Rapport nr 4967 1998-12-18 Bacillus cereus och andra Bacillus som toxinbildare - en uppdatering Anders Christiansson Svensk Mjölk Forskning Telefon 0771-191900. E-post fornamn.efternamn@svenskmjolk.se
Bacillus cereus och andra Bacillus som toxinbildare - en uppdatering Anders Christiansson, Svensk Mjölk FoU, Lund Enterotoxiner hos Bacillus cereus. Sedan länge har det varit känt att B. cereus kan producera två olika sorters enterotoxiner, nämligen en typ som orsakar kräkningar och har snabb inverkning (inom 1-5 timmar; emetiskt toxin) och en annan som orsakar diarré och har en längre inkubationstid (8-12 timmar; diarrétoxin). Trots att båda typerna av toxiner har varit kända i mer än 25 år så har det varit mycket svårt att rena fram och beskriva deras egenskaper. Uppgifterna i litteraturen har varit motsägande och svårförklarade. En förklaring till detta börjar nu komma fram: Det finns förmodligen tre och kanske fyra olika diarré-toxiner! Det emetiska toxinet har mest varit förknippat med varmhållet ris, men kan också bildas i mjölk. Sjukdomsfall orsakad av detta toxin finns beskrivet för UHT-mjölk i Japan (troligtvis tekniskt fel i tillverkningen av mjölken). Det har inte funnits några enkla tester för att påvisa detta toxin. Odling av s.k. HEp-2-celler och undersökning av celltoxisk effekt på dessa har varit det enda testet förutom matning av apor. Nyligen bestämdes strukturen på det emetiska toxinet. Det är en liten ringsluten peptid bestående av 12 aminosyror (4 st upprepade 3 gångar), och påminner om valinomycin som är en jonofor som kortsluter spänningen över cellmembraner. På grund av sin struktur förstörs den inte ens vid autoklavering. En finsk forskargrupp har nyligen visat att toxinet minskar rörligheten hos grisspermier, vilket är grunden till en mycket enkel påvisningsmetod. Detta toxin är mycket giftigt och har varit orsak till ett dödsfall hos en 17-årig pojke som ätit rester av pasta som förvarats för varmt. Pojken dog på grund av leverkollaps orsakat av toxinet, som kunde isoleras både från maten och från pojkens lever. Det är intressant att ett liknande toxin också kunnat påvisas i vissa stammar av Bacillus licheniformis bl.a. från en bröstmjölksersättningsprodukt som orsakat en dödlig matförgiftning hos en finsk baby. B. lichenformis är mycket vanlig mjölk och i det aktuella fallet kunde 1000-10000 cfu/g påvisas i mjölkpulvret. Efter rekonstituering kunde toxin påvisas efter 8 timmar i rumstemperatur. Bacillus licheniformis kan växa vid 55 C och skulle därför kunna tillväxa i indunstare i samband med pulvertillverkning. En toxinbildande stam kunde också påvisas hos en ko som tidigare haft mastit och som utsöndrade stammen flera månader efter att hon tillfrisknat. Enligt uppgifter från Finland är ungefär en B. licheniformis-stam av 10 toxinbildare. Toxinbildning har också påvisats för ett antal isolat från England som isolerats vid matförgiftningsfall. B. lichenformis, B. subtilis och B. pumilis har påträffats i vissa matförgiftningsfall, främst i England, som enda organism i höga halter. Detta är första gången man kunnat beskriva toxinbildning. Mejeriprodukter har inte tidigare varit involverade. Bland diarré-toxinerna har två olika multikomponent-toxiner renats, beskrivits och även DNA-sekvensbestämts. Det ena toxinet är hemolytiskt (hemolysin BL, HBL) och består av tre proteiner som alla behövs för att ge effekt. Det andra är icke-hemolytiskt (NHE) och består också av tre komponenter. Både toxinerna kan ibland förekomma i samma B. cereus-stam och båda är viktiga för uppkomsten av diarré. Molekylvikterna för de olika komponenterna är mycket lika vilket har gjort det svårt att skilja mellan de två toxinerna. HBL kan detekteras med Oxoids latex-agglutinationskit BC-RPLA, som påvisar en komponent av denna, medan NHE kan påvisas med Tecras ELISA-kit, som upptäcker ett protein från NHE. Dessutom är
ett tredje toxin, enterotoxin T beskrivet och sekvensbestämt. Detta består av ett enda protein. Ytterligare ett fjärde enterotoxin FM finns beskrivet. Det är dock oklart i hur hög grad att de två sistnämnda har orsakat matförgiftningar. När DNA-sekvenserna blivit kända hos de olika toxinerna har det varit möjligt att ta fram PCR-metoder för att påvisa genernas förekomst i olika B. cereus-stammar. En holländsk undersökning av B. cereus-isolat från mjölkförpackningar i handeln visade att 27 av 37 stammar var cytotoxiska (dvs var toxinbildare). 28 stammar hade genen för B-komponenten i HBL, medan 24 hade genen för enterotoxin T. Bland isolaten var andelen kraftiga toxinbildare betydligt större bland sådana stammar som var laktospositiva, vilket är en relativt ovanlig egenskap hos B. cereus. I en annan undersökning där många mejeri-isolat ingick var 74% av 321 isolat positiva för enterotoxin enligt celltoxicitetstest. Därav var 53% positiva för B- komponenten. 40% av 95 testade stammar hade enterotoxin T-genen. Inga undersökningar finns gjorda med avseende på NHE, men man kan anta, med ledning av resultat med Tecrakitet, att många stammar har denna gen. En stam kan innehålla flera olika toxingener. Enterotoxin hos Bacillus thuringensis Bacillus thuringiensis är en mycket nära släkting till B. cereus. Den producerar intracellulära proteinkristaller som är toxiska för insektslarver när toxinet hamnar i tarmen. Man har under lång tid använt flygbesprutning med B. thuringiensis som ett sätt att biologiskt bekämpa skadeinsekter på gröda. Enterotoxin FM-genen har nyligen påvisats även hos B. thuringiensis och det finns några rapporter där man hittat B. thuringiensis i samband med matförgiftningar. En del stammar har också visats kunna producera HBL. Detta har man inte tidigare uppmärksammat, eftersom B. thuringiensis inte kan särskiljas från B. cereus annat än genom att påvisa proteinkristallen. Höga halter av B. thuringiensis kan påträffas på flygbesprutade grönsaker och dessa kan eventuellt utgöra en risk för matförgiftning. Varför blir man inte sjuk av mjölk? Man kan undra varför matförgiftningar i samband med mjölk är sällsynta, med tanke på vanligheten hos B. cereus i mjölk. En orsak är säkert att mjölk och grädde ofta har sötkoagulerat innan antalet bakterier är så högt så att toxin hunnit bildas. Det har emellertid hävdats att toxin som bildas i livsmedel har mindre betydelse, eftersom toxinerna bryts ned snabbt av proteaser i tarmkanalen och genom ph-inaktivering i magsäcken. Detta är dock inte undersökt för alla de fyra toxinerna. En teori hävdar att toxinbildningen sker i tarmen, efter det att B. cereus hamnat där i samband med livsmedelskonsumtion. Halten B. cereus i livsmedlet har då sannolikt stor betydelse eftersom bakterierna måste överleva passagen genom magsäcken, med dess låga ph. Den infektiva dosen som krävs tycks vara relativt stor, ofta mellan 1 och 100 miljoner B. cereus. Man kan också tänka sig att vissa stammar skulle kunna ha förmåga att fästa på tarmslemhinnan och tillväxa där, vilket skulle göra dem mera potenta som toxinbildare. En annan faktor är säkert att toxinbildningsförmågan mätt med celltoxicitetstest varierar kraftigt mellan olika stammar. Kända matförgiftningsstammar har ofta mycket kraftig toxinbildning. Vad gäller mjölk kan det också vara så att sådana stammar är sällsynta och eventuellt endast tillväxer i enskilda mjölkpaket. Undersökningar med RAPD-PCR hos
Svensk Mjölk FoU har visat att i det enskilda mjölkpaketet kommer oftast en enstaka stam att dominera, även om variationen av stammar i silomjölken är stor. Under sådana förhållanden blir det mycket svårt att upptäcka B. cereus-matförgiftningar eftersom de potentaste stammarna kan uppträda sporadiskt och eventuella matförgiftningar förbli oupptäckta. Livsmedelsinfektioner av B. cereus är oftast relativt lindriga och symptomen försvinner vanligen inom 24 timmar. I Holland har man gjort försök på NIZO, där man låtit frivilliga personer dricka mjölk med olika halter av B. cereus, dvs från mjölkpaket som kylförvarats olika lång tid. Endast vid konsumtion av totalt 100 miljoner cfu B. cereus uppträdde symptom, men ej regelbundet. Man har också låtit göra en kvantitativ riskanalys för konsumtion av mjölk med B. cereus. Därvid har man bl.a. mätt temperaturen i konsumenters kylskåp, analyserat B. cereus-halten i mjölken och frågat hur gammal mjölken blir innan den konsumeras. En av slutsatserna blev att 7% av den holländska mjölken konsumeras när den innehåller mer än 100000 B. cereus/ml och 4% när den innehåller mer än 1 miljon B. cereus/ml. Man kunde dock inte bedöma konsekvenserna av detta eftersom de faktorer ger upphov till sjukdom inte är tillräckligt väl kända. Bacillus cereus i bröstmjölksersättnings-pulver. Små barn är en av de konsumentgrupper som är mest känsliga för bakterieinfektioner och matförgiftningar. Det är därför viktigt att mjölkpulver som används för barnmatstillverkning håller låg B. cereus-halt. 100 olika bröstmjölksersättningspulver, med mjölk som huvudkomponent, representerande de 10 ledande fabrikaten i Europa, har undersökts med avseende på förekomst av B. cereus. I 17 prover kunde man påvisa B. cereus direkt med i genomsnitt 130 cfu/g (max 480/g). Efter inkubering vid 25-30 C i upp till 24 timmar påträffades B. cereus i 63 prover. 35% av dessa hade potentiell förmåga att HBL. Tyvärr analyserades endast denna typ av toxin. Toxin kunde också påvisas i produkterna i 4 av proverna efter 14 timmar. Dessa produkter innehöll alla maltodextrin (en nedbrytningsprodukt av stärkelse som ger ökat näringsvärde). Vid undersökning av effekten av laktos, glukos och maltodextrin på toxinbildning i laboratoriesubstrat visade det sig att toxinbildning erhölls med glukos och maltodextrin men inte med laktos. Forskarna drar slutsatsen att förekomst av låga B. cereus-halter i bröstmjölksersättning inte utgör någon hälsofara om drycken konsumeras inom fyra timmar efter beredning. Däremot kan förekomst av maltodextrin i bröstmjölksersättning vara en riskfaktor om mjölken förvaras på olämpligt sätt och för länge, eftersom maltodextrin stimulerar toxinbildning. Källa: Rowan, N.J. & Anderson, J.G. (1997). Appl. Envir. Microbiol. 63: 1182-1184. Maltodextrin stimulates growth of Bacillus cereus and synthesis of diarrheal enterotoxin in infant formulas. Matförgiftning av bröstmjölksersättning Ett livsmedelsburet utbrott av B. cereus inträffade vid en avdelning för nyfödda barn på ett sjukhus i Chile 1981. Under en period av 30 dagar insjuknade 35 nyfödda barn i diarré. B. cereus kunde påvisas i avföringen från 37% av de sjuka barnen, men inte från barn som var friska. Vid mikrobiologisk undersökning av bröstmjölkersättningspulver visade sig ett märke bland av de använda produkterna innehålla B. cereus. Färdigberedd produkt i nappflaskor
placerades varma i kylskåp och förvarades i kyla under upp till 24 timmar. B. cereus-halten ökade under förvaringen, troligtvis p.g.a. att nedkylningen tog lång tid. 19 slumpmässigt isolerade stammar var alla otypbara med serotypning men alla var toxinbildare vid test i nyfödda möss.