero, C. Piersimoni, M.T. Simonetti, G. Gesu, and D. Nista Use of BACTEC MGIT 960 for recovery of mycobacteria for clinical specimens: multicenter study. J. Clin Microbiol. 37:

6 6

7 Becton, Dickinson and Company 7 Loveton Circle Sparks, Maryland USA BENEX Limited Bay K 1a/d, Shannon Industrial Estate Shannon, County Clare, Ireland Tel: Fax: ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection. BD, BD Logo, BACTEC, Luer-Lok, MGIT and PANTA are trademarks of Becton, Dickinson and Company BD.