Jämförelsestudie mellan två metoder för analys av P-homocystein.

Transkript

1 Fakulteten för hälso- och livsvetenskap Examensarbete Jämförelsestudie mellan två metoder för analys av P-homocystein. Författare: Erica Svensson Ämne: Biomedicinsk Laboratorievetenskap Nivå: Grundnivå Nr: 2014:BL6

2 Jämförelsestudie mellan två metoder för analys av P-homocystein. Erica Svensson Examensarbete i biomedicinsk laboratorievetenskap, 15 högskolepoäng Filosofie Kandidatexamen Handledare: Docent, Överläkare, Ivar Vaara Dr Med. Vet, Susanne Widell Examinator: Dr Med. Vet, Maria Mattsson Avdelningen för Klinisk kemi Blekingesjukhuset, Karlskrona SE KARLSKRONA Institutionen för kemi och biomedicin Linneuniversitetet SE KALMAR Institutionen för kemi och biomedicin Linnéuniversitetet SE KALMAR Examensarbetet ingår i Biomedicinska analytikerprogrammet, 180 högskolepoäng SAMMANFATTNING Homocystein (Hcy) är en aminosyra som är starkt bunden till kroppens metabolism av metionin. När hcy tillbakabildas till metionin krävs närvaro av vitamin B 12 och folat. Analys av hcy i plasma (P-hcy) används vid misstanke om brist av någon av dessa vitaminer. Analysen kan utföras med ett antal olika metoder. I denna studie analyseras P-hcy immunologiskt med analysinstrumentet Immulite 2000 XPi (Siemens Healthcare Diagnostics Inc, Erlangen, Germany) och enzymatiskt med analysinstrumentet Cobas 6000 (Roche Diagnostics Scandinavia AB, Bromma, Sweden) med syfte att jämföra analysresultaten från de båda metoderna. Immulite 2000 XPi användes som referensmetod då denna validerats för klinisk analys av P-hcy. Studien genomfördes på 51 st slumpvis utvalda plasmaprover (24 kvinnor och 27 män) mellan 25 och 95 år. Utöver metodjämförelse genomfördes precisionsstudie med Cobas 6000 (20 replikat i två nivåer). Den enzymatiska metoden visade en hög precision. Vid låg nivå beräknades variationskoefficienten (CV) till 1,71 % (medelvärde: 8,32 µmol/l) och vid hög nivå till 2,54 % (medelvärde: 29,45 µmol/l). Korrelationen mellan de båda metoderna var r = 0,994, (y=0,977x + 1,4 och R 2 = 0,989). Ingen statistisk signifikant skillnad påvisades. Resultaten av P-hcy vid analys med Cobas 6000 låg dock 0,9 µmol/l (medelvärde) högre än resultat från Immulite 2000 XPi. Denna systematiska avvikelse bör inte vara av klinisk betydelse vid analys av P-hcy för utredning av eventuell sjukdom. Skillnaden kan dock vara relevant om analysen används för uppföljning av tidigare analysresultat. Resultat visar att båda metoderna kan användas för analys av P-hcy och att de kan användas som ett tillfredsställande diagnostiskt verktyg. Nyckelord Homocystein, Metodjämförelse, Immulite 2000 XPi, Cobas 6000

3 ABSTRACT Homocysteine (Hcy), an amino acid, is highly correlated to the metabolism of methionine. When hcy is regressed to methionine, vitamine B 12 and folic acid are required. Thus, measurments of hcy in plasma (P-hcy) may be used to determine deficiency of one of these. Analyze of hcy can be made with different laboratory methods. The purpose of this study was to compare results of P-hcy measured by a reference immunologic method with the analysis instrument Immulite 2000 XPi (Siemens Healthcare Diagnostics Inc, Erlangen, Germany) and those found by an enzymatic method with the analysis instrument Cobas 6000 (Roche Diagnostics Scandinavia AB, Bromma, Sweden). The study included plasma samples from 51 patients (24 women and 27 men) between 25 and 95 years old. The precision of the enzymatic method made by 20 replicats, each of two concentrations, showed at low level a variation of coefficient (CV) of 1.71 % (mean value: 8.32 µmol/l), and at high level of 2.54 % (mean value: µmol/l). The correlation between the two methods was r = 0.994, (y=0.977x och R 2 = 0.989), and no significant difference (p > 0.05) between methods was found. However, a systematic difference of 0.9 µmol/l higher concentrations of P-hcy was found for the enzymatic method. This difference is assumed to have no clinical significance. On the other hand, it might be essential if measures are used for follow-up of former medical condition. In conclusion, both methods above can be used for analysis of P-hcy and as diagnostic tools. Keywords Homocysteine, Method comparison, Immulite 2000 XPi, Cobas 6000

4 FÖRKORTNINGAR ALP = Alkaliskt fosfatas HCY = Homocystein MTHFR = Metyl-tetrahydrofolat reduktas SAH = S-Adenosylhomocystein SAM = S-Adenosylmetionin THF = Tetrahydrofolat

5 INNEHÅLLSFÖRTECKNING INTRODUKTION... 1 Homocystein... 1 Klinisk relevans... 2 P-homocystein... 3 Analysinstrument... 3 Immulite 2000 XPi... 3 Analysprincip... 3 Cobas Analysprincip... 4 SYFTE... 5 MATERIAL OCH METOD... 5 Studiepopulation... 5 Provmaterial... 5 Analys med Immulite 2000 XPi... 6 Reagens... 6 Kalibreringar och kontroller... 6 Provanalysering... 6 Analys med Cobas Beredning av instrument... 6 Reagens... 7 Kalibreringar och kontroller... 7 Provanalysering... 7 Precisionsstudie... 7 Statistiska beräkningar... 8 Etik... 8 RESULTAT... 9 Kalibreringar och kontroller... 9 Kontroll av frysta prover... 9 Precisionsstudie för Cobas Metodjämförelse DISKUSSION SLUTSATS TACK REFERENSER BILAGA I BILAGA II

6 INTRODUKTION Homocystein Homocystein (Hcy) är en naturligt förekommande aminosyra som beskrevs första gången 1932 av Butz och du Vigneaud (1). Utöver den karaktäristiska strukturen för en aminosyra med ett centralt kol bundet till ett väte, en karboxylgrupp och en aminogrupp utgörs hcy av en kolkedja med en inbunden sulfatgrupp (1). Se figur 1. Trots att hcy beskrivs som en aminosyra förekommer den inte i specifika bastripletter och finns därför inte heller i normalt förekommande proteiner. Ca 99 % av kroppens hcy finns i proteinbunden form. Den allra största delen (70 %) är bundet till albumin (1). F Figur 1. Strukturell uppbyggnad för homocystein. Bild modifierad från Bolander-Gouaille, C (1). Kroppens intracellulära koncentration av hcy är starkt bunden till metabolismen hos framförallt metionin men även cystein. Allt hcy som finns i kroppen syntetiseras genom demetylering av den essentiella aminosyran metionin, som tas upp via födan (1). Metionin innehåller en metylgrupp som kan aktiveras då metionin omvandlas till S- adenosylmetionin (SAM). Reaktionen medieras av adenosin trifosfat (ATP) och tre isoformer av enzymet metionin adenosyl transferas. Frekvensen av denna reaktion regleras av den intracellulära koncentrationen av SAM. SAM verkar som donator av metylgrupper och har funktion i en stor mängd kemiska reaktioner i kroppen. När SAM avger sin metylgrupp sker omvandling till S-adenosylhomocystein (SAH). Därefter hydrolyseras SAH och hcy bildas (1). Se figur 2. Hcy remetyleras därefter till metionin. Remetyleringen sker med hjälp av enzymet metioninsyntas (MS). Reaktionen kräver vitamin B 12 (co-faktor) och substratet metyltetrahydrofolat (THF). Metyl-THF är, precis som SAM, verksam som metyldonator vilket krävs för bildning av metionin (2). Substratet bildas i en reaktion där metylen- THF omvandlas. Reaktionen katalyseras av enzymet metylen-tetrahydrofolat reduktas (MTHFR) (1). Se figur 2. Nedbrytning av hcy sker i hepatocyterna genom omvandling till cystein under närvaro av vitamin B 6 (1, 3). Se figur 2. 1

7 Figur 2. Reaktionscykeln för metabolism av homocystein. Förkortningar: SAM: S-adenosylmetionin, SAH: S-adenosylhomocystein, MS: Metioninsyntas, THF: Tetrahydrofolat, MTHFR: Metyltetrahydrofolat reduktas. Bild modifierad från Bolander-Gouaille, C (1). Klinisk relevans Eftersom vitamin B 12 och folat (vitamin B 9 ) krävs för remetylering av hcy till metionin tyder förhöjda nivåer av hcy på brist av någon av dessa. Analys av hcy ger en direkt bild av den intracellulära koncentrationen och funktionen av båda vitaminerna och inte bara de enskilda koncentrationerna i blodbanan (3). Brist på vitamin B 12 och folat har påvisats ge ökad risk för bland annat benfrakturer (2). Brist av vitamin B 12 kan också leda till långsam celldelning på grund av negativ effekt på DNA-syntesen. Benmärg, mag-tarmmukosa och spermieproduktion anses mest utsatt och här kan stora celler med omogna cellkärnor påvisas (3). Brist på folat orsakas av minskat upptag från tarm eller ökad omsättning i kroppen. Anledningarna varierar men kan bland annat bero på malnutrition, anemier eller hemodialys (3). Att analysera hcy för utredning av brister på vitaminer är av ovan nämnda anledningar därför särskilt viktiga hos patienter med oförklarad anemi, neurologiska symptom eller subnormala koncentrationer gällande vitamin B 12 eller folat (3). Förhöjda nivåer av P-hcy ses också som en kardiovaskulär riskfaktor. Hcy har påvisats mediera ökad peroxidation av lipider och ökad frisättning av fria radikaler. Detta kan i sin tur leda till inflammation och endotelial dysfunktion i kärlväggarna vilket har setts öka hastigheten av bildning av arterioskleros som är direkt kopplat till kardiovaskulära sjukdomar (4). Dock finns nya studier som visar att genetiska defekter på MTHFR, som ger ökade nivåer av hcy, inte ger ökad risk för bildning av arterioskleros (5). För mer konkret information om hcys koppling till kardiovaskulära riskfaktorer krävs mer forskning inom området. 2

8 P-homocystein Analys av hcy sker fördelaktigt på EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)-plasma (6). Provtagning sker på patient efter 15 minuters vila och påverkas inte av födointag. Eftersom produktion av hcy fortsätter i erytrocyterna efter provtagning bör centrifugering (2000 G i 10 minuter) och avskiljning av plasma ske inom en timme efter provtagning (7). Analys sker på totala mängden hcy, vilket innefattar både den proteinbundna- och den fria fraktionen. Analysen kan genomföras med gaskromatografi, vätskekromatografi, immunologisk- och enzymatisk metodik (3). I denna studie används immunologisk- och enzymatisk metodik. Referensintervallet vid analys av P-hcy varierar beroende på ålder. För barn (0-15 år) = < 10 µmol/l, för vuxna (15-65 år) = < 15 µmol/l och för äldre vuxna (65 år) = < 20 µmol/l (7). Analysinstrument Immulite 2000 XPi Immulite 2000 XPi (Siemens Healthcare Diagnostics Inc, Erlangen, Germany) är ett helautomatiskt analysinstrument för kemiluminicent immunoanalys. Instrumentet har plats för 24 reagensförpackningar som kan förvaras ombord, eftersom reagenskarusellen är nedkyld till 2-8 C. Totalt kan 90 provrör placeras i instrumentet samtidigt, vilket möjliggör en analys av en större mängd prover parallellt (8). Immulite 2000 XPi är en validerad metod på Avdelningen för Klinisk kemi, Blekingesjukhuset i Karlskrona och används som referensmetod i denna studie. Analysprincip Metoden för analys av P-hcy är en kompetitiv metod och bygger på två inkubationscykler, i den första sker en provbehandling och i den andra sker en immunokemisk reaktion. Plasma från patientprovet förbehandlas med bovint SAHhydrolas och ditioteritol (DTT) som finns i reaktionslösningen. Proteinbundet hcy frisätts då och allt hcy i provet omvandlas till SAH. Detta sker under 30 minuters inkubation i 37 C (8, 9) Till plasman tillsätts en polystyrenkula ( 0,5 cm) täckt med en känd koncentration av SAH, samt en optimal mängd monoklonala SAH-musantikroppar märkta med alkaliskt fosfatas (ALP) som finns i reaktionslösningen. En tävlan om konjugerad bindning till antikropparna skapas då mellan SAH i provet och SAH på kulan. Detta sker under 30 minuters inkubationstid i 37 C. Alla antikroppskomplex och proteinrester som inte bundit in till polystyrenkulan tvättas därefter bort (8, 9). Se figur 3. 3

9 Figur 3. Under 30 minuters inkubation i 37 C uppstår konjugerade bindningar mellan Alkaliskt fosfatasmärkta monoklonala S-adenosylhomocystein (SAH)-antikroppar (mus) och antingen fritt SAH från plasmaprovet eller till SAH på polystyrenkulan. Beroende på mängden SAH i plasmaprovet förskjuts jämvikten åt något av hållen vilket utnyttjas för detektion av mängden hcy i plasmaprovet. Ett luminogent substrat (adamantyl-dioxetan-fosfat) tillsätts därefter till reaktionsröret. Substratet defosforyleras av ALP och en instabil produkt (dioxetan) bildas. När denna sönderfaller frisätts en foton och ljus avges. Om patientprovet innehåller stora mängder SAH kommer inbindningen av ALP-märkta antikroppar till kulan bli låg. Ljusstyrkan kommer då också att bli låg. Mängden ljus som emitteras är direkt proportionell till mängden ALP som bundit till kulan och därmed också omvänt proportionell mot mängden hcy som fanns i provet från början. Ljuset genereras av en fotomultiplikator, resultaten jämförs med kalibreringskurvan i instrumentet och mängden prov beräknas (8, 9). Cobas 6000 Cobas 6000 analyzer series (Roche Diagnostics Scandinavia AB, Bromma, Sweden) är ett multifunktionellt analysinstrument där analyser kan genomföras både kemiskt och immunologiskt. Enligt tillverkaren kan upp till 170 analyser/timme genomföras på den immunologiska modulen (cobas e601) (10). Motsvarande siffra för den kemiska modulen (cobas c501) är 1000 analyser/timme (10). Siffrorna är dock beroende på analystiden för den specifika analyten. Analysutbudet är stort och täcker bl.a. hjärtmarkörer, läkemedel och hormoner. Analysprincip P-hcy bestäms på Cobas 6000 modul c501, som är den kemiska delen. I detta fall genomförs analysen enzymatiskt. Tre olika reagens ger upphov till de enzymreaktioner som gör analys möjlig. Analysen sker genom att bundet hcy först omvandlas till fritt hcy. Den fria fraktionen kan då reagera med ett substrat, SAM, och bildar då metionin och SAH. Reaktionen katalyseras av enzymet homocystein-s-metyltransferas (HMTase). SAH kan därefter, genom ett antal kopplade enzymreaktioner, hydrolyseras till adenosin (Ado) och nytt hcy med hjälp av katalysatorn SAH-hydrolas. Genom hcys biologiska omvandlingscykel förstärks detektionssignalen proportionellt till mängden hcy i provet (10). Se figur 4. 4

10 Reaktionsförloppet fortsätter därefter omgående när Ado hydrolyseras till inosin och ammoniak. Ammoniak, tillsammans med NADH och 2-Oxoglutarat, kan sedan reagera med glutamatdehydrogenas vilket skapar omvandlingen av NADH till NAD +. Absorbansen mäts vid 340 nm och mängden hcy är indirekt proportionell till mängden NADH som omvandlats till NAD + (10). Se figur 4. Figur 4. Reaktionsschema för enzymatisk analys av P-hcy på Cobas c501. Förkortningar: HCY Homocystein, SAM S-adenosylmetionin, SAH S-adenosylhomocystein, Ado Adenosin, Ada Adenosindeaminas, HMTase - homocystein-s-metyltransferas, SAHase SAH-hydrolas, GLDH Glutamatdehydrogenas. Bilden är modifierad från Roche Diagnostics Scandinavia AB (10). SYFTE Syftet med studien var att jämföra analysresultat för homocystein i plasma från två metoder, en immunologisk (Immulite 2000 XPi, validerad) och en enzymatisk (Cobas 6000) och utvärdera hur väl metoderna korrelerar till varandra. MATERIAL OCH METOD Studiepopulation För studien valdes slumpmässigt 60 plasmaprover med hcy-analys beställt. Av dessa exkluderades nio stycken på grund av ålder (< 25 år). Av kvarvarande 51 personer var 24 kvinnor och 27 män med okänd anamnes. Åldersintervallet var mellan 25 år och 95 år med en medelålder på 62,4 år. Provmaterial Samtliga plasmaprover (n = 51) avkodades innan analys och märktes upp med nya nummer, specifika för studien. Analys av P-hcy med Immulite 2000 XPi (validerad metod) genomfördes på färsk plasma från EDTA-rör (Becton, Dickinson and Company, New Jersey, USA) som centrifugerats (2000 G i 10 min) och avskilts inom en timme. Plasman frystes i -20 C för att senare analyseras enzymatiskt med Cobas För att kontrollera att resultatet inte påverkats av frysning, analyserades fem plasmaprover på Immulite 2000 XPi både före och efter frysning och resultaten jämfördes. 5

11 Analys med Immulite 2000 XPi Reagens Homocysteine Bead Pack (L2HO12, Siemens Healthcare Diagnostics Inc.) och Homocysteine Reagent Wedge (L2HOA2, Siemens Healthcare Diagnostics Inc.) lotnummer 307, användes som reagens för analys. Dessa placerades på angivna platser i instrumentet, där de förvarades under hela studien (8). Kalibreringar och kontroller Homocysteine Adjustor (LHOL, LHOH, Siemens Healthcare Diagnostics Inc.) lotnummer 307, användes för kalibrering av instrument. Kalibratorerna levererades bruksfärdiga från leverantören och kunde användas direkt för kalibrering. I instrumentet fanns en förutbestämd masterkurva inlagd av tillverkaren. Denna masterkurva var en förutbestämd kalibreringskurva med bestämda värden för CPS (Counts Per Second). Tvåpunktskalibrering genomfördes och jämfördes med masterkurvans CPS varefter nödvändig justering genomfördes. Kalibreringskurvan blev därmed specifik för instrumentet och reagensloten. Den genererade kurvan användes sedan av instrumentet och gav underlag för koncentrationsbestämning av proverna (8). Kalibreringskurvan gav upphov till ett mätintervall från 2 50 µmol/l (9). Seronorm Immunoassay Liq L-1 (låg kontroll, 10,7 µmol/l) och L-2 (hög kontroll, 22,6 µmol/l) (Sero AS, Billingstad, Norway) användes som kontrollmaterial för analys av P- hcy. Kontrollerna levererades frystorkade. Efter upptining, spädning och alikvotering till nya rör (750 µl) kunde kontrollanalys genomföras (11). Kontroller analyserades inför analys av plasma varje dag, totalt nio dagar. Provanalysering Analys av P-hcy beställdes i instrumentets dataprogram. Proverna placerades i rackar och matades in i instrumentet. Analysen genomfördes som ovan beskrivet i två inkubationssteg. I det inledande steget pipetterades 15 µl plasma till en hitatchikopp där det blandades med bovint SAH-hydrolas och DTT (L2HOA2) (9). Samtliga reagensvolymer och koncentrationer var patenterade och därför inte kända. Under 30 minuters inkubation i 37 C frisattes allt bundet hcy. I nästkommande steg skedde inkubation under samma förhållande, nu med tillsatt polystyrenkula (L2HO12) täckt med känd bestämd koncentration av SAH och monoklonala SAH-musantikroppar märkta med ALP (L2HOA2). Efter följande tvätt tillsattes luminogent substrat vilket möjliggjorde ljusmätning och koncentrationsberäkning av hcy (9). Analys med Cobas 6000 Beredning av instrument Analysinstrumentet Cobas 6000 inställdes för analys genom nedladdning av applikation för den specifika analysen (HCYS, Roche Diagnostics Scandinavia AB), dess kalibrator och kontroller. Nedladdning utfördes efter specifikt lotnummer på reagens, kalibrator och kontroll. Kalibratorn kopplades till kalibreringsrack för möjliggöra kalibrering av reagenset (12). 6

12 Reagens Homocysteine Enzymatic Assay (Roche Diagnostics Scandinavia AB), referensnummer , Lot ( ) användes som reagens för analyserna. Reagenset levererades bruksfärdigt från tillverkaren och förvarades kylt i analysinstrumentet (5-12 C) (12). Kalibreringar och kontroller Homocysteine Kalibrator Kit (Roche Diagnostics Scandinavia AB) referensnummer , Lotnummer ( ) användes för kalibrering. Kalibratorn (ready-to-use) sattes i specifikt kopplat rack och placerades i instrumentet. Kalibreringen genomfördes i fem koncentrationspunkter (2,5, 5,0, 12,5, 25,0 och 50,0 µmol/l) vilket gav upphov till en kalibreringskurva och ett mätintervall (12). Kontroller analyserades innan provanalys. Homocysteine Control Kit C-1 (låg kontroll, 12,5 µmol/l) och C-2 (hög kontroll, 37,0 µmol/l) (Roche Diagnostics Scandinavia AB) (Code och ) användes. Kontrollerna placerades i rack. Korrekt kontrollanalys beställdes i instrumentet och kontrollerna analyserades (12). Analys av kontroller genomfördes totalt fem dagar. Innan plasmaproverna analyserades kontrollerades att samtliga kontrollresultat låg inom åsatt värde ± 2 standardavvikelser enligt handhavandebeskrivningar, Avdelningen för Klinisk kemi, Blekingesjukhuset i Karlskrona (13). Provanalysering Analys av P-hcy beställdes i dataprogrammet kopplat till Cobas 6000, där provrörets rack och specifika position fastställdes (12). Racken placerades i instrumentet och analyserades enzymatiskt enligt tidigare beskriven analysprincip. 14 µl plasma tillsattes i en specifik reaktionskyvett tillsammans med 176 µl av reagens 1 (R1, innehållande SAM (0,1 mmol/l), NADH (> 0,2 mmol/l) och 2-oxoglutarat (< 0,5 mmol/l)), 28 µl av reagens 2 (R2, innehållande HMTase (5,0 ku/l) och GLDH (10 ku/l)) och 20 µl av reagens 3 (R3, innehållande Ada (5,0 ku/l), SAHase (3,0 ku/l)) (10). Mängden NADH som omvandlats till NAD + absorbansmättes vid 340 nm, vilket gav upphov till resultatet för koncentrationen av P-hcy (10). Precisionsstudie Den enzymatiska metodens (Cobas 6000) precision (µmol/l) vid analys av P-hcy bestämdes med standardavvikelse (SD) och variationskoefficient (CV) från analys av två kontrollplasman (en låg och en hög koncentration) i tjugo replikat (14). 7

13 Statistiska beräkningar Analysresultaten från de båda metoderna jämfördes i ett korrelationsdiagram med en regressionslinje för att studera dess samband. Regressionslinjens ekvation, grad av linjärt samband (r - Pearsons korrelationskoefficient) och hur stor del av variationen i den beroende variabeln y som kan förklaras av den oberoende variabeln x (r 2 ) beräknades (14). En biaskurva konstruerades för detektion av eventuella systematiska avvikelser (14). Tvåsidigt oparat t-test (student s t-test) utfördes för att undersöka om resultaten från de båda metoderna vid analys av P-hcy avvek signifikant från varandra (14). Tvåsidigt parat t-test (Wilcoxons test) genomfördes på de plasmaprover som analyserades på Immulite 2000 XPi före och efter frysning (14). I båda fallen antogs H 0 till att ingen signifikant skillnad fanns. Signifikansnivån bestämdes till α = 0,05 (95 %). Då p (statistiskt resultatvärde) < α förkastades H 0 (14). Statistiska beräkningar genomfördes med Microsoft Office Excel 2011 Mac och GraphPad Prism 6. Etik Efter kontroll av kön och ålder hos patienterna vilkas plasmaprover användes i studien, avkodades proverna och kunde inte spåras. På detta sätt skyddades patienternas integritet på ett sätt som var förenligt med de krav som fanns enligt biobankslagen (15). 8

14 RESULTAT Kalibreringar och kontroller Instrumentgodkända kalibreringar genomfördes på båda instrumenten (Immulite 2000 XPi och Cobas 6000) innan analys av provmaterial. Resultat för analys av kontroller i två nivåer (hög och låg) visade att samtliga låg inom åsatt värde ± två SD. Se tabell I. Tabell I. Kontroller (µmol/l) för analys av P-hcy i två nivåer L-1 (låg 10,7) och L-2 (hög 22,6) för Immulite 2000 XPi (n = 9) och C-1 (låg 12,5) och C-2 (hög 37,0) för Cobas 6000 (n = 5). Samtliga låg inom åsatt intervall för respektive kontroll. Kontroll L-1 L-2 C-1 C ,6 22,8 12,77 36, ,2 21,3 12,77 37, ,6 23,8 12,70 35, ,6 22,6 12,20 36, ,1 22,7 12,59 35, ,2 22,7 7 11,1 22,7 8 11,6 23,3 9 10,7 21,5 Medel 10,74 22,60 12,61 36,32 SD 0,48 0,78 0,24 0,98 CV 4,5 % 3,5 % 1,9 % 2,7 % Åsatt ± SD 8,9 13,7 18,2 27,0 10,1 14,9 31,3 42,7 Kontroll av frysta prover Analys av P-hcy före och efter frysning genomfördes på fem prover med Immulite 2000 XPi (referensmetod). Ingen signifikant skillnad (p = 0,0625) före och efter frysning ses (tabell II). Medelvärde, SD och CV % beräknades för jämförelse av de båda analystillfällena. Inga skillnader ses. Tabell II. Resultat från plasmaprover (n = 5) vid analys av P-hcy analyserade före och efter frysning på Immulite 2000 XPi (referensmetod). Värden i µmol/l. Prov 1 Prov 2 Prov 3 Prov 4 Prov 5 Medel SD CV Innan frysning 13,9 11,5 11,9 12,3 18,2 13,5 2,8 20,3 % Efter frysning 13,7 11,9 11,8 12,3 18,0 13,4 2,6 19,2 % 9

15 Precisionsstudie för Cobas 6000 Precisionen för kontrollplasma 1 (låg nivå, 20 replikat) uttryckt som CV var 1,71 %. Medelvärdet beräknades till 8,32 µmol/l och SD till 0,14. Gällande kontrollplasma 2 (hög nivå, 20 replikat) beräknades CV till 2,54 %, medelvärdet till 29,45 µmol/l och SD till 0,74. Utvunna värden ses i bilaga I. Metodjämförelse Sambandet mellan resultaten från analys av P-hcy (n = 51) med Immulite 2000 XPi och Cobas 6000 ses i figur 5. Den linjära ekvationen för den totala studiepopulationen beräknades y=0,977x + 1,4 och r 2 = 0,989. Värden på r (Pearsons korrelationskoefficient) för totalpopulationen beräknades till 0,994. För delpopulationerna beräknades r = 0,998 (yngre) och r = 0,988 (äldre). Korrelationskoefficient nära 1,0 tyder på god korrelation mellan de båda metoderna. Detta ses oavsett åldersgrupp. Värden ses i bilaga II. 10

16 (µmol/l) 70,0 Cobas ,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 5a) Korrelation P-hcy, år y = 0,977x + 1,4 r² = 0,989 0,0 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 (µmol/l) Immulite 2000 XPi 5b) Korrelation P-hcy, (µmol/l) år Cobas ,0 60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 y = 0,973x + 1,056 r² = 0,996 0,0 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 Immulite 2000 XPi (µmol/l) (µmol/l) Cobas ,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 5c) Korrelation P-hcy, år y = 0,966x + 1,940 r² = 0,977 0,0 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 Immulite 2000 XPi (µmol/l) Figur 5. Samband mellan resultat för P-hcy (µmol/l) (n = 51) analyserat på Immulite 2000 XPi och Cobas Figur 5a visar den totala studiepopulationen, där ekvationen för regressionslinjen beräknats till y=0,977x + 1,4 och r 2 = 0,989. Figur 5b visar den yngre studiepopulationen (n =22, år). Regressionslinjens ekvation beräknades till y=0,973x + 1,056 och r 2 =0,996. Figur 5c visar korrelationen för den äldre studiepopulationen (n = 29, år). Regressionslinjens ekvation beräknades till y=0,966x + 1,940 och r 2 = 0,

17 För Cobas 6000 ses en systematisk avvikelse i analysresultat för P-hcy med något högre koncentrationer än från Immulite 2000 XPi. Avvikelser ses från +3,50 till -3,40 µmol/l. Medelavvikelsen är + 0,9 µmol/l för Cobas 6000 (Fig. 6). Utvunna värden ses i bilaga II. Differens Cobas Immulite 2000 XPi µmol/l 10,00 5,00 0,00-5,00 Biaskurva -10,00 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 Immulite 2000 XPi µmol/l Figur 6. Biaskurva för Cobas 6000 avvikelse från Immulite 2000 XPi. Förskjutning mot positiva värden för Cobas 6000 ses (medelavvikelse + 0,9 µmol/l) (n = 51). Statistiskt påvisades ingen skillnad mellan metoderna. Tvåsidigt, oparat t-test gav p = 0,725, p > α. H 0 behålls och ingen signifikant skillnad ses. DISKUSSION Syftet med studien var att jämföra resultat från analys av P-hcy från (n = 60) slumpvis utvalda patientprover med två olika metoder, en immunologisk (Immulite 2000 XPi) och en enzymatisk (Cobas 6000). Den första ansågs som referensmetod och var tidigare validerad för rutinanalys. 9 st plasmaprover exkluderades då dessa var från patienter < 25 år. Studien omfattade således 51 plasmaprover från patienter i åldersintervallet år. Precisionen vid analys med Cobas 6000 var tillfredställande med CV % på 1,71 % för kontrollplasma 1 och 2,54 % för kontrollplasma 2. Precisionen indikerar att metoden skulle kunna användas kliniskt. Metoden på Immulite 2000 XPi är validerad sedan tidigare och används i rutin. Precisionen för denna är därför sedan tidigare genomförd ( ). Precisionen ansågs då tillfredsställande för att användas i rutin enligt Metodverifiering Instrumentverifiering, Avdelningen för Klinisk kemi, Blekingesjukhuset i Karlskrona (16). 12

18 I tidigare studie av Cobas 6000 modul c501 har det påvisats att instrumentet är mycket stabilt med CV under 5 % hos ett stort antal analyser. Stabila resultat ses även vid beräkning av precision över flera dagar och vid beräkning av lutning av regressionslinje och dess skärning på y-axeln (17). Analys av P-hcy ingick inte i denna studie. Resultaten i denna studie från analys av P-hcy med Immulite 2000 XPi respektive Cobas 6000 visar god korrelation i alla åldersgrupper med korrelationskoefficienter på 0,994 för totalpopulationen, 0,998 =för yngre (25 60 år) och 0,988 för äldre (60-95 år). Korrelationen kan därmed anses god över ett stort åldersspann och det finns inget som tyder på att de biologiska förändringar som sker med ökad ålder är relevant för analys av P-hcy. Samtlig korrelation ses i figur 5a-c. I figur 6 ses biaskurvan över totalpopulationen. En övervägande positiv differens ses vid analys med Cobas 6000 (medelavvikelse = 0,9 µmol/l) vilket visade en systematisk skillnad med högre koncentrationer av P-hcy vid analys med enzymatisk metod (Cobas 6000). Statistiska beräkningar visar dock att det inte finns någon statistisk signifikant skillnad mellan resultaten från de båda metoderna. Den skillnad som ses skulle kunna bero på den frysning som genomförts mellan analys med immunologisk metodik (Immulite 2000 XPi) och med enzymatisk metodik (Cobas 6000). Det har dock påvisats i denna studie att frysning inte påverkar provmaterialet då fem plasmaprover analyserats på Immulite 2000 XPi före och efter frysning utan påvisning av statistiskt signifikanta skillnader, se tabell II. Denna del av studien genomfördes på Immulite 2000 XPi eftersom denna metod är validerad och används som referensinstrument i studien. Det finns även andra studier som styrker detta påstående. I två artiklar ansågs frysning av plasma för analys av P-hcy inte påverka analysresultatet (7, 18). Plasman kunde även förvaras fryst i flera år utan påverkan på hcy-koncentrationen (7). Även Roche Diagnostics och Siemens uttrycker i sina handhavandebeskrivningar, att frysning av plasma inte påverkar analysresultatet av P- hcy (9, 10). Studier har tidigare genomförts för jämförelse av resultat för analys av P-hcy med olika metoder. P-hcy analyserades till en början med HPLC (High Performace Liquid Chromatography), vilken var referensmetod i båda nedan nämnda studier. I en studie från 2002 jämförs HPLC med tre immunologiska tekniker. En av de immunologiska metodikerna som utvärderades var analys av P-hcy med Immulite 2000 XPi. Studien visar att samtliga tre metoder som studeras var tillförlitliga och korrelerade väl med validerad metod (19). Alla tre skulle kunna användas för klinisk tillämpning (19). I ytterligare en studie har liknande jämförelser mellan resultat från sex olika metoder genomförts (20). Fem av sex metoder ansågs ha tillräckligt god prestanda för att kunna användas. Immulite 2000 XPi var dock den sjätte metod som inte levde upp till prestandakraven i studien (20). Några resultat som tyder på detta finns dock inte i min studie. Studier där immunologisk metodik (Immulite 2000 XPi) jämförs med enzymatisk metodik (Cobas 6000) för analys av P-hcy har vad jag vet inte tidigare genomförts. 13

19 Den mindre systematiska skillnad som kan påvisas förväntas inte vara av kliniskt intresse. Vid utredningar där P-hcy används som diagnostiskt hjälpmedel bör inte en ökning av ca 1,0 µmol/l vara av klinisk betydelse. Referensintervallet är så pass brett att ca 1,0 µmol/l inte bör påverka om patienten anses sjuk eller frisk. Analysresultaten för P-hcy förväntas dessutom kompletteras med andra analyser och patientens kliniska bild. Ett analyssvar kan ses som ett stöd men är ej tillräckligt för att fastställa en diagnos. Vid uppföljning av tidigare värden är analys av P-hcy med samma metod viktig för att få helt jämförbara resultat. Analyssvar för P-hcy påverkas inte av hemolys i lägre koncentrationer (7). Detta påstående styrks även av Roche Diagnostics och Siemens i deras handhavandebeskrivningar (9, 10). Inte heller ikterus eller lipemi ska påverka analysresultaten. Enligt Roche Diagnostics ska analyssvaren inte heller påverkas av vardagliga läkemedelsintag i terapeutiska doser. Dock kan läkemedel som påverkar metabolismen hos hcy, t.ex. karbamazepin och fenytoin ge falskt för höga värden (10). Roche Diagnostics påstår också att det SAH som finns normalt i kroppen kommer att påverka analysresultaten. SAH-koncentrationer ses dock bara i mycket låga koncentrationer och påverkar därför inte tillräckligt för klinisk relevans (10). Analysresultat av P-hcy påverkas inte av stas vid provtagning (7). Däremot är centrifugering och avskiljning av plasman inom en timme högst relevant. Efter provtagning fortsätter erytrocyterna att producera hcy. Ökningen beräknas till ca 1 µmol/l per timme i rumstemperatur (7). På grund av detta är det också mer fördelaktigt att analys sker på plasma. Vid analys på serum (som också är möjlig) ökar koncentrationen av hcy under de 30 minuter som krävs för koagulation av blod i serumrör innan centrifugering (7). Könsberoende skillnader vid analys av P-hcy bör ej förekomma då referensintervallet är det samma oavsett kön. Viss sänkning av P-hcy kan dock ses hos kvinnor efter menopaus. Sänkningen är inte tillräcklig för att ge skilda referensintervall mellan kvinnor och män (3). Gravida kvinnor ses också ha lägre koncentrationer av hcy än normalt (3). Däremot är referensintervallet åldersberoende. Detta skulle kunna bero på avtagande metabol aktivitet hos äldre. Åldern på studiepopulationen begränsades till endast personer > 25 år. Studiematerialet i den yngre gruppen (< 25 år) var inte tillräckligt stort för att kunna användas för studien. Biologiska förändringar vid t.ex. pubertet skulle också kunna ge förändrade koncentrationer av hcy vilket gav ytterligare en anledning till att dra åldersgränsen något högre. De kalibreringar som genomfördes kunde genereras av instrumenten och en uppdaterad kalibreringskurva för den specifika reagensloten kunde skapas. Samtliga kontroller som analyserats under studien har legat inom uppsatta intervall (åsatt värde ± två standardavvikelser). Med godkända kontroller kan korrekta kalibreringar och analysresultat garanteras. Utan dessa godkända kontroller kan metodens riktighet och precision inte anses tillförlitlig och analysresultat lämnas då inte heller ut. 14

20 Analysresultat bör bedömas tillsammans med den enskilda patientens kliniska bild för att bedöma analyssvaren och dess kliniska relevans. Samtliga prover avkodades innan studiens början och analysresultaten har inte kunnat kopplas till de som lämnat proverna varför anamnes och diagnos inte var känd. Idag beräknas analys av P-hcy kosta 97 kr enligt Avdelningen för Klinisk kemi, Blekingesjukhuset i Karlskronas analysportal (21). De analyser som analyseras på Cobas 6000 s enzymatiska modul (Cobas c501) idag ligger också runt 100 kr vilket indikerar att analyskostnaderna för P-hcy är likvärda oavsett analysinstrument. De båda analyserna skiljs däremot markant från varandra gällande analystid. Analystiden för P-hcy på Immulite 2000 XPi är idag 68 minuter medan motsvarande tid för Cobas 6000 är 12 minuter. Idag analyseras P-hcy dock endast två gånger/vecka på avdelningen för Klinisk kemi, Blekingesjukhuset i Karlskrona. Den kortare analystiden är därför inte avgörande avseende ett kliniskt perspektiv. Om analysmängden av P-hcy skulle öka och fler analysdagar skulle vara nödvändigt är dock analys med Cobas 6000 fördelaktigt. Allt miljöfarligt avfall som uppkommit och hanterats under studiens gång har tagits tillvara på det sätt som ansetts lämpligt enligt Socialstyrelsen. Allt smittförande avfall har kasserats i avsedda behållare och sedan omhändertagits på ett korrekt sätt (22). SLUTSATS Ingen statistisk signifikant skillnad ses vid jämförelse av analysresultat av P-hcy analyserade med immunologisk metodik (Immulite 2000 XPi) och enzymatisk metodik (Cobas 6000). Metoderna korrelerar väl till varandra oavsett patientens ålder. Båda metoderna anses tillförlitliga och kan användas som diagnostiskt verktyg vid analys av P-hcy. TACK Jag vill rikta ett stort tack till alla som hjälpt mig under arbetets gång. Ivar Vaara, handledare Klinisk Kemi Karlskrona, för medicinsk och vetenskaplig vägledning. Susanne Widell, handledare Linnéuniversitetet, för hjälp med vetenskapligt skrivande. Carina Löfgren, Klinisk Kemi Karlskrona, för teoretisk och praktisk handledning. Susann Ronnback, Roche Diagnostics Scandinavia AB, för försändelser av instrumentmaterial till Cobas Mikael Johansson, Klinisk Kemi Karlskrona, som läst min rapport med andra ögon. Övrig personal, Klinisk Kemi Karlskrona, för delgivande av all er kunskap. 15

21 REFERENSER 1. Bolander-Gouaille C. Focus on Homocysteine and the Vitamins Involved in its Metabolism. 2 nd ed: Springer-Verlag France; p. 2. Swart KM, van Schoor NM, Lips P. Vitamin B12, folic acid, and bone. Curr Osteoporos Rep. 2013;11(3): Nilsson-Ehle P, Berggren Söderlund M, Theodorsson E. Laurells Klinisk Kemi i praktisk medicin. 9:e uppl. Lund: Studentlitteratur AB; Mahalle N, Kulkarni MV, Garg MK, Naik SS. Vitamin B12 deficiency and hyperhomocysteinemia as correlates of cardiovascular risk factors in Indian subjects with coronary artery disease. J Cardiol. 2013;61(4): van Dijk SC, Enneman AW, van Meurs J, Swart KM, Ham AH, van Wijngaarden JP, et al. B-vitamin levels and genetics of hyperhomocysteinemia are not associated with arterial stiffness. Nutr Metab Cardiovasc Dis World Health Organization. Use of Anticoagulants in Diagnostic Laboratory Investigations. Geneva: Refsum H, Smith AD, Ueland PE, et al. Facts and Recommendations about Total Homocysteine Determinations: An Expert Opinion. Clinical Chemistry. 2004;50:1: Siemens. Operatörsmanual Immulite 2000 XPi Rev.A Siemens, Immulite Operatörsmanual - Homocysteine (PIL2KHO-21, ). 10. Roche Diagnostics Scandinavia AB, Cobas. Insert Homocystein (Hcy), , V 1-3 Engelska/Svenska. 11. SERO AS. Product Catalogue Roche Diagnostics. Cobas 6000 analyzer series, Operator s manual Version Vaara I. Metodbeskrivningar, Avdelningen för Klinisk kemi. Blekingesjukhuset, Karlskrona Ejlertsson G. Statistik för hälsovetenskaperna. 1:a uppl. Lund: Studentlitteratur AB; Lag (2002:297) om biobanker i hälso- och sjukvården m.m om-biobanker-i-_sfs /?bet=2002: [cited :43]. 16. Vaara I. Metodverifiering - Instrumentverifiering, Avdelningen för Klinisk kemi, Blekingesjukhuset, Karlskrona

22 17. Supak Smolcic V, Bilic-Zulle L, Fisic E. Validation of methods performance for routine biochemistry analytes at Cobas 6000 analyzer series module c501. Biochem Med (Zagreb). 2011;21(2): Ueland PM, Refsum H, Stabler SP, Malinow MR, Andersson A, Allen RH. Total homocysteine in plasma or serum: methods and clinical applications. Clin Chem. 1993;39(9): Zappacosta B, Persichilli S, Scribano D, Minucci A, Lazzaro D, De Sole P, et al. Comparing different methods for homocysteine determination. Clin Chem Lab Med. 2002;40(11): La'ulu SL, Rawlins ML, Pfeiffer CM, Zhang M, Roberts WL. Performance characteristics of six homocysteine assays. Am J Clin Pathol. 2008;130(6): Pettersson I. Analysportalen för Klinisk Kemi, Blekingesjukhuset, Karlskrona. kkemi.4.4e8b21a812fe724aff html [cited :21]. 22. SOSFS 2005:26. Socialstyrelsens föreskrifter och allmänna råd om hantering av smittoförande avfall från hälso- och sjukvården, (2005). 17

23 BILAGA I Tabell I: Utvunna analysvärden (µmol/l) vid precisionsstudie på Cobas Studien genomfördes på kontrollplasma i två nivåer (hög och låg) (n = 20). Kontrollplasma 1 (låg nivå) Kontrollplasma 2 (hög nivå) 8,28 29,46 8,40 29,72 8,25 28,64 8,15 28,26 8,33 29,49 8,18 29,94 8,40 29,07 8,38 29,42 8,06 29,37 8,40 29,20 8,45 29,33 8,47 28,85 8,08 30,78 8,33 28,81 8,47 28,73 8,38 29,46 8,25 30,56 8,65 31,28 8,33 29,76 8,25 28,94 n = 20 n = 20 Medelvärde = 8,32 Medelvärde = 29,45 SD = 0,14 SD = 0,75 CV = 1,71 % CV = 2,54 %

24 BILAGA II Tabell I: Analysvärden (µmol/l) (n = 51) vid analys av P-hcy med två metoder, en immunologisk referensmetod (Immulite 2000 XPi = X) och en enzymatisk (Cobas 6000 = Y). Avvikelser mellan de båda metoderna (Y-X) och patienternas ålder redovisas därutöver. Nr X Y Y-X Ålder 1 28,5 29,9 1, ,2 7,1 1, ,9 34,2 2, ,4 21,0 0, ,7 6,5 1, ,7 22,4 2, ,7 7,9 1, ,6 23,1 1, ,8 25,6 2, ,7 30,9 0, ,9 24,4 3, ,2 15,1-0, ,0 27,3 1, ,6 33,1 1, ,9 16,8 2, ,2 8,4 1, ,5 13,5 2, ,2 21,6-2, ,3 13,8 1, ,8 36,7 1, ,0 53,5 2, ,2 19,0 0, ,9 6,8 1, ,6 6,4 0, ,8 21,0 1, ,9 25,1-1, ,7 35,4 1, ,6 25,5-0, ,2 7,7 0, ,9 25,7 1,80 73 Nr X Y Y-X Ålder 31 41,0 37,6-3, ,1 30,4-0, ,6 5,3 1, ,0 10,6-0, ,1 6,9-2, ,3 18,5 2, ,0 56,5 0, ,6 64,7-1, ,8 9,1 0, ,4 10,1 0, ,0 13,5-0, ,4 12,8 1, ,4 33,1 1, ,9 9,2 0, ,6 9,2-0, ,8 12,3 1, ,5 14,0 1, ,8 9,8 2, ,6 20,1 1, ,8 14,1 2, ,5 16,4 0,90 48 Medel 19,8 20,8 0,90 62,4

25 Linnéuniversitetet Kalmar Växjö Lnu.se