Vården av patienter med astma

Partiklar i utandningsluft ny metod för att monitorera inflammation i de små luftvägarna SAMMANFATTNING Inflammation i de små luftvägarna förekommer vid alla typer av astma, även mildare former, och är mycket vanligare än man tidigare känt till. Inflammation i de små luftvägarna är också förenad med svårbehandlad astma och ökad förekomst av försämringstillstånd. Vi vet fortfarande inte hur vi skall förebygga att patienter med astma utvecklar en icke-reversibel luftvägsobstruktion ochkunskapen om sådan inflammation är mycket begränsad. På Arbets- och miljömedicin vid Göteborgs universitet har vi utvecklat en ny teknik som möjliggör analys av vätskeskiktets sammansättning i de små luftvägarna; insamling och analys av partiklar i utandningsluft (Particles in exhaled Air, PExA). Metoden bygger på insamling och analys av de partiklar (PEx) som bildas från detta vätskeskikt. Här redovisas result från våra explorativa studier. Resultaten tyder på att PExA metoden kan användas för att kartlegga förändringar i sammansättning av fosfolipider och av surfaktant protein A i de små luftvägarna vid olika luftvägssjukdomar, vilket man inte kunnat studera tidigare. På sikt hoppas vi att metoden kan bidra till en bättre karakterisering av olika typer av astma till en mer individualiserad behandling och nya behandlingsmöjligheter. ANNA-CARIN OLIN, Göteborgs universitet Vården av patienter med astma har förbättrats radikalt de senaste 30 åren, mycket tack vare effektivare behandling med inhalationssteroider. Men fortfarande är det en hel del patienter som har symptom och vi vet fortfarande inte hur vi skall förebygga att patienter med astma utvecklar en icke-reversibel luftvägsobstruktion. Resultaten från West Sweden Asthma Study, en randomiserad befolkningsstudie, visar att drygt 40 % av personer med astma har delvis okontrollerad- och ca 18 % har okontrollerad astma (1). Orsakerna är förstås många, men otillräcklig och felaktig behandling är förmodligen viktiga orsaker. Här skulle ett objektivt test för att mäta sorten och graden av luftvägsinflammation vara till stor nytta. Inflammation i de små luftvägarna förekommer vid alla typer av astma, även mildare former, och är mycket vanligare än man tidigare känt till (2). Inflammation i de små luftvägarna är också förenad med svårbehandlad astma och ökad förekomst av försämringstillstånd (3). Vid olika exponeringar, både i arbetsliv och i yttre miljö, drabbas ofta också just de små luftvägarna (4). Men kunskapen om inflammation i de små luftvägarna är mycket begränsad; man vet mycket lite om hur luftvägsinflammation varierar över tid, vilka faktorer som leder till att inflammationen läker ut eller förvärras, eller dess betydelse för prognos och effekt av behandling. Att epitelet och det vätskeskikt som täcker epitelet har viktiga funktioner för att skydda oss mot inandat material och patogener står dock helt klart (5). Partiklar i utandningsluft På Arbets- och miljömedicin vid Sahlgrenska akademin i Göteborg har vi utvecklat en ny teknik som möjliggör analys av vätskeskiktets sammansättning i de små luftvägarna; insamling och analys av partiklar i utandningsluft (Particles in exhaled Air, PExA). Metoden bygger på att vi samlar in och analyserar de partiklar Anna-Carin Olin, adjungerad professor och forskargruppledare.vid Arbets- och Miljömedicin, Sahlgrenska Akademin, Göteborgs universitet kontaktadress: Anna-Carin Olin Arbets- och miljömedicin Sahlgrenska Akademin Göteborgs universitet Box 414 SE-405 30 Göteborg anna-carin.olin@amm.gu.se FIGUR 1. Lungblåsa med surfaktant 34 ALLERGI I PRAKXSIS 4/2014

På Arbets- och miljömedicin vid Sahlgrenska akademin har det utvecklats en ny teknik som möjliggör analys av vätskeskiktets sammansättning i de små luftvägarna med hjälp av insamling av partiklar i utandningsluft (Particles in exhaled Air, PExA). Metoden kan bidra till en bättre karakterisering av olika typer av astma och till en mer individualiserad behandling. FOTO. COLORUBOX.COM (PEx) som bildas från detta vätskeskikt. När de allra minsta luftvägarna stänger sig och sedan öppnar sig igen, vid in- respektive utandning, så spricker detta vätskeskikt upp och små partiklar (vätskedroppar) bildas. Vi har visat att dessa partiklar framförallt innehåller surfaktant som bildas i alveolerna (SE FIGUR 1), och dess viktigaste uppgifter är att minska ytspänningen och hålla luftvägarna öppna men också att oskadliggöra inandat material. Det sker ett kontinuerligt utbyte av material från epitelcellslagret i luftvägarna till detta vätskeskikt och vid inflammation i de små luftvägarna förändras dess kemiska sammansättning. Analys av partikelinnehållet kan därför bidra till att öka kunskapen om och bättre karakterisera inflammation i de små luftvägarna. På sikt hoppas vi förstås att metoden kan användas för att bättre belysa vilken typ av inflammation som föreligger och hjälpa till att optimera behandling och monitorering av astma. Surfaktant Surfaktant är första linjens försvar mot allt inandat material och patogener (6) och innehåller bl a lungspecifika proteiner som har stor betydelse för immunförsvaret, bl a för antigenpresentation, fagocytos och reglering av lymfocytaktivering (7, 8). Dessa utgör en länk mellan det ospecifika och humorala immunförsvaret. Surfaktant-protein A (SP-A) är det vanligaste lungspecifika proteinet (SE FIGUR 2 PÅ SIDAN 36), och har fram tills nu främst studerats i bronkoalveolärt lavage (BAL). SP-A halterna har visats sjunka vid många typer av sjukdomar i luftvägarna (9). Detta kan vara av stor betydelse då lägre halter av Sp-A är förenat med sämre försvar mot både virus- (10) och bakteriella infektioner. Genetiska studier indikerar också Sp-A s betydelse. Det finns två funktionella gener för Sp-A; Sp-A1 och Sp-A2 och de olika varianterna har troligen olika funktion (11). Pettigrew et al har påvisat en tre gånger ökad risk för «persistent wheeze», dvs bestående pip i bröstet, hos 220 barn med en polymorfi av Sp-A1 genen (12). I en fall-kontroll studie har man funnit en Sp-A1 allell som associeras med 7.4 ggr högre risk för KOL (13). Vad innehåller de partiklar vi samlar in i utandningsluften? Med PExA metoden samlar vi in oerhört små mängder material, ca 120 ng, det är 0,000 000 120 gram, och det behövs därför oerhört känsliga analyser. I de första studierna av partiklarna använde vi en mycket känslig metod för ytanalys, «Time-of-flight secondary ion mass spectrometry (TOF-SIMS)», där provet inte behöver bearbetas före analys. Resultaten visade att partiklarna framför allt består av fosfolipider (ca 80 %), dvs fetter som är huvudbeståndsdelen i surfaktant men också bygger upp alla cellmembran i kroppen. Den vanligaste fosfolipiden ALLERGI I PRAKXSIS 4/2014 35

SP-A molekyl Bakterier och virus Alveol FIGUR 2. Surfakant protein A; struktur och funktion (Anpassad efter Palaniyar, N (2001). Comparative Biochemistry and Physiology and Molecular and Integrative Physiology) Globulära domäner Flexibla regioner SP-A binder till bakterier och virus & inhiberar tillväxt Knick SP-A fungerar som opsonin: ökar fagoctosen SP-A förhindrar utmognaden av dendritiska celler och bildningen av inflammatoriska mediatorer är dipalmityolfosfatidylcholin (DPPC), men vi hittade också fosfatidylglycerol, som hos människa endast påträffas just i surfaktant (14). Ungefär 20 % av partiklarna består av proteiner. Vi har genomfört en explorerande proteomikstudie för att kartlägga proteininnehållet i PEx hos friska (15). PEx från 100 liter utandningsluft innehåller ca 150 ng material varav ca 33 ng är protein. Vi identifierade 124 olika proteiner varav majoriteten var extracellulära. En relativ fördelning av de identifierade proteinerna framgår av figur 3. 80 % av dessa proteiner har tidigare påvisats i bronko-alveolärt lavage. Det är intressant att så mycket som 29 % av proteinerna utgörs av immunoglobuliner. Det vanligaste lungspecifika proteinet är Surfaktant Protein A (SP-A). FIGUR 3. Relativ proteinfördelning i PEx. Surfaktant protein A i PEx Vi har anpassat och validerat en ELISA metod för analys av SP-A i PEx och visat en mycket god detekterbarhet och låg inom-individuell variation (16). Vid två mättillfällen inom en vecka varierade SP-A halterna inom samma individ med <13 %. Koncentrationen av SP-A var starkt korrelerad till antalet utandade partiklar. Även totalmängden utandade partiklar skiljde sig mycket mellan individer. Preliminära data från våra första studier visar att den relativa koncentrationen av SP-A i PEx sjunker vid svårare former av astma och sänkta halter är också förenade med mer avstängda luftvägar. Däremot tycks inte SP-A halterna påverkas vid mild astma, ej heller under pollensäsong hos personer med pollenastma. SpA (11.6%) SpB (0.6%) SpC (0.2%) CC16 (3.5%) Albumin (25%) Transferrin (3.8%) Alpha-1-antitrypsin (1.8%) Immunglobulins (29%) Others (24.5%) Fosfolipider i PEx För att undersöka om sammansättningen av fosfolipiderna i PEx förändras vid astma har vi i en pilotstudie undersökt 15 rökfria personer med astma (enl GINA) och 11 friska kontrollpersoner (17). Patienter med astma andades ut betydligt färre antal partiklar än kontrollerna (p = 0,03), vilket kan tyda på mer avstängda luftvägar. Vi analyserade PEx-proverna med den tidigare nämnda «Time-of-flight secondary ion mass spectrometry (TOF-SIMS)» metoden. Eftersom vi inte visste vilka förändringar vi kunde förvänta oss och dessutom fick oerhört stora datamängder använde vi oss av multivariat statistisk analys och diskriminant-analys för att identifiera de största skillnaderna i massspektra mellan personer med astma och friska kontroller. Personerna med astma hade högre halter av dipalmityolfosfatidylcholine (DPPC) och fosfatidylglycerol. Molekylära joner av fosfolipider var också vanligare i alla prover från patienter med astma jämfört med friska, se figur 4. Förhållandet mellan omättade och mättade fosfolipider var signifikant lägre i prover från patienter med astma (0,25 vs. 0,35, p = 0,036). Detta var en liten explorativ studie, men den tyder trots allt på att PExA metoden kan användas för att undersöka förändringar av fosfolipidsam- 36 ALLERGI I PRAKXSIS 4/2014

0,025 0,020 0,015 m/z 650.4 PC fragment m/z 706.6 PC 30:0+H 734.6 PC 32:0+H m/z 756.6 PC 32:0+Na m/z 772.6 PC 32:0+K 0,010 0,005 Astma 0,000-0,005-0,010 610 620 630 640 650 660 670 680 690 700 710 720 730 Friska 740 750 760 770 780 790 800 810 820 830 m/z FIGUR 4. Mass-spektra sorterade för att identifiera de viktigaste skillnaderna mellan friska och personer med astma. Ämnen (egentligen den specifika massan) med peak uppåt är vanligare hos personer med astma, ämnen med peak neråt vanligare hos friska. mansättning i de små luftvägarna vid olika luftvägssjukdomar, vilket man inte kunnat studera tidigare. Hur bildas partiklarna och vad speglar antalet partiklar? Huvudparten av de utandade partiklarna bildas vid luftvägsöppning, dvs. då avstängda luftvägar öppnar sig (18), och andelen partiklar som bildas verkar vara ett mycket känsligt mått på just luftvägsöppning. Variationen i mängden utandade partiklar mellan olika individer, även friska, är dock stor. Hos friska bildas alltså partiklarna i de allra minsta luftvägarna, men man vet mycket lite om luftvägsstängning och var den sker vid astma, förmodligen kan luftvägstängningen då också ske lite mer proximalt. Vi har sett att astmatiker bildar färre partiklar under pollensäsong än utanför säsong, trots att det inte fanns någon skillnad i spirometri. Vi tolkar detta som att fler små luftvägar är avstängda under pollensäsong, men att detta inte reflekteras av spirometriundersökning. I en pilotstudie på astmatiker har vi också sett att antalet partiklar som bildas minskar vid ojämn gasdistribution, speciellt vid obstruktion av de allra minsta s.k. acinära luftvägarna. Slutsatser PexA-metoden ger en unik möjlighet att samla in outspätt material från de allra minsta luftvägarna och har därför stor potential för att öka kunskapen om luftvägsinflammation speciellt i de små luftvägarna. Innehållet i de utandade partiklarna överensstämmer i stort med surfaktant, och vi har visat att sammansättningen av fosfolipider i PEx förändras vid astma. På sikt hoppas vi att metoden kan bidra till en bättre karakterisering av olika typer av astma och kan bidra till en mer individualiserad behandling och förhoppningsvis även nya behandlingsmöjligheter. Vi hoppas också genom förenklad insamlingsmetod och utveckling av sensormetodik, möjliggöra enkel tillämpning av metoden i kliniska och epidemiologiska sammanhang. REFERENSER 1. Mincheva, R., et al., Frequent cough in unsatisfactory controlled asthma results from the population-based West Sweden Asthma study. Respir Res, 2014. 15: p. 79. 2. Usmani, O.S., Small airways dysfunction in asthma: evaluation and management to improve asthma control. Allergy Asthma Immunol Res, 2014. 6(5): p. 376 88. 3. van den Berge, M., et al., Treatment of the bronchial tree from beginning to end: targeting small airway inflammation in asthma. Allergy, 2013. 68(1): p. 16-26. 4. de Jong, K., et al., Occupational exposure to vapors, gases, dusts, and fumes is associated with small airways obstruction. Am J Respir Crit Care Med, 2014. 189(4): p. 487 90. 5. Holgate, S.T., The airway epithelium is central to the pathogenesis of asthma. Allergology international : official journal of the Japanese Society of Allergology, 2008. 57(1): p. 1 10. 6. Griese, M., Pulmonary surfactant in health and human lung diseases: state of the art. Eur Respir J, 1999. 13(6): p. 1455 76. 7. Hohlfeld, J.M., V.J. Erpenbeck, and N. Krug, Surfactant proteins SP-A and SP-D as modulators of the allergic inflammation in asthma. Pathobiology : journal of immunopathology, molecular and cellular biology, 2002. 70(5): p. 287 92. 8. Enhorning, G., Surfactant in airway disease. Chest, 2008. 133(4): p. 975-80. 9. Poynter, S.E. and A.M. LeVine, Surfactant biology and clinical application. Crit Care Clin, 2003. 19(3): p. 459 72. 10. Barreira, E.R., A.R. Precioso, and A. Bousso, Pulmonary surfactant in respiratory syncytial virus bronchiolitis: The role in pathogenesis and clinical implications. Pediatric pulmonology, 2010. 11. Huang, W., et al., Human SP-A genetic variants and bleomycin-induced cytokine production by THP-1 cells: effect of ozoneinduced SP-A oxidation. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2004. 286(3): p. L546 53. 12. Pettigrew, M.M., et al., Respiratory symptoms among infants at risk for asthma: association with surfactant protein A haplotypes. BMC medical genetics, 2007. 8: p. 15. 13. Guo, X., et al., Surfactant protein gene A, B, and D marker alleles in chronic obstructive pulmonary disease of a Mexican population. The European respiratory journal: official journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology, 2001. 18(3): p. 482 90. 14. Almstrand, A.C., et al., Airway monitoring by collection and mass spectrometric analysis of exhaled particles. Anal Chem, 2009. 81(2): p. 662 8. 15. Bredberg, A., et al., Exhaled endogenous particles contain lung proteins. Clinical chemistry, 2012. 58(2): p. 431 40. 16. Larsson, P., et al., Surfactant protein A and albumin in particles in exhaled air. Respiratory medicine, 2012. 106(2): p. 197 204. 17. Almstrand, A.C., et al., TOF-SIMS analysis of exhaled particles from patients with asthma and healthy controls. European Respiratory Journal 2011. In Press. 18. Almstrand, A.C., et al., Effect of airway opening on production of exhaled particles. Journal of applied physiology, 2010. 108(3): p. 584 8. ALLERGI I PRAKXSIS 4/2014 37

Mätning av kväveoxid (NO) i utandningsluften som mått på luftvägsinflammation SAMMANFATTNING Exhalert NO (FeNO) används som komplettering till andra metoder vid diagnostik och bedömning av astma. Man rekommenderar också att FeNO används som instrument för att monitorera astmaaktiviteten, framförallt i situationer där patienter är okontrollerade trots insatt inhalationssteroidbehandling (ICS). Mängd eosinofiler i blod har visat sig vara en värdefull markör på eosinofil inflammation, och studier har visat stark association mellan mängd eosinofiler i sputum och koncentration av NO i utandad luft. Mätning av FeNO skulle sålunda kunna vara ett alternativ till inducerat sputum för att estimera typ av och grad av underliggande inflammation vid astma. FeNO återspeglar i huvudsak en TH2-driven inflammation, oftast kopplad till aktivering och rekrytering av eosinofila granulocyter till vävnaden. Det flesta med allergisk astma eller med underliggande atopi har en TH2-driven inflammation. Denna del av den astmatiska inflammationen svarar som regel bra på inhalerade steroider. Hos patienter med kvarvarande symptom kan ett förhöjt FeNO indikera underbehandling, bristande miljökontroll och bristande följsamhet. Lika viktigt är det att undvika överbehandling och att styra ICS-behandlingen dit den har effekt. Leif Bjermer Professor, Överläkare Lung- och Allergikliniken Skånes Universitetssjukhus, Lund kontaktadresse: Leif Bjermer Lung-och Allergikliniken Skånes Universitetssjukhus SE-22185 Lund leif.bjermer@med.lu.se LEIF BJERMER, Skånes universitetssjukhus, Lund Astma definieras som en nedre luftvägsinflammation associerad till ett tillstånd av ökad känslighet i luftvägarna med variabel lungfunktion. Denna variabla lungfunktion karakteriseras av bronkospasm som leder till luftvägsobstruktion som kan uppkomma spontant eller efter provokation. Det kliniska uttrycket är attacker av dyspné eller hosta, med eller utan pipande andning. De flesta som hanterar astma i sin dagliga praxis är idag eniga om värdet av att kunna mäta lungfunktion både för att fastställa nivå och för att verifiera eventuell reversibilitet. Traditionellt baserar vi också vår bedömning på symptom samt lungfunktion. Betydligt färre är det som regelbundet försöker estimera typ av och grad av underliggande inflammation, trots att det är denna som driver både sjukdomens aktivitet och karaktär. Inducerat sputum, gärna i kombination med mätning av mängd eosinofiler i blod har i forskningssammanhang visat sig vara en värdefull markör på eosinofil inflammation. I en studie av Green styrdes behandlingen av grad av eosinofilökning i sputum där > 3 % indikerade behov av ökad steroidbehandling och där < 1 % tillät sänkning av dosen. I en parallell grupp styrdes behandlingen av patienternas rapporterade symptom samt lungfunktion. I gruppen som styrdes utifrån sputumeosinofiler kunde man inte bara reducera steroidbehandlingen hos flertalet patienter. Man minskade också risken för exacerbation med 68 % (1). På motsvarande sätt har eosinofiler i blod visat sig vara värdefulla som biomarkör för eosinofil inflammation hos patienter med svår astma. I en nyligen avslutad studie med användandet av mepolizumab, (anti-il5), fann man en signifikant behandlingseffekt enbart i gruppen med blodeosinofiler mer än 150 celler/µl, och det förefaller som att högre nivåer stärker utsikten till positiv behandlingsrespons (2). Nackdelen med inducerat sputum är att det är en tids- och resurskrävande process. Dessutom får man inte fram representativa prover hos mer än c:a 8 av 10 patienter. Blodeosinofilbestämning är enklare att ta. Nackdelen är att svaret oftast inte erhålls direkt när patienten är på mottagningen samt att provet återspeglar en systemisk inflammation som inte alltid behöver reflektera vad som sker i luftvägarna. Utandat kväveoxid (FeNO) Exhalerat NO (FeNO) skulle kunna vara ett alternativ till inducerat sputum och studier har visat på en stark association mellan mängd eosinofiler i sputum och koncentration av NO i utandad luft (3). Nyare data talar för att association mellan FeNO och eosinofili är indirekt och inte direkt relaterad till den eosinofila granulocyten. I en studie med anti-il5 (mepolizumab) ser man en uttalad effekt med sjunkande eosinofiler i blod och sputum medan FeNO-nivåerna förblir oförändrat höga (2). Motsvarande ser man i en annan studie med anti IL-13 behandling (Lebrikizumab), att FENO sjunker drastiskt medan antalet eosinofiler i 38 ALLERGI I PRAKXSIS 4/2014