SPECIELL DEL 117
118
Provtagning-allmänt Märkning av prov och remiss Stor noggrannhet krävs vid märkning av prov och remiss. Socialstyrelsen har för att förhindra förväxlingar utarbetat nedanstående författningar: SOSFS 1989:1 Åtgärder för att förhindra förväxlingar inom hälso- och sjukvården Från denna författning har nedanstående citat hämtats (vår kursivering): - Väsentligt för säkerheten är också tillfredsställande rutiner för märkning av röntgenfilmer, laboratorieprov och i förekommande fall läkemedel. - För att minimera säkerhetsrisker av ovan nämnd karaktär föreskriver Socialstyrelsen, att föreskrifter i dessa avseenden skall finnas vid sjukvårdsinrättningarna. Då i övrigt betydande skillnader i lokal organisation kan föreligga är det av vikt att föreskrifterna utfärdas lokalt av vederbörande ansvarig klinikchef/motsvarande. Dessa bör dock i möjligaste mån utformas enhetligt inom ett sjukvårdsområde. De bör därför fastställas av sjukvårdsstyrelse eller direktion såvida de inte avser ett begränsat verksamhetsområde. - Lokala föreskrifter av angivet slag skall upprättas med iakttagande av Socialstyrelsens nedanstående föreskrifter. Dessa behandlar dock inte kliniskt kemisk och bakteriologisk verksamhet m.m. Provtagning och provhantering måste givetvis även inom dessa områden ske på sådant sätt att risk för förväxling elimineras så långt som möjligt. Vid utformningen av lokala rutiner och föreskrifter härför skall i tillämpliga delar beaktas Socialstyrelsens föreskrifter (1984:27) om blodgivning, blodtransfusion m.m. - Oidentifierad patient. Vid intagning av patient, vars identitet inte kan fastställas eller i fråga om vilken erhållna uppgifter är osäkra eller ofullständiga, skall namn och personnummer ersättas med löpnummer. Nummerbeteckningen måste anges i samtliga patientens handlingar samt på etiketter till provrör och annat materiel som är hänförligt till patienten. - Även objektglas bör märkas med så fullständiga identitetshandlingar som möjligt. Det kan emellertid av utrymmesskäl vara nödvändigt att utelämna vissa markeringar. Ett minimikrav bör dock vara att glasen förses med patientens födelsenummer och initialer. - Vid provets ankomst till det laboratorium som skall utföra undersökningen skall provkärlens/objektglasens märkning och antal kontrolleras mot remissen. - Efter förlossningen kommer modern att vara försedd med ett band för egen iden- 119
titet och ett band för varje levande barn. Det nyfödda barnets identitetsnummer skall finnas angivet i samtliga handlingar som rör barnet under dess vistelse på förlossnings- och BB-avdelning. SOSFS 1989:38 Blodgivning, blodtransfusion (ersätter 1984:27) Från denna författning har nedanstående citat hämtats (vår kursivering): - Det är av största vikt att betryggande rutiner utarbetas för identifiering av patienten vid provtagning. - Etikettering får inte ske efter provtagningen. Lossnar etiketten från provtagningsröret sedan provet tagits, skall provet kasseras. - I direkt samband med provtagningen kontrolleras att provtagningsrörets etikett och remissen innehåller korrekta identitetsuppgifter. - Gällande föreskrifter för kontroll av patientens identitet i samband med provtagning måste noggrant följas även i dessa situationer. Beträffande oidentifierade patienter gäller särskilda föreskrifter (SOSFS 1989:1). Analysbeställning/remiss Remissen bör innefatta information om: relevant anamnes, diagnos och uppkomstmekanism till infektionen, antingen i form av klartext eller som ICD-10 kod. eventuell antimikrobiell behandling (genomgången, pågående, planerad). specificerat anatomiskt provtagningsställe (enbart sår räcker t.ex. inte). typ av provmaterial (pus, biopsier etc.). önskad analys inklusive speciella analyser alternativt konsultation/frågeställning till den kliniske bakteriologen. provtagningstidpunkt. beställare av analysen (läkare, klinik och adress). spårbara patientdata. Förutsättningar Prov ska tas enligt laboratoriets anvisningar av personal med adekvat kunskap. Val av provtagningsmateriel Se Provtagning, klinisk del. Val av komponent vid analysbeställning Remissen till det bakteriologiska laboratoriet ska utformas så att remitterande läkare kan välja: 120
önskad analys inklusive speciella analyser alternativt konsultation/frågeställning till den kliniske bakteriologen. Förberedelser Ta fram provtagnings-/transportmaterial och remiss. Observera att remiss och provtagnings-/transportmaterial endast får finnas framdukat för den patient som provtagningen gäller! Märkning Fyll i remissen med uppgifter enligt Märkning av prov och remiss, samt Analysbeställning/remiss. Märk provtagnings-/transportmaterial med data spårbara mot remiss. Godkända undantag: Objektglas. Av utrymmesskäl godkänns märkning med patientens födelsenummer och initialer på objektglas. Okänt personnummer. Remisser ska märkas med födelseår, mån, dag samt namn. Märk provtagnings-/transportmaterial med data spårbara mot remiss. Nyfödda. Remisser ska märkas med efternamn, kön, födelseår, mån, dag samt ID-nummer enligt ID-band. Märk provtagnings-/transportmaterial med data spårbara mot remiss. Oidentifierad patient. Remisser ska märkas med löpnummer samt ID-nummer enligt ID-band. Märk provtagnings-/transport-material med data spårbara mot remiss. Utförande Märkning och provtagning ska ske i en seans. Ta fram och märk remiss samt rekommenderat provtagnings-/transportmaterial (se Provtagning, praktiskt utförande). Kontrollera patientens identitet. Ta prov. Kontrollera att uppgifterna på remiss och provtagnings-/transportmaterial överensstämmer i anslutning till provtagningen. Förslut provtagnings-/transportmaterial och placera detta och remissen så att sammanblandning inte kan ske med andra prov. Ange provtagningstidpunkt och datum på remissen. Provtagaren ska signera remissen. Packa prov enligt gällande föreskrifter, se SMIs hemsida. Transportera prov till laboratoriet. Alla prov ska transporteras så snart som möjligt till laboratoriet. Om det inte kan ske ska nedanstående riktlinjer användas för förvaring och transport. Prov för bakteriologisk odling bör nå labo- 121
ratoriet inom 24 timmar. Provtagning-klinisk del Provtagning Slutna infektioner. För provtagning av infektionsfokus utan direkt kontakt med slemhinna eller hud, t.ex. flegmone eller abscess, rekommenderas aspiration med spruta eller ultraljudsledd punktion. Det infektiösa materialet sprutas ned i en steril membranförsedd syrefri transportbehållare utan transportmedium om polymikrobiell flora misstänks annars i blododlingsflaskor. Öppna sår. Provtagning av öppna sår kan ske med ytprov eller biopsi/vävnadsprov. En mängd olika verktyg och tekniker finns beskrivna för att provta sårytor: fiberarmerade pinnar (ofta bomull eller dacron), velvet pad och andra textila materiel, agar imprint (tryckplatta) och membranfilterteknik är s.k. torra metoder. Metoderna är behäftade med en inbyggd motsättning: i provtagningsögonblicket eftersträvas en stark adhesiv funktion hos provtagningsverktyget medan denna funktion motverkar avskiljningsförmågan vid utodling på fasta medier. Väsentligt högre bakterieandel kan dock utvinnas ur provet om provtagningsverktyget vortexas i ett flytande medium före utodling. Ett alternativ till bomull och dacron är alginat som löses upp i flytande medium före provsättning. Idealt bör provtagning dessutom ske av hela såret under standardiserade tryckförhållanden. Detta kan utföras endast med irrigationsteknik, vilket är en för omständlig metod för rutinbruk. Vid biopsi/vävnadsprovtagning desinficeras sårytan först med sprit. Därefter tas en biopsi som flamberas och vägs före homogenisering i standardiserad mängd vätska och utodling på fasta medier efter seriespädning. Metoden betecknas som gold standard och har använts för att att kvantifiera bakteriemängd före delhuds-transplantation vid brännskador. Metodens omständlighet och traumatiska potential vid kroniska sår utesluter rutinmässigt bruk. Våra nuvarande provtagningsrutiner för misstänkt infekterade sår med olika varianter av bomullspinne i geltransportrör bygger på en cirka 50-årig tradition. Vetenskaplig utvärdering av denna standardmetod är bristfällig och delvis motsägelsefull. Från reproducerbarhetsstudier i öppna sår har variationen beräknats till 1,5-1,7 log 10 CFU (95 % c.f.) medan motsvarande siffra för vävnadsbiopsiteknik är 1,3 log 10 CFU. Vid kontamination av operationssår ligger bakterierna till synes slumpvis fördelade i områden med hög bakterietäthet respektive områden med låg bakterietäthet. Sådan ojämn fördelning tycks också förekomma vid etablerade 122
infektioner, vilket förutom initialt ojämn kontamination kan ha med lokala sårfaktorer under kolonisationsfasen att göra. Vid en vetenskaplig utvärdering brukar därför provtagningen omfatta hela såret för att fånga alla förekommande mikrober, d.v.s. hög sensitivitet eftersträvas. Provtagningen i kliniken är mer inriktad på att hitta etiologiskt agens, d.v.s. hög specificitet eftersträvas. Prov tas då i lesionskanten, d.v.s. på gränsen mellan frisk och infekterad vävnad. Trots brister med fiberarmerad pinne kan konstateras: att detta är referensmetoden för rutinprovtagning av öppna sår, att metoden kan optimeras med omsorgsfull provtagning, att högre sensitivitet erhålles med eluering av bakterier i vätska före utodling på fasta medier. Den ständigt återkommande frågan hur ytodlingen återspeglar vad som pågår djupare i vävnaden saknar ett entydigt svar. Inom svensk mikrobiologi är direktmikroskopi av pus och vävnadsbiopsi ej den självklara rutin som återfinns i det anglosaxiska området. De kliniska kollegornas intresse för detta har dock ökat i takt med den ökade frekvensen av fasciiter. Laboratorierna har standardiserade och validerade metoder för analys av prov. Dessa metoder förutsätter att prov tas på rätt indikation samt att provtagning och transport utförs korrekt. Om den preanalytiska delen av vårdkedjan inte fungerar tillfredställande, kan inte laboratoriet trots hög kvalitet på analysarbetet producera adekvata resultat som är till nytta för vården av patienten. Kommunikationen mellan laboratoriet och kliniken är viktig för analysresultatet. Laboratoriet måste få viktiga upplysningar om patientens kliniska tillstånd och eventuell antimikrobiell behandling. Laboratoriet måste också få uppgifter om provmaterial och om någon särskild undersökning önskas utförd. Ju mindre information som lämnas desto svårare blir det för laboratoriet att korrekt tolka analysresultatet och relatera detta till vården av patienten. Det kliniska laboratoriet ska därför upprätta och tillhandahålla provtagningsföreskrifter för sina uppdragsgivare. Både den behandlande läkaren och den provtagande personalen måste få kunskaper om indikationer för och begränsningar i analysen samt korrekt provtagnings- och transportmetod för en optimalt utnyttjad laboratorieanalys. Prov för allmän bakteriologisk odling innehåller oftast levande mikroorganismer med mindre eller större sjukdomsframkallande förmåga. Det är därför av yttersta vikt att nedanstående punkter beaktas vid remisskrivandet och provtagningen: Kliniska remissuppgifter. Den stora variationen vad gäller den transienta/residenta floran och mikroorganismernas sjukdomsframkallande förmåga på 123
olika delar av kroppen och vid olika sjukdomstillstånd, gör att det kliniskt mikrobiologiska laboratoriet behöver stringenta kliniska uppgifter (se analysbeställning/remiss) på remissen för att kunna utföra analysen och tolka analysresultatet. Prov ska tas vid misstänkt infektionsfokus där koncentrationen av sjukdomsframkallande mikroorganismer sannolikt är störst. Vad gäller provtagning från andra lokaler har exempelvis blododling ett högt prediktivt värde och kan ge vägledning om var infektionen finns. Prov ska tas så att det inte förorenas av ovidkommande bakterier och så att tillräcklig känslighet (d.v.s. bakterierna ska kunna fångas) i undersökningen uppnås. Prov ska transporteras så att överlevnaden av de infektionsorsakande mikroorganismerna gynnas, överväxt av någon annan i provet förekommande art förhindras, samt så att läckage av potentiellt smittsamt material förhindras. Transportsubstrat för bakteriologiska prov a) Pinnprov Olika typer av transportsubstrat avsedda för kliniskt bakteriologiska prov tagna med fiberarmerad provtagningspinne finns kommersiellt tillgängliga. Dessa baseras huvudsakligen på Stuarts medium från 1940-talet, vilket senare modifierats för bättre överlevnad av bland annat gonokocker, men också för att bättre bibehålla balansen mellan olika bakteriearter när provet innehåller blandflora. Amies modifiering av Stuarts medium är idag det mest använda. Stuarts medium innehåller glycerofosfat, vilket kan metaboliseras av vissa koliforma bakterier med risk för tillväxt under transporten. Glycerofosfat har ersatts av oorganiskt fosfat i Amies medium. Koltillsats (charcoal), vilken neutraliserar toxiska fettsyror och absorberar fria radikaler och på så sätt förbättrar överlevnaden av olika mikrober, innebär att man slipper använda kolade provtagningspinnar vid provtagningen. Koltillsats i själva mediet är fortfarande kontroversiellt, och enligt en ny svensk studie där man studerat överlevnaden av olika bakteriearter i olika transportsubstrat tycks kolade pinnar vara att föredra framför kolat medium. I dag används dock oftast Amies kolade transportmedium vid våra laboratorier. Trots koltillsats i medium eller på pinnen är överlevnadstiden av vissa bakteriearter som pneumokocker och gonokocker vid förvaring i rumstemperatur begränsad, och prov bör därför inte stå längre tid än 24 timmar före utodling. Amies kolade transportmedium (fabrikat Copan, Brescia, Italien) anges som referenssubstrat. Provtagningspinnarna är försedda med rayon-tops (spunnen cellulosa) och finns i olika grovlekar för olika provlokaler. I certifierad batchprövning ingår ett flertal bakteriearter med angiven överlevnadstid i mediet på minst 24 timmar. 124
Recept, se under Bilaga 1 substrat, 13. transportsubstrat. b) Transportkärl för anaerobodling Vid misstanke om infektion med anaeroba bakterier är det ofta lämpligt att använda särskilda transportkärl. Visserligen överlever många anaeroba bakterier som Clostridium perfringens och Bacteroides fragilis under åtskilliga timmar i pus, särskilt om mängden överstiger 2 ml, och i större vävnadsbitar samt i pinnprov sända i Copan-rör. Prov bör dock vara utodlade samma dag det är taget. Mer krävande anaerober som fusobakterier kan också i många fall överleva flera timmar i pus. Om man vid provtagningen erhåller mindre provvolymer motsvarande <1 ml aspirat bör utodlingen på laboratoriet ske inom 30 minuter. Om detta ej är möjligt rekommenderas transport i anaerobt transportkärl i form av "gasad" flaska eller rör. Dock gäller även vid sådan transport att provet helst bör utodlas samma dag det är taget. Olika varianter av anaeroba transportkärl finns kommersiellt tillgängliga. I första hand rekommenderas "Anaerobflaska 20 ml, art.nr 9562360, Boule Diagnostik AB", vilken är en membranförsedd transportflaska gasad med kväve och utan medium. Vid misstanke på polymikrobiella infektioner bör inte anrikningsbuljong komma ifråga som transportmedium p.g.a. risk för överväxt av snabbväxande bakterier. Vid ortopediska och andra infektioner då man inte förväntar sig polymikrobiell flora används ofta FAB eller thioglykollatbuljong för transport av fast material; dock saknas entydig dokumentation för denna rutin. 125
Tabell 5. Transportmateriel för olika provmaterial Transportmateriel Provmaterial resp. Förväntad floratyp (mono/polymikrobiell) Monomikrobiell Flytande material, sekret Aspirat Polymikrobiell Aspirat ej möjligt Provtagningsset med kolat transportmedium Anaerob transportflaska FAB Sterilt rör, behållare Blod odlings- Flaskor (X) X X (X) X (X) X CAPD (PD)-vätska X (2x50mL) (X) Fast vävnad och ej kroppseget material Monomikrobiell Polymikrobiell X (X) X Fotnot: X= Rekommenderat provtagnings- och transportmateriel. (X) = Möjligt andrahandsalternativ. 126
Provtagning-praktiskt utförande I Allmän odling Sekret från öppen provlokal Analysprincip Aerob och anaerob odling (undantag se Anmärkningar). Provtagningsmateriel. Transportkärl Anaerob transportflaska, Provtagningsset med kolat transportmedium, Sterilt rör. Provtagning, utförande Sår: Prov ska tas från lesionskanten och inte ytligt eller från exsudatet eftersom det innehåller en tillblandning av den normala floran vilket försvårar diagnostiken på laboratoriet och kan ge missvisande resultat. Tvätta bort exsudat med sterilt vatten. Pinnprov kan användas. Snurra provtagningspinnen i botten av skadan. Stoppa ner pinnen i transportmediet. Fistlar: Tvätta bort exsudat med sterilt vatten. Prov ska tas från djupet, helst aspirerat prov via kateter, vilket sätts till anaerob transportflaska. Om detta inte är möjligt, kan pinnprov användas med reservation enligt ovan. Förvaring/ Transport Förvaras och transporteras i rumstemperatur. Provet får ej frysas. Anmärkningar Normalt odlas ej anaerobt från: Follikulit, Furunklar/karbunklar, Impetigo, Bullös impetigo, Ritters sjukdom (SSSS), Ektyma, Erysipelas, Erysipeloid, Puerperal mastit, Dakrocystit, Toxic shock syndrome (TSS), Infektioner i penis, prostatit, epididymit, bakteriell orkit, vagina, venösa bensår, brännskador, Okänd/Ingen diagnos samt sår utan närmare specifikation på remissen. Sekret från sluten provlokal med förväntad polymikrobiell floratyp; abscess, cellulit, pilonidalcysta, pus i buk, galla, peritonealvätska, pleuravätska Analysprincip Aerob och anaerob odling. Provtagningsmateriel. Transportkärl Anaerob transportflaska. Provtagningsset med kolat transportmedium. Sterilt rör. 127
Provtagning, utförande Anaerob transportflaska: Desinficera huden. Aspirera material och sätt detta till transportflaskan. Provtagningsset med kolat transportmedium (kan användas om provet tas under sterila förhållanden): Desinficera huden. Incidera skadan. Snurra provtagningspinnen i botten av skadan. Stoppa ner pinnen i transportmediet. Sterilt rör: Desinficera huden. Aspirera material och sätt detta till transportkärlet. Förvaring/Transport Förvaras och transporteras i rumstemperatur. Provet får ej frysas. Normalt sterila kroppsvätskor med förväntad monomikrobiell floratyp: amnionvätska, ascites, ledvätska, perikardvätska, synovialvätska (bursa) Analysprincip Aerob och anaerob odling. Provtagningsmateriel. Transportkärl Aerob + Anaerob blododlingsflaska. Sterilt rör utan tillsatser, om direktmikroskopi önskas. Provtagning, utförande Desinficera huden om perkutan provtagning. Aspirera eller incidera och ta material och sätt detta till transportkärlet. Förvaring/Transport Förvaras och transporteras i rumstemperatur. Provet får ej frysas. Fast vävnad, biopsi; ej kroppseget material (kärlkatetrar, skruvar, implantat), förväntad monomikrobiell flora Analysprincip Aerob och anaerob odling. Provtagningsmateriel. Transportkärl FA- buljong. Sterilt rör utan tillsatser. Provtagning, utförande Desinficera huden. Ta material och sätt detta till buljongröret under sterila betingelser. Förvaring/Transport Förvaras och transporteras i rumstemperatur. Provet får ej frysas. 128
Fast vävnad, obduktionsmaterial; ej kroppseget material (spiral, dränage), förväntad polymikrobiell flora Analysprincip Aerob och anaerob odling, dessutom förlängd odling vid spiral. Provtagningsmateriel. Transportkärl Sterilt rör, behållare. Provtagning, utförande Placera materialet i röret/behållaren. Förvaring/Transport Förvaras och transporteras kylt, 2 8 C. Provet får ej frysas. CAPD (PD)- dialysvätska Analysprincip Aerob, anaerob odling, svampodling. Provtagningsmateriel. Transportkärl 2 st 50 ml centrifugrör. Aerob + Anaerob blododlingsflaska. Provtagning, utförande Desinficera påsen. Aspirera material och sätt detta till var sitt centrifugrör. Förvaring/Transport Förvaras och transporteras i rumstemperatur. Provet får ej frysas. Anmärkning Aerob samt anaerob blododlingsflaska används med gott resultat vid bakteriologiska laboratorier. Sammanlagt har 2x10 ml prov tagits vid varje provtagningstillfälle. Sekret från cervix, vulva, vagina Analysprincip Aerob odling. Provtagningsmateriel. Transportkärl Provtagningsset med kolat transportmedium. Provtagning, utförande Cervix: Snurra provtagningspinnen i cervixkanalen. Stoppa ner pinnen i transportmediet. Vulva, vagina: Snurra försiktigt provtagningspinnen på slemhinnan. Stoppa ner pinnen i transportmediet. Förvaring/ Transport Förvaras och transporteras i rumstemperatur. Provet får ej frysas. 129
Anmärkningar Speciell provtagning för N. gonorrhoeae, C. trachomatis. Odling på prov från vagina eller vulva kan vara indicerat hos prepubertala flickor samt vid svampfrågeställning. II Speciell odling GBS-odling-övervakningsodling Provtyp Sekret vagina (introitus) och rektum. Provtagningsmateriel. Transportkärl Provtagningsset med kolat transportmedium x 2. Provtagning, utförande Ta prov från introitus vaginae respektive rectum med var sitt pinnprov. Stoppa ner pinnen i var sitt transportmedium. Begär GBS-odling på remissen. Förvaring/Transport Förvaras och transporteras i rumstemperatur. Provet får ej frysas. Specifik odling Actinomyces spp, Bartonella spp, Borrelia spp, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, Leptospira spp, Nocardia spp, Streptobacillus moniliformis, Bacillus anthracis, Brucella spp, Burkholderia mallei och pseudomallei, Francisella tularensis, Rickettsia spp, Yersinia pestis, Provtyp. Provtagningsmateriel. Transportkärl. Varierande, se Agens associerade med specifika Provtagning, utförande. sjukdomstillstånd respektive Klass 3 organismer. Förvaring/Transport. 130
Specifik odling MRSA, VRE, multiresistenta gramnegativa stavar Provtyp. Provtagningsmateriel. Transportkärl. Provtagning, utförande. Förvaring/Transport. Varierande, se www.srga.org Specifik odling; Sexuellt överförbara sjukdomar Provtyp. Provtagningsmateriel. Transportkärl. Varierande, se referensmetodik I 6. Provtagning, utförande. Förvaring/Transport. III Mikroskopi Direktmikroskopi; Gramfärgning, Acridinorangefärgning Provtyp Sekret,Vävnad. Provtagningsmateriel. Transportkärl Objektglas. Anaerobt transportkärl. Steril behållare utan tillsatser. Provtagning, utförande Ta prov enligt respektive provlokal och applicera materialet på objektsglaset. Alternativt kan materialet skickas till laboratoriet i transportmedium eller sterilbehållare. Förvaring/Transport Förvaras och transporteras i rumstemperatur. Provet får ej frysas. Besträffande diagnostik av bakteriell vaginos inklusive gramfärgning av vaginalutstryk se I 6. 131
Transport För transportanvisningar hänvisas till Packa Provet Rätt, som återfinns i ny upplaga på SMIs hemsida: www.smittskyddsinstitutet.se. Sök under Publikationer övriga trycksaker. 132
Ankomstkontroll på laboratoriet Kontrollera; att provkärlens/objektglasens märkning och antal överensstämmer med remiss. att beställare finns angivet. att rekommenderat provmaterial tagits till undersökningen. att rekommenderad transporttid ej överskridits. Avvikelser från ovanstående bör föranleda diskussion med beställaren. Om behandlande läkare anser nytt prov inte kan tas och att analysen ska utföras och rapporteras trots felaktigheter på det inkommande provet, ska felkällorna kommenteras i laboratorierapporten. 133
Provsättning Allmän odling, referensmetodik 1. Aerob odling Alla typer av prov, definierade i tabell 6, odlas primärt på blodagar, hematinagar och CLED-agar. I förekommande fall sätts prov också till anrikningsbuljong, FAB. Prov som anländer till laboratoriet i blododlingsflaskor, inkuberas upp till 10 dygn och sekundärsprids närhelst indikation till växt föreligger. Sådana prov som utgörs av fast vävnad etc., vilka överförs till anrikningsbuljong, sekundärsprids på agarplattor av samma sort. Buljongen inkuberas totalt 10 dygn. 2. Anaerob odling, rutinnivå Metoden avser miniminivå för anaerob odling som i förekommande fall kompletterar aerob odling, se också tabell 6, fotnot 4. Prov inokuleras på anaeroba blodplattor, FAA (se nedan), som görs semiselektiva genom applikation av aminoglykosid- och metronidazollappar i primärstryket (se tabell 6, fotnot 5). Inokulera även anaerob buljong (FAB) som inkuberas aerobt eller anaerobt. De anaeroba blodplattorna bör vara prereducerade eller färska. Inokulering sker i anaerobbox (referensmetod), men aerob provsättning med sekundär inkubering i klocka med gasgenererande kuvert som t.ex. Anaerogen (OXOID) eller i klocka med evakueringssystem är accepterad alternativ metodik. Med kuvert erhålls god anaerobios tillräcklig för flertalet kliniskt relevanta anaeroba bakterier. Med resazurin som indikator garanteras redoxförhållanden 110 mv. Avläs dag 2 eller efter medicinsk bedömning. Observera att anaerobt inkuberade plattor inte bör exponeras för luft under de första 48 timmarna. Vissa långsamväxande arter, hit hör peptostreptokocker och svartpigmenterade gramnegativa stavar som Porphyromonas, Prevotella, och Bilophila kan behöva inkuberas ytterligare en eller flera dagar för detekterbara kolonier. Andra anaeroba bakterier, t.ex. Actinomyces kan behöva 7-10 dagars inkubationstid. FAB granskas för växt dagligen upp till 10 dygn. Den förenklade anaeroba odlingen är med beskrivna förbehåll fullt acceptabel i rutindiagnostiken. Det enskilda laboratoriet definierar utifrån denna miniminivå eventuell modifiering av anaerobdiagnostiken, innefattande förlängd inkuberingstid, bruk av selektiva medier (se nedan), särskilt i de fall anaerob odling speciellt begärts. 3. Anaerob odling, jämförelsenivå Metoden bör användas vid studier men kan även användas i rutinen efter särskild medicinsk bedömning. Prov inokuleras på prereducerade eller färska anaeroba 134
blodagarplattor, d.v.s. FAA, samt två typer av selektiva FAA; kana-vanko-agar och neomycinagar (enligt bilaga 1). Inokulera även anaerob buljong (FAB) i förekommande fall och inkubera denna anaerobt. För anaerob miljö används anaerobbox i vilken all hantering av provet sker (miljö 10 % H 2, 5-10% CO 2, 80-85 % N 2. Alternativ är inkubering i någon typ av klocka (se under punkt 2). Inkubera anaeroba plattor och eventuell buljong 10 dygn. Daglig avläsning. Speciell odling, referensmetodik Val av medier, atmosfär, temperatur och inkubationstid beskrivs i tabell 7. 135
Tabell 6. Allmän aerob och anaerob odling, referensmetodik Inkubationsatmosfär (35-37 C), tid (dygn) Ae/A Blododl.- flaska Blodagar Luft Hematin agar 4 CLEDagar Luft Anaerob Blod- 4, 5, 6 agar Anaerobt FAB Ae/An CO 2 Sekret från öppen provlokal; sår 1, fistel 2 2 2 2/10 Sekret från sluten provlokal med förväntad polymikrobiell floratyp;+ abscess, cellulit, pilonidalcysta, pus i buk, galla, peritonealvätska, pleuravätska 2 2 2 2/10 10 Normalt sterila kroppsvätskor med förväntad monomikrobiell floratyp; amnionvätska, ascites, 10 ledvätska, perikardvätska, synovialvätska, (bursa) Subkultivering vid växt i blododlingsflaskor 2 2 2 2/10 Fast vävnad, biopsi, ej kroppseget material (kärlkatetrar, skruvar, 10 implantat) med förväntad monomikrobiell floratyp; Vävnad, biopsi samt ej kroppseget material. 2 2 2 2/10 Subkultivering av FA-buljong Fast vävnad, obduktionsmaterial, ej kroppseget material (dränage) 2 2 2 2/10 10 med förväntad polymikrobiell floratyp. Ej kroppseget material med förväntad polymikrobiell floratyp; 2 2 2 2/10 10 Spiral CAPD-vätska 2 2 2 2/10 10 Sekret, vulva, vagina 2 2 2 2 Sekret cervix 3 2 2 2 2/10 136
Fotnot till Tabell 6: 1. Anrikning i buljong av pinnprov anses ej indicerat. 2. Sexuellt överförbara sjukdomar, se referensmetodik I 6. Prediktivitet kan inte anges för patogenicitet för prov från nedre genitalia förutom vissa specifika frågeställningar (t.ex. Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis) samt för prov från prepubertala flickor med avseende på vanliga övre luftvägspatogener (t.ex. Haemophilus influenzae, S. pyogenes). Odling på prov från vagina kan vara indicerat hos prepubertala flickor samt vid svampfrågeställning. Se även speciell odling, GBS-odling. 3. Cervixodling kan spegla etiologier vid PID men har låg specificitet, se avsnitt infektioner i inre genitalia. Med tanke på normalflorans sammansättning och dominansen av anaerober vid rubbad normalflora torde även negativa svar av typen Ordinär flora kräva anaerob odling. 4. Vid följande kliniska remissuppgifter är det acceptabelt att enbart inkubera i luft samt CO 2 -miljö: Follikulit, Furunklar/karbunklar, Impetigo, Bullös impetigo, Ritters sjukdom (SSSS), Ektyma, Erysipelas, Erysipeloid, Puerperal mastit, Dakrocystit, Toxic shock syndrome (TSS), Infektioner i penis, Prostatit, Epididymit, Bakteriell orkit, Vagina, Venösa bensår, Brännskador, Okänd/Ingen diagnos. Övriga kliniska diagnoser inkuberas enligt ovan. 5. Lägg gentamicin (30 µg) - och metronidazol (10 µg) - lappar i primärstryket. Anaeroba bakterier växer oftast in i gentamicinzonen men ej i metronidazolzonen. 6. Selektiva anaeroba odlingsmedia inkuberas 10 dygn. Tabell 7. Speciell odling, referensmetodik GBS 2 1 Multiresistenta bakterier (MRSA, VRE, multiresistenta gramnegativa stavar) Actinomyces spp, Bartonella spp, Borrelia spp, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, Leptospira spp, Nocardia spp, Streptobacillus moniliformis, Bacillus anthracis, Brucella spp, Burkholderia mallei och pseudomallei, Francisella tularensis, Rickettsia spp, Yersinia pestis Inkubationsatmosfär (35-37 C), tid (dygn) Fårblodagar CO 2 GBSbuljong CO 2 MSA Luft VREbuljong Luft CLEDagar Luft 2 1 1 Se Agens associerade med specifika sjukdomstillstånd respektive Klass 3 organismer 137
Inokulering av medier Allmänt Inokulera alltid medier i en bestämd ordning med det minst selektiva mediet först. Provmaterialet kan kastas en vecka efter att provet primärodlats, eller efter medicinsk bedömning. Lämpliga metoder för provapplikation på agarplattor beskrivs i figur 7 och 8. Märk först agarplattorna med Labnr och inokuleringsdatum. Primärstryk i förekommande fall med provtagningspinne (fig 7) eller applicera ca 100 µl material på plattan (fig 8). Applikationsställen för eventuella gentamicin- och metronidazol-lappar Figur 7. Inokulering av agarplattor med provtagningspinne. Gör först ett rakt primärstryk. Stryk sedan vinkelrätt mot detta första stryk. Rotera pinnen under hela stryket. Återställ provtagningspinnen i transportröret. Sekundärstryk med plastinös enligt 2 och 3. Figur 8. Inokulering av agarplattor med flytande material. Primärstryk agarplattorna med plastinös enligt 1. Stryk först ett rakt stryk. Stryk sedan vinkelrätt mot detta första stryk. Sekundärstryk med plastinös enligt 2 och 3. 138
Inokulering av flytande medier Märk buljongrör med Labnr och inokuleringsdatum. Ta provmaterial med engångs plastpipett/sterila instrument och inokulera mediet. Direktmikroskopi Märk objektglas med Labnr. Ta provmaterial med engångs plastpipett/sterila instrument och stryk på objektglaset. Provmaterialrelaterad beskrivning Allmän odling Sekret pinnprov i transportrör Öppna transportröret och ta ut provtagningspinnen. Inokulera och inkubera medier. Sekret i anaerob transportflaska eller sterilt rör/kärl Homogenisera innehållet genom att vortexa eller vända det förslutna röret några gånger. Öppna röret och ta material med engångs plastpipett. Förslut röret. Inokulera och inkubera medier. Gör anaerob odling först. Vävnad i sterilt rör/kärl Öppna röret och ta material. Placera materialet i steril mortel. Homogenisera materialet i steril mortel. Tillsätt lite FA-buljong om provet är torrt. Inokulera och inkubera medier. Gör anaerob odling först. Vävnad i FA-buljong med tecken på växt vid ankomst Vortexa eller vänd det förslutna röret några gånger. Öppna röret och ta material med engångs plastpipett. Förslut röret. Inokulera och inkubera medier. Gör anaerob odling först. Vävnad i FA-buljong utan tecken på växt vid ankomst Inkubera röret. Inokulera och inkubera medier vid tecken på växt. Vid tveksamhet om växt är det lämpligt att gramfärga buljongen samt subkultivera till agarplattor. 139
Ej kroppseget material i FA-buljong Inkubera i 10 dygn i 35-37 C. Inokulera och inkubera medier vid tecken på växt. Vid tveksamhet om växt är det lämpligt att gramfärga buljongen samt subkultivera till agarplattor. Ej kroppseget material i sterilt rör/kärl med förväntad monomikrobiell floratyp Öppna röret och placera materialet i FA-buljong. Inkubera i 10 dygn i 35-37 C. Vid växt ta material från buljongröret. Inokulera och inkubera medier. Ej kroppseget material i sterilt rör/kärl med förväntad polymikrobiell floratyp (spiral, dränage) Placera under anaeroba och sterila betingelser. spiralen i steril petriskål och tillsätt FA-buljong. Skaka försiktigt. alternativt i FA-buljongrör och vortexa. Inokulera medier med hjälp av plastpasteurpipett. Gör anaerob odling först. Blododlingsflaskor med tecken på växt vid ankomst Odla ut vid ankomsten. Inokulera och inkubera medier. Tillsätt näringssubstrat enligt tillverkarens anvisningar. Inkubera flaskorna ett dygn i 36 C innan eventuell ny utodling (eller tills blododlingssystemet signalerar). Om det växer rikligt på direktutodlade medier behöver provet inte odlas ut igen. Blododlingsflaskor utan tecken på växt vid ankomst Tillsätt näringssubstrat enligt tillverkarens anvisningar. Inkubera flaskorna i 36 C och avläs i fem dygn (eller tills blododlingssystemet signalerar) innan eventuell utodling. Inokulera och inkubera medier. CAPD (PD), dialysvätska Desinficera dialyspåsen. Aspirera 100 ml dialysvätska och sätt till 2st 50 ml centrifugrör. Centrifugera båda rören i 2000 x g, 10 min. Sug av ovanvätskan med steril engångspipett av plast. Kasta ovanvätskan. Om endast liten mängd sediment, lämna kvar totalt ca 2 ml i röret för utodling. Inokulera från sedimentet: 0,1 ml/agarplatta samt 0,5 ml till 140
anrikningsbuljong. Lägg ev. material på ett märkt objektsglas för direktmikroskopi. Om blododlingsflaskor eventuellt använts, åtgärdas de enligt ovan. Speciell odling GBS-odling Inokulera provtagningspinnarna från vagina respektive rektum tillsammans i anrikningsbuljong för grupp B streptokocker, GBSbuljong. Inkubera buljongen i 1 dygn 35-37 C. Inokulera en fårblodagarplatta med den inkuberade buljongen. Inkubera plattan i 35-37 C. Avläs efter 1 dygn. Om ingen växt av GBS, reinkubera agarplattan 1 dygn. 141
Identifiering av bakterier i rutindiagnostik Allmänt Korrekt identifiering av mikroorganismer i ett prov är av största betydelse för bedömningen av den kliniska och epidemiologiska relevansen samt för resistensbestämningen av fyndet. Ett flertal tekniker, med varierande tidsåtgång och kostnad, finns tillgängliga. Adekvat taxonomisk nivå för rutinmässig identifiering av mikroorganismer avgörs av flera faktorer som kliniska data, provlokal och mikroorganismens patogenicitet. Omväxlande används familj, genus, species eller gruppbeteckningsnivå, vilket framgår av texten. I rutindiagnostiken av patientprov har processtiden samt kostnaden en avgörande betydelse för val av identifieringsmetod. De observationer och tester som tillämpas syftar till att beskriva bakterien så att den kan jämföras med andra tidigare identifierade bakterier. Den fenotypiska identifieringen baseras primärt på erfarenhet om de olika isolatens morfologiska utseende och eventuella lukt. Närmare genus/speciesbestämning sker via olika spårbara tester. För sällsynta, atypiska och speciella mikroorganismer (t.ex. de som omfattas av smittskyddslagen) krävs ofta kompletterande tester för korrekt identifiering. I fall där närmare genus/speciesbestämning ej anses kliniskt nödvändig används gruppbeteckningar baserade på växtsätt och kriterier närmare definierade under resp. avsnitt. För deskriptiva tolkningar av typ normalflora behöver ofta inga identifieringstest utföras. Ställningstagande till diagnostisk nivå (gällande generellt metodval och även i det enskilda fallet) bestäms av medicinskt ansvarig bakteriolog utifrån lokala erfarenheter och geografisk prevalens av olika mikroorganismer. I förslaget till minimikriterier har arbetsgruppen valt identifieringstester som är allmänt förekommande i svensk praxis. Med minimikriterier menas de fenotypiska egenskaper som är praktiskt och taxonomiskt användbara för avsedd nivå och som är adekvata för identifiering i sitt kliniska sammanhang. De uppfyller också de krav som ställs för artrelaterad resistensbestämning. De vanligaste patogenerna samt de bakterier som i många stycken betraktas som föga patogena vid rutinodlingar beskrivs på de följande sidorna. För mer ovanliga eller svåridentifierade isolat, hänvisas till särskilt avsnitt i denna bok samt till referenslitteratur eller referenslaboratorium. Vid validering av alternativ rutinidentifiering bör utvärderingen ske både mot här angivna tester och mot metodik som tillåter full speciesidentifiering. 142
143
Identifieringsbegrepp Genus/speciesbestämning Kliniskt intressanta och vanligt förekommande isolat, angivna med objektiva (t.ex. biokemiska tester) och subjektiva (t.ex. utseende och lukt) fenotypiska minimikriterier för rutindiagnostik. Ex. Staphylococcus aureus, Enterococcus species. Gruppbeteckning Icke taxonomiskt begrepp inom rutinbakteriologin. Beteckning för en, ibland homogen och ibland heterogen, grupp av bakterier med vissa gemensamma objektiva (t.ex. mikroskopi, biokemiska tester) och/eller subjektiva (t.ex. utseende och luktfenotypiska) egenskaper. Närmare artidentifiering anses inte nödvändig i rutindiagnostik. Ex. Koagulasnegativa stafylokocker (KNS), alfastreptokocker och difteroida stavar. Växtsätt I flera fall används begreppen aerob miljö, aerob bakterie, anaerob miljö etc. Begreppen syftar i första hand på olika mikroorganismers växtsätt i laboratoriemiljö i relation till syre. I aerob miljö är tillgången på syre god (>20 %) och koldioxidhalten 0,03 %. I anaerob miljö är syrehalten starkt reducerad, under 1 %, samtidigt som koldioxid och vätgas justerats till ca 10% vardera. Anaerob miljö uppnås effektivast i anaerobbox, där syrenivåer under 0,1 % kan erhållas. I klockor med kommersiella gasgenererande system uppnås god anaerobios (syrenivåer på 0,5 1 %) inom någon timme. Även i nedre delen av buljongrör där mediet innehåller små mängder agar och reducerande substanser som tioglykollat och cystein uppnås relativt god anaerobios t.o.m. i aerob miljö. I aeroba system föreligger oxiderande redoxförhållanden, vilket innebär att elektroner kan vandra till syre (elektronacceptor) som sålunda fungerar oxiderande. Man säger att aerob miljö, genom syrets egenskaper, kännetecknas av en hög redoxpotential, normalt ca +50 75 mv mätt med syre-väte elektroder. I frånvaro av syre föreligger reducerande redoxförhållanden och låg redoxpotential, idealt 250 mv. I mikroaerofil miljö är syrehalten reducerad jämfört med aerob miljö, med syrenivå på ca 7 % och koldioxidnivå på ca 14 %. Syntesen av makromolekyler kräver tillgång till energi. Denna frigörs i aerob oxiderande miljö under elektronvandringen i den metabola elektrontransportkedjan, aerob respiration, med syre som terminal elektronacceptor. I anaeroba system kan energi inte frigöras i en elektrontransportkedja. I sådan miljö tillgodogör sig mikroorganismerna energi genom anaerob fermentation som är en direkt enzymatisk attack på socker. Denna typ av metabolism är långt mindre effektiv än 144
den aeroba elektrontransporten vad avser mängden frigjord energi. Vid aerob respiration bildas skadliga reaktiva komponenter som väteperoxid, superoxid och hydroxylradikaler. Aeroba bakterier skyddar sig mot dessa med olika enzymsystem som superoxid-dismutas och katalas. De flesta anaeroba bakterier saknar sådana skyddande enzymer och dör i närvaro av syre. Vissa aerotoleranta anaeroba bakterier skyddar sig med NADH-oxidas som med vätgas omvandlar syre till vatten. Definitioner Obligat (strikt) aerob; Växer bara vid god syretillgång med oxiderande redoxförhållanden (aerob miljö). Metabolism av typ aerob respiration, d.v.s. syre fungerar som terminal elektronacceptor. Exempel på sådana organismer är Acinetobacter, Moraxella och Pseudomonas... Obligat (strikt) anaerob; Växer bättre i frånvaro av syre under reducerande redoxförhållanden (anaerob miljö) än i aerob miljö. Metabolism av typ anaerob fermentation. De flesta kliniskt relevanta obligat anaeroba bakterier är relativt toleranta mot syre och kan växa vid syrenivåer på någon eller t.o.m. några procent. Hit hör Bacteroides, Prevotella, Veillonella och Clostridium perfringens. Vissa arter, t.ex. Clostridium haemolyticum, vissa isolat av Prevotella melaninogenica är intoleranta även mot små restmängder syre på nivåer från 0,1 %. Propionibacterium acnes kan växa vid endast lätt reducerad syrehalt i 5-10 % koldioxid. Vissa streptokockarter som metaboliserar med anaerob fermentation kan likväl växa också i aerob miljö. Dessa kallas aerotoleranta anaerober. Fakultativt anaerob; Kan växa i aerob och anaerob miljö och växlar därvid mellan aerob respiration och anaerob fermentation. Exempel är stafylokocker, enterokocker, många streptokocker, Enterobacteriacae, Vibrio och Haemophilus. Mikroaerofil; Växer bara i miljöer med reducerad syrehalt där de dock använder aerob respiration. Exempel är Campylobacter species. (För fullständig definition av begreppen se Bergey s manual, 9 th ed, 1994. Se också bilaga 2). 145
Grampositiva kocker Stafylokocker Karakteristiskt koloniutseende. Växer både i aerob och anaerob miljö. Grampositiva kocker i klasar, diplo- eller tetradställning. Katalaspositiva. Speciesbestämning, minimikriterier Staphylococcus aureus Typisk kolonimorfologi. Dnas-positiv eller positiv agglutinationstest (clumping faktor, protein A) eller rörkoagulas (med steril EDTA kaninplasma) avläst efter 4 tim. Enstaka S.aureus blir positiva i rörkoagulas först efter ytterligare 20 tim i rumstemperatur som är referensnivå och bör användas bl.a. vid tveksamhet samt vid misstanke om MRSA. Anm. S. lugdunensis, S. saprophyticus och S. schleiferi kan ge positiv agglutinationstest; S. intermedius och S. hyicus som huvudsakligen förekommer hos djur kan ge positiv rörkoagulas efter 12 till 24 tim. Staphylococcus lugdunensis Typiskt gulaktigt koloniutseende på blodagar. Ofta karakteristisk lukt. Dnas ger en karakteristiskt liten diffus uppklarning. Ornitindekarboxylaspositiv. Anm. Kan uppvisa positiv agglutinationstest för S. aureus. Rörkoagulasnegativ. Staphylococcus intermedius Dnas-positiv. Koagulaspositiv. Positiv för pyrrolydonylarylamidas (PYR). Till skillnad från S. aureus är S. intermedius VP-negativ. Intressant vid djurbett. Gruppbestämning Koagulasnegativa stafylokocker (KNS) Dnas-negativ. Innefattar ett flertal arter såsom Staphylococcus capitis, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus warneri, Micrococcus species. Övrigt MRSA: Isolatet verifieras med avseende på nuc- och mec-a-gen samt typas epidemiologiskt. 146
Tabell 8. Sammanfattande tabell för speciesbestämning av stafylokocker Koagulas Dnas Clumping faktor Ornitin- dekarboxylas PYR VP Staphylococcus aureus + + + - - + Staphylococcus lugdunensis - ± ± + + + Staphylococcus intermedius + + ± - + - Enterokocker och Streptokocker Karakteristiskt koloniutseende.växer både i aerob och anaerob miljö. Grampositiva kocker i kedjor eller i diploställning. Katalasnegativa. Speciesbestämning, minimikriterier Enterococcus faecalis Typisk kolonimorfologi. Växer på 6,5 % NaCl-agar. Positiv för pyrrolydonylarylamidas. Galla-eskulinpositiv. Tellurit (konc. 0,04 %) positiv. Arabinosnegativ. Anm. Även Grupp D streptokocker blir positiva i galla-eskulin. Enterococcus casseliflavus kan vara positiva för tellurit (<3 %). Enterococcus faecium Växer på 6,5 % NaCl-agar. Positiv för pyrrolydonylarylamidas. Gallaeskulinpositiv. Tellurit ( konc. 0,04 %) negativ. Arabinospositiv. Anm. Även Grupp D streptokocker blir positiva i galla-eskulin. Streptococcus pneumoniae, pneumokocker Mukoida eller navlade kolonier med alfahemolys. Optochinkänslig (gränsvärde enligt tillverkaren). Anm. Gall-löslighetstest (2 % eller 10 %) positiv, vilket kan användas som kompletterande undersökning, speciellt hos pneumokocker med nedsatt penicillinkänslighet eller vid svårbedömd optochinzon. Streptococcus pyogenes, grupp A Streptokocker (GAS) 147
Betahemolys på blodagar. Stora kolonier med påvisbart Lancefieldantigen A. Streptococcus agalactiae, grupp B Streptokocker (GBS) Varierande hemolys (alfa, beta eller ingen) på blodagar. Lancefield-antigen B påvisbart eller positiv CAMP-test. Gruppbestämning Enterokocker Växer på 6,5 % NaCl-agar. Positiv agglutinationstest för Lancefield D. Gallaeskulinpositiv (observera att även grupp D streptokocker blir positiva). Grupp C Streptokocker (GCS) Stora betahemolyserande kolonier med positivt agglutinationstest för Lancefieldantigen C. Anm. VP-negativ. Grupp G Streptokocker (GGS) Stora betahemolyserande kolonier med positivt agglutinationstest för Lancefieldantigen G. Anm. VP-negativ. Streptokocker tillhörande Streptococcus milleri-gruppen Typisk kolonimorfologi ofta nålspetsstora (pinpoint). Växer bäst i CO 2 -miljö.varierande hemolys (alfa, beta eller ingen) på blodagar. Påvisbar agglutination för Lancefieldantigen A, C, G, H eller F. VPpositiv. Innefattar Streptococcus anginosus, Streptococcus constellatus, Streptococcus intermedius. Typas till speciesnivå (kommersiella kits) vid kliniskt intresse. Anm. Stor variation i koloniutseende och hemolys. Ofta typisk lukt av smörkola. Grupp D Streptokocker (GDS) Ingen växt på 6,5 % NaCl-agar. Positiv på galla-eskulinagar. Negativ PYR-test. Påvisbar agglutination för Lancefield-D-antigen. Inkluderar exempelvis Streptococcus bovis och Pediococcus. Anm. Av intresse vid septikemi. 148
Alfastreptokocker Varierande hemolys (alfa eller ingen) på blodagar. Innefattar ett flertal arter såsom Streptococcus mitis, Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguis, Granulicatella species, Gemella species, Aerococcus species., Stomatococcus species, Lactococcus species. Benämningen kräver att arterna under speciesbestämning är uteslutna via subjektiva eller objektiva metoder. Övrigt VRE (vankomycinresistenta Enterococcus faecalis eller Enterococcus faecium). VRE är orörliga. Isolatet skall verifieras, f.n. med avseende på van A -och van B-gen samt typas epidemiologiskt. Anm. Växer på 6,5 % NaCl-agar. Positiv pyrrolydonylarylamidas. Positiv i agglutinationstest för Lancefield D. Galla-eskulinpositiv (observera att även andra grupp D streptokocker blir positiva). Tellurit positiv/negativ. van C förekommer hos vissa rörliga enterokocker (E. casseliflavus, E. Gallinarium). Tabell 9. Sammanfattande tabell för speciesbestämning av enterokocker/streptokocker Galla-eskulin Växt i 6,5 % NaCl Lancefieldgrupp Optochinkänslig Gall-löslighetstest PYR Tellurit (0,04 %) Arabinos CAMP- test Rörlighet VP Enterococcus faecalis + + D - - + + - - - + Enterococcus faecium + + D - - + - + - - + Streptococcus pneumoniae - - - + + -* - - - - Streptococcus pyogenes - - A - - + - - - - - Streptococcus agalactiae - - B - - - - - + - + *= Vissa stammar av S. pneumoniae kan vara PYR-positiva. 149
Grampositiva stavar Speciesbestämning, minimikriterier Bacillus species, tillhörande cereus-gruppen Fakultativt anaeroba. Sporbildare. Katalaspositiv. Lecitinaspositiv (äggplatta). Se även Klass 3 organismer. Bacillus species, ej tillhörande cereus-gruppen Aeroba. Sporbildare. Katalaspositiv. Lecitinasnegativ (äggplatta). Listeria monocytogenes Typisk kolonimorfologi. Betahemolys på blodagar. Katalaspositiv (finns undantag). Ej sporbildande ibland kockoida grampositiva stavar. Rörlig. Eskulinpositiv. VP-positiv. Anm. Positiv CAMP-test på fårblod (L. monocytogenes hemolys är förstärkt nära indikatorstammen S. aureus). API är ofta av värde. Bildar syra från ramnos men inte från xylos Erysipelothrix rhusiopathiae Tunna filamentösa grampositiva stavar. Ej sporbildare. Katalasnegativ. H 2 S-produktion i TSI-rör. Orörlig. Eskulinnegativ. Anm. API Coryne kan vara av värde. Rhodococcus equi Växer strikt aerobt. Grampositiva kockobaciller, katalaspositiv. Ej sporbildare. Växer med laxköttsfärgade kolonier. Gruppbestämning Difteroida stavar Grampositiva stavar med pleomorft utseende. Innefattar ett flertal arter såsom Brevibacterium species. Corynebacterium minutissimum, Corynebacterium species, Arcanobacterium species, Rothia species, aeroba actinomyceter, Gardnerella species m.fl. Benämningen kräver att arterna under speciesbestämning och övrigt är uteslutna via subjektiva eller objektiva metoder. Övrigt Corynebacterium diphtheriae Se Agens associerade med specifika sjukdomstillstånd. Nocardia species Se Agens associerade med specifika sjukdomstillstånd. 150
Gramnegativa kocker Växer bäst i CO 2 - miljö. Oxidas- och katalaspositiva. Speciesbestämning, minimikriterier Neisseria gonorrhoeae (Gonokocker) Se referensmetodik I 6. Neisseria meningitidis (Meningokocker) Se referensmetodik I 9. Gruppbestämning Neisseria species Benämningen kräver att arterna under speciesbestämning är uteslutna via subjektiva eller objektiva metoder. Innefattar N. elongata, N. flavasceus, N. sicca, N. subflava m.fl. Gramnegativa stavar Enterobacteriaceae Växer i aerob och anaerob miljö. Oxidasnegativa. Glukosfermenterande med god växt på MacConkey agarplatta. Gruppbestämning Gramnegativa stavar tillhörande Enterobacteriacae Bakterier som uppfyller grundkriterierna. Innefattar bl.a. Edwardsiella, Enterobacter species, Klebsiella species, Proteus species, Serratia species, Citrobacter species, Hafnia alveii. 151
Tabell 10. Genus/speciesbestämning, minimikriterier för Enterobacteriacae LAC* VP ONPG IND URE H 2 S LD OD + + + - - - + + Enterobacter aerogenes + + + - + - - + Enterobacter cloacae +- - + + - - + +- Escherichia coli - - - + - - + +- Escherichia coli, ONPG - + + + + + - + - Klebsiella oxytoca + + + + + - + + Klebsiella ornitinolytica + + + - + - + - Klebsiella pneumoniae - - - + + - - + Morganella morganii - +- - - + + - + Proteus mirabilis** - - - + + + - - Proteus vulgaris - - - + -+ - - - Providentia species - - - - - + + + Salmonella, flera*** - - - - - - - + Salmonella Paratyphi A - - - - - + + - Salmonella Typhi - - - +- - - - - Shigella dysenteriae, flexneri, boydii - - + - - - - + Shigella sonnei - - + +- +- - - + Yersinia enterocolitica - - +- - + - - - Yersinia pseudotuberculosis * LAC= laktosjäsning, VP=Voges-Proskauer test, ONPG=O-nitrofenyl-b-D-galactopyranosid, IND=Indoltest, URE=Ureastest, H 2 S=H 2 S- bildning, LD=Lysindekarboxylas, OD=Ornitindekarboxylas, CIT=Citrat, ADO=Adonitol, ARA= Aranbinos, DN= Dnas. Salmonella, Shigella och Yersina verifieras enligt referensmetodik I 1. ** Indol-negativ, OD-negativ Proteus kan misstänkas vara P. penneri. Dessa är alltid ampicillinresistenta och maltospositiva. *** S. Virchow (grupp C) och S. Arizona kan vara lac+. 152