Laboration hemostas Termin 3, läkarprogrammet Syfte Patienter med ökad benägenhet för blödning kan vara drabbade av olika former av hemofili, och vid behandlingskontroll vid antikoagulantia används två typer av rutinmässiga metoder 1) Aktiverad partiell tromboplastintid (APTT) som mäter faktorer i den interna vägen, XII, XI, X, IX, VIII, V, protrombin och fibrinogen (ej VII och XIII). 2) Protrombinkomplex (PK) används främst för att justera behandling med vitamin K-antagonister. PK mäter faktorerna II, VII, X Syftet med denna laboration är att praktiskt lära sig samt att förstå screeninganalyserna som används för rutinmässig undersökning av hemostasen. Mål Kunskap och förståelse få kunskap om olika mätmetoder och deras uppbyggnad för mätning av koagulation. få förståelse för begränsningar hos mätmetoder och inverkan av störningar för att undvika mätfel. Färdighet och förmåga kunna välja lämplig mätmetod i en given mätuppgift samt utföra mätningar. ha fått erfarenhet av experimentellt arbete för patientnära analyser. kunna kommunicera resultat från det laborativa experimentet. Värderingsförmåga och förhållningssätt ha förståelse för hur man kan göra enkla kliniska kopplingar.
Innehåll Praktiskt handhavande vid mätning av PK, APTT och beräkning av INR Översikt diagnostiska metoder Bilder hemostas
APTT Allt skall förvärmas i vattenbad och hållas varmt under hela laborationen! 1. Börja med att pytsa följande i separata plaströr och ställ i vattenbadet (märk rören!): 1 rör med 500 µl CaCl 2 1 rör med 500 µl APTT reagens 2 rör med 100 µl NKP Normal plasma i varje 2 rör med 100 µl OKP Onormal plasma i varje OBS! Tillsätt till ett prov i taget så att exakta tider mäts! 2. Tillsätt 100 µl APTT-reagens till NKP prov 1, starta klockan direkt vid tillsats av APTT-reagens. Vänta i 5 minuter. 3. Efter exakt 5 minuter tillsätt 100 µl CaCl 2 till NKP prov 1, sätt på en kork, starta klockan och vagga provet i vattenbadet enligt demonstration. När ni ser ett koagel stannar ni klockan och antecknar tiden i sekunder. Upprepa nu med de andra rören (NKP prov 2, OKP prov 1, OKP prov 2). För att få ut APT-tid så beräknar ni medelvärdet av era dubbelprover. APTT CaCl 2 NKP OKP Jämföres Normalt referensintervall APTT: 30-42s
PK-INR Allt skall förvärmas i vattenbad och hållas varmt under hela laborationen! 1. Börja med att pytsa nedanstående! Späd 50 µl NKP med 300 µl Owrens buffert (1:7) i ett plaströr Späd 50 µl OKP med 300 µl Owrens buffert (1:7) i ett plaströr För över 200 µl Owrens reagens (Owrens PT) i 4 st rör (4 x 200 µl) Ställ alla rören i vattenbadet i 5 min 2. Tag 100 µl utspädd NKP till ett rör med Owrens PT-reagens, sätt på korken och starta klockan. Börja vagga provet i vattenbadet enligt instruktion. Stanna klockan när koagel bildats. Anteckna tiden i sekunder. Upprepa samma sak en gång till så att ni får dubbelprov. 3. Tag 100 µl utspädd OKP till ett rör med Owrens PT-reagens, sätt på korken och starta klockan. Börja vagga provet i vattenbadet enligt instruktion. Stanna klockan när koagel bildats. Anteckna tiden i sekunder. Upprepa samma sak en gång till så att ni får dubbelprov. Räkna ut PK-INR för OKP-provet enligt formeln. ISI för det använda reagenset sätts till 1,0. Tänk på att Clot Time skall vara i sekunder. Owrens reagens: TP och bristplasma (- II, VII, X, IX) + CaCl 2 Owrens buffert Owr Reagens NKP OKP Spädningsbuffert (1:7) Jämföres Normalt referensintervall PK-INR: 0.8-1.2
Mätning av PK, APTT och beräkning av INR ADEKVAT HEMOSTAS För detta krävs koagulationsfaktorer och funktionella trombocyter Normalt APTT PK-INR < 1.6 Normalt Fibrinogen > 1 g/l Trombocyter > 50 x 10 9 /l Vid inadekvat hemostas bildas ett luckert, instabilt och lätt lyserbart koagel. ÖVERSIKT DIAGNOSTISKA METODER För att undersöka koagulationen används olika screeningmetoder (APTT och PK-INR) där olika steg i koagulationen studeras, vilka vidare kan kompletteras med analys av enskilda koagulationsfaktorer. LABORATORIEANALYSER Trombocyter (TPK) Allmänt Trombocyterna bildas från megakaryocyter i benmärgen Medellivslängd 5-10 dygn i cirkulationen, vilket innebär att ca 20 % nya trombocyter tillkommer dagligen. Trombocyterna är nödvändiga för normal hemostas. Normalvärde kvinnor 165-387 x 10 9 /l män 145-348 x 10 9 /l. Provtagning: EDTA rör. Trombocytopeni Trombocytantal <120 x 10 9 /l Blödningsbenägenheten från speciellt slemhinnor och stick ökar successivt när trombocytantalet sjunker under 80 x 10 9 /l. Vid trombocytantal <20 x 10 9 /l ökar risken för spontana blödningar (inklusive hjärnblödning). Trombocytdysfunktion Vanligast är patienter med lätt ökad blödningsbenägenhet trots normalt trombocytantal. Detta beror på ärftliga mindre väldefinierade milda trombocytfunktionsdefekter. Trombocytos Trombocytantal >500 x 10 9 /l Reaktiv trombocytos uppträder efter blödning (inklusive efter förlossning), i samband med infektioner och cancer. Trombocytantalet kan stiga till >800 x 10 9 /l vid vissa sjukdomstillstånd (t.ex. essentiell trombocytemi) kan vara trombocytantalet vara mycket högt (>1000) och dessa patienter kan vara lättblödande (trots högt trombocytantal) samtidigt som de är trombosbenägna.
APTT Allmänt Normalvärde 30-42 sek. Koagulationstidsmätning i plasma med reagens som innehåller fosfolipid och koagulationsaktivator t. ex. kiselpartiklar. APT tiden mäter den samlade aktiviteten av faktor II, V, VIII, IX, X, XI, XII och fibrinogen. Provtagning: citratrör. Rubbningar Förlängd APTT >42 sek: APTT förlängs vid brist på en eller flera ovanstående koagulationsfaktorer och när koagulationen hämmas av läkemedel t. ex. heparin (till viss del även lågmolekylära hepariner) och Waran. Vid PK- INR>2.0 pga. Waranbehandling är APTT oftast >42 sek. APTT förlängs också om det finns antikroppar mot fosfolipidbindande proteiner i patientens plasma (lupus antikoagulans) vilket kan vara förenat med ökad trombosrisk. Förlängd APTT bör utredas innan elektiv operation för att utesluta hemofili eller andra koagulationsfaktorbrister, vilka kan medföra blödningsproblem. För kort APTT <30 sek: Korta APT tider ses vid förhöjda nivåer av faktor VIII och/eller fibrinogen (graviditet, inflammation, infektion mm.) och föranleder ingen åtgärd. PK-INR Allmänt Normalvärde <1.2 Koagulationstidsmätning med reagens som innehåller aktivator (tromboplastin) och bovin bristplasma, vilket gör att koagulationstiden blir beroende av den samlade aktiviteten av koagulationsfaktor II, VII, och X (os, ej IX) Sänkt aktivitet/brist höjer PK-INR. Provtagning: citratrör. Rubbningar Höga PK-INR Heriditär brist på faktor II, VII eller X. Av dessa är heterozygot faktor VII-brist vanligast. PK-INR är då vanligen lätt-måttligt förhöjt. PK-INR: - stiger vid nedsatt leverfunktion då produktionen av faktor II, VII och X sjunker. - stiger snabbt i samband med sepsis pga konsumtion av koagulationsfaktor VII. - används för kontroll av Waranbehandling och bör vara högst 1.5 vid kirurgi (1.2 vid neurokirurgi). - kan stiga i samband med vård av patienter som fastar eller ges antibiotika, som slår ut tarmfloran (t. ex. i samband med bukåkommor). PK-INR normaliseras i dessa fall snabbt med K-vitamin. Låga PK-INR < 0.9 är normalt vid graviditet och kan ses vid östrogenbehandling samt inflammatoriska tillstånd.
FIBRINOGEN Allmänt Normalvärde 2-4 g/l. Provtagning rekommenderas vid allvarliga blödningstillstånd och oklar APT-tidsförlängning. Observera att APTT kan i vissa fall vara normalt eller vid övre normalgräns trots fibrinogen < 1g/l. Provtagning: citratrör. Rubbningar Låga fibrinogennivåer < 1 g/l: Ärftlig brist är mycket ovanlig Förvärvad brist ses bl. a. vid stor blodförlust och undertransfusion med plasma, och vid kraftig fibrinolys. Höga fibrinogennivåer > 5 g/l: Postoperativt, vid infektioner/inflammatoriska tillstånd och i samband med graviditet är det normalt med höga fibrinogennivåer. D-DIMER Allmänt Normalvärde < 0.5 ng/l Immunologiskt test som påvisar D-dimer strukturen, vilken uppstår vid nedbrytning av korsbundet fibrin i samband med fibrinolys. Provtagning: citratrör. Rubbningar Förhöjd D-dimernivå. Venös trombossjukdom (VTE), infektioner, innflammatoriska tillstånd, aortaanerurysm, cancer, graviditet. ANTITROMBIN Allmänt Normalvärde0.8-1.2 kie/l (80-120% enligt tidigare svarsrutin). Barn har samma normalvärden som vuxna från ca 6 månaders ålder. Provtagning: citratrör. Rubbningar Sänkt antitrombinnivå < 0.7 kie/l Heriditärbrist Endast heterozygot brist har påvisats. Antitrombinnivån kan variera mellan 0.4-0.7 kie/l hos olika patienter. Patienter med känd hereditär brist skall alltid handläggas i samråd med koagulationsspecialist. Förvärvad brist: Ses bland annat vid graviditetskomplikationer och sepsis. Lätt sänkt antitrombinnivå kan ses i samband med heparininfusion under de första dygnen.