Comparison of four transport systems for enteric pathogens

Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi Biomedicinska analytikerutbildningen Examensarbete 15 högskolepoäng C-nivå Vt. 2011 Comparison of four transport systems for enteric pathogens Belan Haidar Handledare: Magnus Thore, Karin Schütte & Camilla Svensson Klinisk mikrobiologi, Centrallasarettet, Västerås

ABSTRACT: Commercial swab transport systems are used for collection and transporting of fecal and other microbiological samples. This system must maintain viability and contribute to survival of microorganisms during transport to the laboratory. Four swab transport systems have been compared, eswab, - Transwab and fecalswab, all three with flocked swabs, and Copan Venturi Transystem with rayon swabs. The study followed the recommendations from the Clinical Laboratory Standard Institute; document M40-A for recovery of Samonella, Shigella, Yersinia and Neisseria gonorrhoeae after storage for 0, 6, 24, 48 and 72 h at room- (22-25 C) and refrigerated (2-8ºC) temperature. A fecal sample has also been inoculated with Salmonella or Shigella to simulate a fecal sample positive for Salmonella or Shigella. Recovery of all strains was higher with eswab, - Transwab and fecalswab than with Copan Venturi Transystem stored at both temperatures. A heavy growth was observed with all transport systems after storage for 24, 48 and 72 h at room temperature, except for Neisseria gonorrhoeae, and Shigella. The number of CFU for all strains was constant up to 72 h at refrigerated temperature with Copan Venturi Transystem. In the experiment with fecal sample recovery of Salmonella and Shigella was best with fecalswab at both storage temperatures. ESwab, - Transwab and fecalswab are equivalent and can be used as an alternative to Copan Venturi Transystem with better survival of enteric pathogens and Neisseria gonorrhoeae. Fecal samples should be refrigerated in order to avoid heavy overgrowth of fecal flora. KEYWORDS: Swab transport system; Liquid Amies medium; Fecal sample; Flocked swab 2

INTRODUKTION För odling av tarmpatogener, Salmonella, Yersinia och Shigella kommer fecesprover till ett mikrobiologiskt laboratorium, antingen på provtagningspinnar nedstoppade i ett transportmedium eller som feces i provtagningskärl med sked. Kort transporttid av fecesprover till laboratoriet är en avgörande faktor för fastställande av rätt diagnos, eftersom fördröjningen kan försvåra påvisandet av tarmpatogener. Detta gäller speciellt för mer känsliga bakterier såsom Shigella och Salmonella som är känsliga för surt ph, vilket orsakas av olika metaboliska produkter i ett vanligt fecesprov (Wells JG et al., 1981; Mandy LS el at., 1991; Dan M et al., 1989). Därför måste fecesprover sändas omgående till laboratoriet, men om detta inte är möjligt bör provet förvaras i kyl (2-8ºC) i avvaktan på transport. Salmonella, Yersinia och Shigella är gramnegativa stavar tillhörande familjen Enterobacteriaceae. Dessa tarmpatogener orsakar samhällsförvärvade infektioner framför allt diarreér, kräkningar, buksmärtor och är anmälningspliktiga enligt Smittskyddslagen. Salmonella-bakterierna indelas i två arter, Salmonella enterica och Salmonella bongori baserat på förekomsten av ytstrukturer: flageller (H- antigen), lipopolysackarid (O- antigen) (John R et al., 2011) och polysackarid i kapsel (Vi- antigen) som finns hos specifika serotyper. Infektionsdosen är hög (10 6-10 9 ). Smittan sprids mest via kontaminerade födoämnen, och person till person-smitta kan också förekomma. Inom genus Yersinia är arterna Yersinia enterocolitica och Yersinia pseudotuberculosis primärt humanpatogena och orsakar mag-tarm infektioner. Bakterierna återfinns hos olika djur, främsta reservoaren finns hos grisar, och sprids till människan via infekterade födoämnen eller vatten. De kan tillväxa vid temperaturer ner mot noll och också i kylskåpstemperatur. Shigella indelas biokemiskt och serologiskt i fyra olika arter och har människan som huvudsaklig reservoar (Escobar- Paramo P et al., 2003) varav Shigella sonnei, som ger en relativt mild sjukdom, är den vanligast förekommande arten i Sverige. Den låga infektionsdosen (10 1-10 2 bakterier) orsakar stor smittsamhet, indirekt genom infekterade livsmedel och vatten och direkt från person till person. Enligt den epidemiologiska årsrapporten 2009 över smittsamma sjukdomar från SMI (Smittskyddsinstitutet) anmäldes totalt 3 054 fall av salmonellainfektion, 469 fall av shigellainfektion och 398 fall med yersiniainfektion. Majoriteten av de rapporterade fallen hade smittats utomlands 1. 1 www.smi.se- publikationer- Årsrapporter och verksamhetsberättelser-smi:s årsredovisningar. 2011-04-10 3

Neisseria gonorrhoeae är gramnegativa diplokocker inom familjen Neisseriaceae som orsakar gonorré (sexuellt överförbar sjukdom). Neisseria gonorrhoeae är aerob, obligat patogen och kräver en CO 2 - miljö i upp till 2 dygn för tillväxt på Hematinagar. Dessa bakteriers enda värd är människan och de överlever därför inte utanför värden på grund av hög känslighet för bland annat uttorkning och extrema temperaturer. Därför är det viktigt att kliniska prover gällande Neisseria gonorrhoeae sänds till laboratoriet samma dag som provet tas. Fynd av Neisseria gonorrhoeae i kliniskt prov ska anmälas enligt smittskyddslagen. För diagnostik av fecesprover vid frågeställningen Salmonella och Shigella görs en kvalitativ aerob odling på XLDagar (xylose lysine desoxycholat agar) och DCagar (desoxycholat citrate agar) som inkuberas i 35-37ºC över natt samt anrikning i Rappaportbuljong som inkuberas i 40-42ºC över natt och sprids därefter på XLDagar. Den selektiva buljongen undertrycker tillväxt av andra bakterier med undantag av Salmonella. För diagnostik av Yersinia görs en kvalitativ aerob odling på CINagar (cefsulodin, irgasan och novobiocin agar) och inkuberas i 28-30ºC i två dygn. Efter inkubering identifieras typiska kolonier för samtliga bakteriesorter 2. Lämplig insamling, transportmedium och transporttid är faktorer som är avgörande för optimalt laboratorieanalys av mikroorganismer från kliniska prover. Oftast används transportmedium med tillhörande provtagningspinne för insamling och transport av prover av olika slag. Detta system måste stabilisera och bidra till överlevnaden av mikroorganismer under transport till laboratoriet (Van Horn KG et al., 2008). Provtagningspinnen bör vara preparerad med material som inte är toxiska för mikroorganismerna och som kan ta upp tillräckligt med provmaterial. De flesta provtagningspinnar, som finns kommersiellt tillängliga, är preparerade med rayon (cellulosafiber), Dacron (polyesterfiber) eller bomull. Nya flockade provtagningspinnar tillhörande Liquid Amies transportsystem är preparerade med nylon (Van Horn KG et al., 2008; Nys S et al., 2010). Olika typer av transportsystem finns idag tillängliga för alla typer av kliniskt bakteriologiska prover. Dessa baserar sig på Stuarts medium som har sitt ursprung från 1940- talet, som senare har modifierats, dels för att bidra till en bättre överlevnad bland annat av gonokocker och dels för att behålla balansen mellan olika bakteriearter i prover innehållande blandflora. Modifierat Stuarts medium är ett icke-näringsrikt medium, buffrat med fosfater 2 (http://referensmetodik.smi.se- Tarminfektioner, 2:a upplagan 2002, 2011-04-05) 4

och ger en reducerad miljö på grund av närvaro av natrium-tioglykolat och liten mängd agar (Barry AL et al., 1972). Många laboratorier använder sig av traditionellt Amies agar gel medium med aktivt kol med tillhörande rayon pinnar. Fördelen med närvaro av kol är att den neutraliserar metaboliska produkter i provet såsom fettsyror som är toxiska för bakterier (Arbique JC et al., 2000). Amies transportmedium innehåller oorganiskt fosfat som har ersatt glycerolfosfat som finns i Stuarts medium. Glycerolfosfat har visat sig metaboliseras av vissa koliforma bakterier, därmed ökar risken för tillväxt under transporten. Ett speciellt transportmedium som är rekommenderat för fecesprover är Cary Blair medium som är buffrat till ph 8,1, vilket förlänger överlevnad av bland annat Shigella och Salmonella i fecesprover. Det finns flera studier som visar att Shigella överlever i Cary Blair upp till 49 dagar och Salmonella i upp till 45 dagar i rumstemperatur (Cary SG et al., 1964; Cary SG et al., 1965). På senare år har det tillkommit ett flytande transportsystem så kallad modifierat Liquid Amies medium, oftast 1 ml medium med tillhörande nylon-flockade pinnar. Flockade pinnar anses ha bättre uppsugningsförmåga, släpper mera av provmaterialet i transportmediet än det traditionella rayon pinnar och bidrar till bättre diagnostik av bakterier inkluderande aerober, anaerober, känsliga anaeorober och även virus (Van Horn KG et al., 2008; Nys S et al., 2010). Fördelen med att använda flytande transportsystem är att ett enda prov kan användas bland annat för manuell eller automatisk inokulering av bakteriologiska prover på agarplattor, förbereda för gramfärgning och molekylära analyser. Dessutom kan återstående provmängd frysas och användas för senare analys (Fontana C et al., 2009; Bourbeau PP et al., 2009; Chernesky M et al., 2006) eller för kontroll vid avvikande resultat. Denna studie följde rekommendationer från CLSI 3 dokument M40-A (Van Horn KG et al., 2008). Målet med studien var att jämföra fyra olika transportsystem, CVT (Copan Venturi Transystem) med Amies Agar gel medium innehållande kol, Σ-Transwab och eswab (elution swab) med 1 ml Liquid Amies medium och fecalswab med 2 ml modifierat semi-liquid medium, för överlevnad av tarmpatogenerna Salmonella, Shigella och Yersinia samt för Neisseria gonorrhoeae efter förvaring i både rumstemperatur (22-25 C) och kyl (2-8ºC) efter 0, 6, 24, 48 och 72 h inkubering. 3 Clinical and Laboratory Standards Institute 5

MATERIAL OCH METOD Referensstammar I denna studie användes totalt sex referensstammar från CCUG (Culture Collection, University of Göteborg). CCUG stammarna var Salmonella Typhimurium (CCUG 31969) Salmonella Montevideo (CCUG 21239), Shigella sonnei (CCUG 32351), Yersinia enterocolitica (CCUG 8233), Yersinia pseudotuberculosis (CCUG 17342) och Neisseria gonorrhoeae (CCUG 41812). Samtliga referensstammar var förvarade frysta i -70 C på Mikrobank (Pro-Lab) rör. Inför försöket spreds stammarna på blodagar innehållande 5 % defribinerat hästblod och inkuberades i 36 C för Salmonella Typhimurium, Salmonella Montevideo och Shigella sonnei, medan Yersinia enterocolitica och Yersinia pseudotuberculosis inkuberades i 28 C för kommande analys, med undantag för Neisseria gonorrhoeae som odlades ut på Hematinagar och inkuberades i 36 C i en 5 % CO 2 - miljö. Inkubationstiden för respektive agarplatta var ett dygn (18-24 h). Alla agarplattor framställdes enligt laboratoriets beskrivningar. Transportsystem Fyra olika transportsystem testades för samtliga bakteriestammar: CVT (Copan Diagnostics, Brescia, Italien) med Amies Agar gel medium med kol (rayon pinnar), Σ-Transwab (Medical Wire & Equipment, England) och eswab (Copan Diagnostics, Brescia, Italien) med 1 ml Liquid Amies medium (nylon-flockade pinnar) och till sist fecalswab (Copan Diagnostics, Brescia, Italien) med 2 ml modifierat semi-liquid medium (nylonflockade pinnar). Inokulering av transportsystemen med referensstammar för förvaring i rumstemperatur och kyl Försöken följde rekommendationer från CLSI (Van Horn KG et al., 2008). En bakteriesuspension för varje referensstam, odlade över natt, preparerades i 0,9 % NaCl som motsvarande 0,5 McFarland standard (1,5 10 8 colony forming units (CFU)/mL) och mättes med spektrofotometer (HITACHI U110 spektrofotometer). Absorbansen av 0,5 McFarlandstandard bör ligga mellan 0,08-0,10 vid 625 nm. Denna bakteriesuspension späddes i 10- faldiga steg till slutkoncentrationer motsvarande 10 7, 10 6, 10 5 och 10 4 CFU/mL för samtliga referensstammar. 6

För att validera och jämföra varje transportsystem (CVT, Σ- Transwab, eswab och fecalswab) togs (i duplikat) 100 μl från en spädning motsvarande 10 5 CFU/mL för respektive bakterie-suspension och placerades på ytan av en steril petriskål. Eftersom Neisseria gonorrhoeae är känslig togs 100 μl från en spädning innehållande ca 10 8 CFU/mL. Provtagningspinnar från varje transportsystem rullades i 100 μl tills all vätska absorberades. Därefter stoppades provtagningspinnarna direkt i tillhörande transportsystem och förvarades i både rumstemperatur och kyl för 0 (15 min efter första inokulation), 6, 24, 48 och 72 h. Efter varje inkuberingstid, inklusive 0 h, vortexades varje transportsystem förutom CVT, med tillhörande pinne i 15 s för att få en homogen blandning. Sedan togs provtagningspinnarna ut från respektive transportsystem och stryktes ut primärt över halva XLDagarytan för Salmonella Typhimurium, Salmonella Montevideo och Shigella sonnei, varefter sekundär- och tertiärstryk, (med 1 µl ögla) gjordes för att öka chansen att få fria kolonier. För Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis odlades pinnarna ut på CINagar. Neisseria gonorrhoeae odlades ut på Hematinagar. Till Neisseria gonorrhoeae användes inte fecalswab eftersom det transportmediet är speciellt för fecesprover. Allt gjordes i duplikat. För att kontrollera insådden och räkna hur mycket bakterier som fanns per 100 µl, gjordes en så kallad Viable Count genom att ta 25 μl från spädningen motsvarande10 4 CFU/mL för samtliga bakteriestammar och rackla ut på MacConkeyagar och Hematinagar (för Neisseria gonorrhoeae). XLDagar och MacConkeyagarplattorna inkuberades i ett dygn i 36 C och CINagar plattorna inkuberades i två dygn i 28 C. Hematinagarplattorna inkuberades i 36 C i 5 % CO 2 - miljö i två dygn. Efter varje inkubationstid avlästes plattorna och antalet, typiska kolonier för respektive referensstam räknades. Inokulering av transportsystemen med referensstammar i feces för förvaring i rumstemperatur och kyl Avidentifierade fecesprover tagna i provtagningskärl med sked och negativa för Salmonella, Shigella, Campylobacter, Clostridium difficile vid odling, användes för att jämföra och utvärdera de fyra transportsystemen. Fecesproven späddes med 0,9 % NaCl och vortexades (3 7

ml NaCl/g feces). Bakteriesuspension motsvarande 0,5 McFarland standard av Shigella sonnei eller Salmonella Typhimurium tillsattes i feces, och vortexades (50 μl/g feces). Provtagningspinnarna doppades i fecesproven (fyra provtagningspinnar/transportsystem) innehållande referensstammarna i 15 s och stoppades ned senare i respektive tranportmedium. Därefter förvarades alla transportsystem i både rumstemperatur och kyl (2-8ºC) i 0 (15 min efter första inokulation), 6, 24, 48 och 72 h, dels för att se hur länge bakterierna kan återfinnas i provet och dels för att finna en lämplig förvaringstemperatur av provet innehållande dessa bakterier. Efter varje inkubationstid, inklusive 0 h, vortexades varje transportsystem med tillhörande provtagningspinne, förutom CVT, i 15 s för att få en homogen blandning. Sedan togs provtagningspinnarna ut från respektive transportsystem och stryktes ut primärt över halva agarytan, varefter sekundär- och tertiärstryk, (med 1 µl ögla) gjordes. Två av pinnarna odlades på två XLDagar och de två andra pinnarna på två DCagar. XLD agarplattorna inkuberades, i ett dygn och DCagar i två dygn i 36ºC. XLD agarplattorna avlästes efter ett dygn medan DCagarn avlästes efter ett och två dygn. För att fastställa att det är just Shigellabakterier som vuxit på DC- och XLDagarn bland normalfloran, utfördes konfirmerande biokemiska tester på misstänkta kolonier enligt referensmetodiken för laboratoriediagnostik vid kliniskt mikrobiologiska laboratorier. För att kontrollera hur mycket bakterier som sattes till per g feces, togs 25 μl från spädningen motsvarande 10 4 CFU/mL för både Salmonella- och Shigellastammen och racklades ut på MacConkeyagar och inkuberades över natt i 36ºC. Vätskeabsorptionstest av provtagningspinnar För att jämföra rayon (CVT) och flockade (eswab, Σ-Transwab, fecalswab) provtagningspinnar från respektive transportsystem vägdes provtagningspinnar innan och efter nedsänkning i 0,9 % NaCl i 15 s och efter utstrykning på agarplattor. 8

RESULTAT Inokulering av transportsystemen med referensstammar efter förvaring i rumstemperatur Medelantal CFU och överlevnaden av sex referensstammar kontrollerades för fyra olika transportsystem efter förvaring i rumstemperatur i fem olika tider; 0, 6, 24, 48 och 72 h och resultatet presenteras i tabell 1. Alla transportsystem gav räknebara antal CFU vid inkubering i 0 och 6 h för respektive referensstam. Antal CFU för respektive referensstam vid 0 och 6 h var mycket högre med Liquid Amies medium(σ-transwab, eswab) och Cary Blair medium (fecalswab) jämfört med Agar gel medium med kol (CVT). Till exempel var antalet CFU för Salmonella Typhimurium vid 0 h 97 med CVT men med esawb var det 465 CFU. Liknande resultat konstaterades för de övriga referensstammarna. Antal CFU för alla referensstammar, undantaget Shigella sonnei (CVT), började öka efter 24 h, vilket gjorde det svårt att räkna kolonier och därför gjordes en bedömning/gradering utifrån hur kraftigt de växte på agarplattorna. För Neisseria gonorrhoeae observerades ingen tillväxt med CVT efter 48 h och efter 72 h med Σ-Transwab, medan de kunde växa fram upp till 72 h med eswab. 9

Tabell 1: Antal CFU från fyra olika transportsystem efter förvaring i rumstemperatur Referenstammar Transportsystem Inokulat CFU/pinne Antal CFU efter utodling i: 0h 6h 24h 48h 72h Shigella sonnei (CCUG 32351) CVT* ~140 70 137 95 86 112 Σ-transwab ~140 113 248 650 1+ 815 eswab ~140 137 995 5+ 5+ 5+ fecalswab ~140 46 215 4+ 5+ 5+ Salmonella Typhimurium (CCUG13969) CVT ~800 97 95 3+ 4+ 5+ Σ-transwab ~800 505 380 3+ 4+ 4+ eswab ~800 465 808 4+ 4+ 5+ fecalswab ~800 240 535 4+ 4+ 4+ Salmonella Montevideo (CCUG 21293) CVT ~800 189 195 3+ 4+ 5+ Σ-transwab ~800 875 715 4+ 4+ 4+ eswab ~800 670 1375 5+ 5+ 5+ fecalswab ~800 360 1010 5+ 5+ 5+ Yersinia enterocolitica (CCUG 8233) CVT ~640 148 265 775 4+ 4+ Σ-transwab ~640 861 1110 4+ 4+ 4+ eswab ~640 778 1+ 5+ 5+ 5+ fecalswab ~640 517 1425 5+ 5+ 5+ Yersinia pseudotuberculosis (CCUG 17342) CVT ~960 69 140 740 2+ 5+ Σ-transwab ~960 616 635 875 2+ 3+ eswab ~960 480 1225 5+ 5+ 5+ fecalswab ~960 175 585 4+ 4+ 4+ Neisseria gonorrhoeae (CCUG 41812) CVT ~600 216 24 90 0 0 Σ-transwab ~600 3+ 3+ 52 1+ 0 eswab ~600 3+ 3+ 2+ 320 90 *Copan venturi transystem 3+ >2500 1+ >1500 4+ går ej att räkna, kolonier flyter ihop 2+ >2000 5+ tjock matta av kolonier och konfluerande växt Inokulering av transportsystemen med referensstammar efter förvaring i kyl Medelantal CFU och överlevnaden av sex referensstammar kontrollerades för fyra olika transportsystem efter förvaring i kyla i fem olika tider; 0, 6, 24, 48 och 72 h och resultatet presenteras i tabell 2. Efter förvaring i kyl gav alla transportsystem räknebara antal CFU för alla referensstammar upp till 72 h inkubering. Ingen kraftigt tillväxt observerades för något av de fyra transportsystemen förutom för Neisseria gonorrhoeae, vid 6, 24 och 48 h med eswab och Σ- Transwab, och Yersinia enterocolitica vid 48 och 72 h. Överlevnaden för Neisseria 10

gonorrhoeae var mycket bättre med Liquid Amies medium än Amies Agar gel medium. FecalSwab testades inte för Neisseria gonorrhoeae, eftersom den inte är fecespatogen. Shigella sonnei, som är känsligare än Salmonella, växte fram betydligt bättre med Liquid Amies medium än med Amies Agar gel medium, särskilt med eswab. En minskning i antal CFU för Shigella sonnei observerades för varje inkubationstid. Tabell 2: Antal CFU från fyra olika transportsystem efter förvaring i kyl Referenstammar Transportsystem Inokulat CFU/pinne Antal CFU efter utodling i: 0h 6h 24h 48h 72h Shigella sonnei (CCUG 32351) CVT* ~140 47 17 3 6 3 Σ-transwab ~140 94 41 15 5 1 eswab ~140 154 74 19 17 12 fecalswab ~140 68 38 12 14 10 Salmonella Typhimurium (CCUG13969) CVT ~1100 327 261 193 150 130 Σ-transwab ~1100 680 478 566 609 297 eswab ~1100 748 727 528 633 636 fecalswab ~1100 351 487 475 708 734 Salmonella Montevideo (CCUG 21293) CVT ~1200 433 215 110 73 88 Σ-transwab ~1200 661 830 386 371 453 eswab ~1200 870 838 561 650 674 fecalswab ~1200 454 420 437 596 564 Yersinia enterocolitica (CCUG 8233) CVT ~1000 285 387 223 139 184 Σ-transwab ~1000 813 511 417 391 418 eswab ~1000 896 934 960 1+ 2+ fecalswab ~1000 480 447 551 698 773 Yersinia pseudotuberculosis (CCUG 17342) CVT ~1000 135 55 76 191 453 Σ-transwab ~1000 643 130 273 417 450 eswab ~1000 620 698 805 1+ 2+ fecalswab ~1000 582 420 1320 2+ 3+ Neisseria gonorrhoeae (CCUG 41812) CVT ~600 51 529 103 5+ 0 Σ-transwab ~600 3+ 3+ 3+ 2+ 272 eswab ~600 3+ 3+ 2+ 2+ 410 *Copan venturi transystem 2+ >2000 1+ >1500 3+ >2500 5+ tjock matta av kolonier och konfluerande växt 11

Inokulering av transportsystemen med referensstammar i feces efter förvaring i rumstemperatur och kyl När en viss mängd Salmonella Typhimurium- och Shigella sonnei-suspension tillsattes i fecesprover (negativa för Salmonella, Shigella, Campylobacter, Cl difficile), observerades skillnad mellan växt vid förvaringen i kyl och rumstemperatur (tabell 3, 4). Efter förvaring i rumstemperatur, växte fecesfloran rikligt med samtliga transportsystem i försöket med Shigella sonnei, vilket gjorde det svårt att hitta Shigella- kolonier i primärstryket, men fria kolonier kundes ses i sekundär- eller tertiärstryket efter 0, 6 och 24 h. Inga Shigella- kolonier kunde hittas med CVT efter 48 och 72 h eller med Σ-Transwab efter 72 h på DCagar. Efter kylförvaring var växt av fecesfloran undertryckt jämfört med förvaring i rumstemperatur, vilket gjorde att Shigella- kolonier växte fram bättre med samtliga transportsystem upp till 72 h. Minskad tillväxt av Shigella observerades med samtliga transportsystem efter 24 h inkubering, efter förvaring i både rumstemperatur och kyl, förutom med fecalswab som gav riklig växt upp till 72 h (tabell 3). I försöket med Salmonella Typhimurium var växt av fecesfloran undertryckt i både rumstemperatur och kyl. I rumstemperatur sågs riklig växt av Salmonella med alla transportsystemen. I kyl observerades däremot måttlig växt med CVT och riklig växt med Σ- Transwab, eswab och fecalswab upp till 72 h på DCagar. På XLDagar sågs en minskad tillväxt av Salmonella med eswab efter 48 och 72 h (tabell 4). 12

Tabell 3: Överlevnad av Shigella sonnei i feces efter förvaring i rumstemperatur och kyl i fyra transportsystem () Transportsystem Agar Förvaring 0h F**/S*** 6h F/S 24 F/S 48h F/S 72h F/S CVT* DC r/- r/- XLD Σ-Transwab DC r/- XLD eswab DC m/s m/s XLD m/s r/- m/s fecalswab DC XLD * Copan venturi transystem r, R= riklig växt ** Fecesflora m, M= måttlig växt *** Shigella sonnei s, S= sparsam växt - =ingen växt 13

Tabell 4: Överlevnad av Salmonella Typhimurium i feces efter förvaring i rumstemperatur () och kyl i fyra transportsystem Transportsystem Agar Förvaring 0h F**/S*** 6h F/S 24 F/S 48h F/S 72h F/S CVT* DC XLD Σ-Transwab DC XLD eswab DC XLD m/s m/s fecalswab DC XLD * Copan venturi transystem s, S= sparsam växt *** Salmonella Typhimurium m, M= måttlig växt ** Fecesflorac r, R= riklig växt Vätskeabsorptionstest av provtagningspinnar Vid testande av provtagningspinnarna konstaterades att, flockade pinnar tillhörande eswab, Σ-Transwab och fecalswab tog upp mera vätska jämfört med rayon pinnar tillhörande CVT (p<0,01). Och att flockade pinnar tillhörande eswab och fecalswab släppte av mera vätska än rayon-pinnar (p<0,01, n= 5) förutom jämförelsen med Σ-Transwab (p=0,1) efter utstrykning på agarplattor (tabell 5). 14

Tabell 5: jämförelse mellan Rayon- och flockade provtagningspinnar. Transportsystem Upptag p-värde Avgivning p-värde (n=5) (mg, MV a ± SD b ) (mg, MV ± SD ) CVT* 84 ± 17-8 ± 3 - Σ-Transwab 22 ± 6 < 0,01 12 ± 4 0,1 eswab 124 ± 6 < 0,01 70 ± 0,9 < 0,01 fecalswab 141 ± 9 < 0,01 62 ± 6 < 0,01 *Copan venturi transystem a medelvärde b standardavvikelse DISKUSSION För odling av tarmpatogener, till exempel Salmonella, Shigella och Yersinia, transporteras fecesprover i sterila rör eller på provtagningspinnar nedstoppade i någon form av transportmedium. Provet ska sändas omgående till laboratoriet och bör odlas ut samma dag som provet har tagits. Om detta inte är möjligt ska provet förvaras i kyl i väntan på transport, dock högst 24 h. Studien gjordes för att jämföra fyra transportsystem (CVT, esawb, -Transwab, fecalswab) för transport av sex referensstammar, Salmonella Typhimurium, Salmonella Montevideo, Yersinia entrica, Yersinia pseudotuberculosis och Shigella sonnei som är tarmpatogena och Neisseria gonorrhoeae. Alla försöken följde rekommendationer från CLSI dokument A-40 (kvalitetskontroll av mikrobiologiskt transportsystem) (Van Horn KG et al., 2008). I försöken med referensstammarna kunde i alla transportsystem antalet CFU efter odling beräknas vid inkubering i 0 och 6 h i rumstemperatur och upp till 72 h i kyl. Förvaring av referensstammarna i rumstemperatur, gav kraftigt tillväxt efter 24, 48 och 72 h inkubering med alla transportsystemen, detta gällde dock inte för Neisseria gonorrhoeae och Shigella sonnei med CVT där antalet CFU minskade upp till 72 h vid inkubering i rumstemperatur. I kyl konstaterades ingen kraftigt tillväxt i något av transportsystemen och antalet CFU var relativt oförändrat vid varje inkubationstid. 15

I andra studier har man också observerat kraftigt tillväxt för bland annat Pseodomonas aeruginosa med eswab och andra transportsystem som testades (Van Horn et al., 2008) och för tarmpatogener (Rishmawi N et al., 2007). Shigella sonnei överlevde bättre i rumstemperatur än i kyl med alla transportsystem. Sämst var överlevnaden med CVT för Shigella förvarade i både rumstemperatur och kyl. Däremot överlevde Neisseria gonorrhoeae bättre i kyl än i rumstemperatur med alla transportsystemen, men med sämst överlevnad med CVT. Det finns olika uppfattningar om hur Neisseria gonorrhoeae bör transporteras och förvaras innan processning på laboratoriet; en del publikationer rekommenderar förvaring i kyl och andra i rumstemperatur (Arbique JC et al., 2000). Förvaring av mikroorganismer i rumstemperatur, speciellt gramnegativa stavar, är ett problem, eftersom det kan orsaka kraftig tillväxt (Saegeman et a.l, 2011), vilket kan leda till misstolkning av resultatet (Van Horn KG et al., 2008). Det finns ingen CLSI- standard med bedömningskriterier vid tillväxt av mikroorganismer vid inkubering i rumstemperatur (Van Horn KG et al., 2007). Därför är det rekommenderat i flera publikationer att förvara fecesprover i kyl i avvaktan på transport eller processning på laboratoriet (Morosini MI et al., 2006; Human RP et al., 2004; Dan M et al., 1989). Fecesprover (negativa för Salmonella, Shigella, Campylobacter, Clostridium difficile) blandades med en viss mängd Salmonella Typhimurium- eller Shigella sonnei suspension för att efterlikna fecesprover positiva för Salmonella och Shigella. I det här försöket användes troligen högre koncentration av referensstammarna än vad som förekommer i ett patientprov. Efter förvaring i rumstemperatur växte fecesfloran rikligt i alla transportsystemen, vilket gjorde att Shigella- kolonier kom fram i sekundär och tertiärstryket, men i kyl var fecesfloran undertrykt med alla transportsystem. I försöket med Salmonella Typhimurium var fecesfloran undertryckt efter förvaring i både kyl och rumstemperatur på grund av något mer tillsats av Salmonellabakterier i fecesprovet (2 10 6 CFU/g feces) jämfört med försöket med Shigella sonnei (7 10 5 CFU/g feces). Av alla transportsystem gav fecalswab bäst överlevnad av Shigella sonnei och Slamonella Typhimurium i både kyl och rumstemperatur, vilket kan bero på det låga näringsinnehållet och användning av fosfat som buffertsystem i transportmediet. Dessutom är mediet rekommenderat för fecesprover och förlänger överlevnad av Shigella och Salmonella upp till flera veckor i rumstemperatur och kyl (Cary SG et al., 1964; Cary SG et al., 1965; Wasfey M et al., 1995). Det observerades ingen bättre överlevnad av tarmpatogener 16

med fecalswab jämfört med eswab och -Transwab i rumstemperatur i försöket med referensstammarna, men ett högre antal CFU observerades med fecalswab än CVT och -Transwab i kyl. Generellt gav eswab, -Transwab och fecalswab med tillhörande flockade pinnar bättre överlevnad av tarmpatogener och Neisseria gonorrhoeae än CVT efter förvaring i både rumstemperatur och kyl upp till 48 h. Försök med vätskeabsorptionstest av provtagningspinnarna visade att flockade pinnar tog upp och släppte av mer vätska jämfört med traditionella rayon pinnar (p<0,01), undantaget jämförelsen mellan CVT och - Transwab (p=0,01), efter utstrykning på agarplattor. Detta leder till att ett högre antal kolonier kan hittas med eswab, -Transwab och fecalswab, vilket framgår i denna studie. Liknande observation har rapporterats i tidigare studier (Smismans A et al, 2009). Flera studier har visat fördelen med Liquid Amies transportsystem med tillhörande flockade pinnar och att systemet ger ett högre utbyte av provmaterial och ökar därmed analysernas känslighet. En studie gjord på 80 gramfärgningspreparat från 80 patientprover, inkluderande vaginal, cervikal, uretral och sårprover, tagna med eswab och Amies Agar gel medium, visar att färgningspreparaten gjorda med material från eswab visar mera av humana celler och bakteriearter än traditionella Amies Agar gel medium (Fontana C et al, 2009). Närvaro av kol i Amies Agar gel medium, som anses vara bra för att den neutraliserar fettsyror som är toxiska för bakterierna (ArbiqueJC et al., 2000), försvårar gramfärgning av bakterier och dess tolkning i ljusmikroskop (Olsen CC et al., 1999; Barber S et al., 1998). Andra studier rapporterar att flockade pinnar ger ett statistiskt bättre resultat vid immunofärgning av infekterade respiratoriska epiteliala celler och att flera celler kan ses jämfört med rayon pinnar (Daley P. et al, 2006) Syftet med de nya Liquid Amies transportsystemen är att de ska kunna används för automatisk inokulering av olika sorters mikrobiologiska prover på agarplattor. Copan har utvecklat ett helt automatiserat instrument för inkubering och strykning av mikrobiologiska prover tagna med Liquid Amies medium. Flera andra automatiserade instrument finns idag på marknaden till exempel, biomerieux MicroStreak och Dynacon Inoculab (Bourbeau PP et al., 2008). sammanfattningsvis: eswab, -Transwab och fecalswab är likvärdiga transportsystem och kan användas som ett alternativ för CVT med bättre överlevnad av Salmonella, Shigella och 17

Yersinia och Neisseria gonorrhoeae. Fecesprover bör förvaras i kyl i väntan på transport till laboratoriet för att undvika kraftig överväxt av fecesflora. Nya Liquid Amies medium med flockade pinnar erbjuder multitestanalys från ett och samma prov. Vidare studier krävs för utvärdering med olika koncentrationer av Salmonella i fecesprover negativa för tarmpatogener, test av kliniska prover, inkubering med ytterligare känsliga bakterier och för att göra olika molekylära analyser. REFERENSER Arbique JC, Forward KR and LeBlanc J (2000) Evaluation of four commercial transport media for the survival of Neisseria gonorrhoeae. Diagn Microbiol Infect Dis 36(3):163-168. Barry AL, Fay GD and Sauer RL (1972) Efficiency of transport medium for the recovery of aerobic and anaerobic bacteria from applicator swabs. Appl Microbiol 24(1):31-33. Bourbeau PP and Swartz BL (2009) First evaluation of the WASP, an new automated microbiology plating instrument. J Clin Microbiol 47(4):1101-1106. Cary SG and Blair EB (1964) New transport medium for shipment of clinical specimens. I. fecal specimens. J Bacteriol 88(1):96-98. Cary SG, Fusillo MH and Harkins C (1965) Survival of Shigella and Salmonella in a new transport medium. Am J Clin Pathol 43(3):294-296. Chernesky M, Castriciano S, Jang D et al. (2006) Use of flocked swabs and a universal transport medium to enhance molecular detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae. J Clin Microbiol 44(3):1084 1086. Daley P, Castriciano S, Chernesky M et al (2006) Comparison of flocked and rayon swabs for collection of respiratory epithelial cells from uninfected volunteers and symptomatic patients. J Clin Microbiol 44(6): 2265 2267. 18

Dan M, Richardson J, Miliotis MD et al. (1989) Comparison of preservation media and freezing conditions for storage of specimens of faeces. J Med Microbiol 28(2):151-154. Fontana C, Favaro M, Limongi D et al. (2009) Comparison of the eswab collection and transportation system to an amies gel transystem for gram stain of clinical specimens. BMC Res Notes10; 2:244. Human RP and Jones GA (2004) Evaluation of swab transport systems against a published standard. J Clin Pathol 57(7):762 763. Mandy LS, Shanholtzer CJ, Willard KE et al. (1991) An evaluation of three commercial fecal transport systems for recovery of enteric pathogens. Am J Clin Pathol. 96 (3):364-367. Morosini A-I, Loza E, Gutie rrez O et al (2006) Evaluation of 4 swab transport systems for the recovery of ATCC and clinical strains with characterized resistance mechanisms. Diagn Microbiol Infect Dis 56(1):19 24 Nys S. Vijgen S. Magerman K et al. (2010) Comparison of Copan eswab with the Copan Venturi Transystem for the quantitative survival of Escherichia coli, Streptococcus agalactiae and Candida albicans. Eur J Clin Microbiol 29(4):453-456 Olsen CC, Schwebke JR, Benjamin WH et al. (1999) Comparison of direct inoculation and copan transport systems for isolation of Nisseria gonorrhoeae from endocervical specimens. J Clin Microbiol 37(11):3583-3585 Rishmawi N Ghneim R, Kattan R et al. (2007) Survival of fastidious and nonfastidious aerobic bacteria in three bacterial transport swab systems. J Clin Microbiol 45(4):1278-1283. Saegeman V, Flamaing J, Muller J, Peetermans WE et al (2011) Clinical evaluation of the Copan ESwab for methicillinresistant Staphylococcus aureus detection and culture of wounds. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 65(2):108-111. 19

Smismans A, Verhaegen J, Schuermans A et al (2009) Evaluation of the Copan ESwab transport system for the detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus: a laboratory and clinical study. Diagn Microbiol Infect Dis 65(2):108-111. Van Horn KG and Rankin I (2007) Evaluation and comparison of two Stuart's liquid swab transportsystems tested by the CLSI M40 method. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 26(8):583-586. Van Horn KG, Audette CD, Sebeck D et al. (2008) Comparison of the Copan ESwab system with two Amies agar swab transport systems for maintenance of nicroorganism viability. J Clin Micobiol 46(5):1655-1658. Wasfey M, Oyofo B, Elgindy A et al. (1995) Comparison of preservation media for storage of stool samples. J Clin Microbiol 33(8):2176-2178. Wells JG and Morris GK (1981) Evaluation of transport methods for isolation Shigella spp. J Clin Microbiol.13 (4):789-790. 20