Jämförelsestudie av Hemoglobin A1c (HbA1c) analys mellan Variant TM II Turbo och DCA Vantage TM

Transkript

1 Institutionen för naturvetenskap Examensarbete Jämförelsestudie av Hemoglobin A1c (HbA1c) analys mellan Variant TM II Turbo och DCA Vantage TM Emma Svensson Huvudområde: Biomedicinsk laboratorievetenskap Nivå: Grundnivå Nr: 2011:BL2

2 Jämförelsestudie av Hemoglobin A1c (HbA1c) analys mellan Variant TM II Turbo och DCA Vantage TM Emma Svensson Examensarbete i Biomedicinsk laboratorievetenskap 15 högskolepoäng Filosofie Kandidatexamen Handledare: Fil Dr, Madeleine Rosén Leg Biomed analytiker, Katarina Skov- Poulsen Avdelningen för Klinisk Kemi Centrallasarettet Växjö SE Växjö Avdelningen för Klinisk Kemi Centrallasarettet Växjö SE Växjö Leg Biomed analytiker, Dr Med Vet, Susanne Widell Institutionen för naturvetenskap Linnéuniversitetet SE Kalmar Examinator: Dr Med Vet, Maria Mattsson Institutionen för naturvetenskap Linnéuniversitetet SE Kalmar Examensarbetet ingår i Biomedicinska analytikerprogrammet 180 högskolepoäng Sammanfattning Vid mätning av HbA1c i blod visas medelkoncentrationen av glukos som en person har haft under de senaste tre månaderna och analysen används vid uppföljning av patienter med diabetes mellitus. DCA Vantage TM är ett patientnära analysinstrument som utvecklats för att kunna utföra laboratorieanalyser inom till exempel primärvården. Patientnära analysinstrument är viktiga för att minska tiden från provtagning till behandling. DCA Vantage TM är ett halvautomatiskt analyssystem som utformats för kvantitativa mätningar av HbA1c i blod. Syftet med studien var att utföra en verifiering för att se om DCA Vantage TM (immunoturbimetrisk metod) kunde användas som ett komplementinstrument till Variant TM II Turbo (high performance liquid chromatography, HPLC). Vid verifieringen av DCA Vantage TM utfördes analys för precision inom serie, metodjämförelse, kontroll och precision inom och mellan dag. Studien utfördes på 35 patienter mellan år. Patientproverna var venöst tagna i EDTA-provrör. Resultaten för samtliga precisionsanalyser för instrumentet gav en variationskoefficient (CV) under 4 %, vilket visade att DCA Vantage TM har en hög precision. För metodjämförelsen blev resultatet för regressionslinjens lutning nära 1 och skärning av y-axeln nära 0 vid beräkning med både Demings regressionsanalys och minsta kvadratmetoden. Vid denna verifiering upptäcktes ingen medicinskt betydelsefull skillnad mellan laboratorieverksamhetens Variant TM II Turbo och patientnära verksamhetsinstrumentet DCA Vantage TM. DCA Vantage TM anses därför kunna införas som komplementinstrument för Variant TM II Turbo.

3 Abstract When HbA1c is analyzed it shows the average concentration of glucose in a person over the last three months and is used to follow up patients with diabetes mellitus. DCA Vantage TM is a Point-of- Care instrument that has been developed to be able to perform laboratory analysis without the advanced equipment of a laboratory. Point-of-Care analysis is important to shorten the time from the time when the patient gets sick until the right treatment can be offered. DCA Vantage TM is a half automatic analysis instrument that is developed for quantitative measurements of HbA1c in blood. The aim of this study was to perform a verification to see if DCA Vantage TM (immunoturbimetric method) could be used as a complement instrument for Variant TM II Turbo (high performance liquid chromatography, HPLC). Variant TM II Turbo calculates the results of HbA1c by calculating the area of the HbA1c-top in the chromatography. In some cases the separation is not enough to clearly separate the tops and in these cases another analysis method can be used to ensure that the results are accurate. During the verification precision within series, method comparison, controls and precision within and between days was preformed. The results for all precision analysis had a CV lower than 4 % which showed that DCA Vantage TM has high precision. For the method comparison the results for the regression line slop was close to 1 and the crossing of the y-axis was close to zero when calculated both with Demings regression and least squares method. This showed that there was no significant difference between the two methods. This verification showed no clinical important differans between Variant TM II Turbo and DCA Vantage TM. DCA Vantage TM could be in stored as a complement instrument to Variant TM II Turbo.

4 Innehållsförteckning Förkortningslista... 1 Introduktion... 2 Patientnära verksamhet... 2 Diabetes mellitus... 2 HbA1c... 3 Analys av HbA1c... 4 Variant TM II Turbo... 4 DCA Vantage TM analyzer... 4 Syfte... 6 Material och metod... 6 Provmaterial... 6 Analys... 6 Precision inom serie... 6 Metodjämförelse... 7 Kontroll... 7 Precision inom och mellan dag... 7 Etik... 7 Resultat... 7 Precision inom serie... 7 Metodjämförelse... 8 Kontroll... 9 Precision inom och mellan dag... 9 Diskussion Erkännanden Referenser Bilaga 1

5 Förkortningslista CV EMG HbA1c HPLC K l MV PEITT SD TAT Variationskoefficient Exponentiell modifierad gaussisk algoritm Hemoglobin A1c High-performance liquid chromatography Regressionslinjens lutning Intercept Medelvärde Particle-enhanced immunoturbidimetric metod Standardavvikelse Turnaround time 1

6 Introduktion Patientnära verksamhet Patientnära verksamhet är inget nytt. Många av tidiga diagnostiska tester, exempelvis urintester, utfördes vid patientsängen. De kliniska testerna har utvecklats vilket kräver kvalitetssäkrad analysutrustning. Under de senaste åren har en mängd analyser tagits fram för att kunna utföras utan den avancerade laboratorieutrustningen och för att på så sätt återigen kunna analyseras i patientnära laboratorieverksamheter. Målet med patientnära verksamhet är att snabbt kunna få provresultaten. Detta för att minska tiden från provtagning till diagnos. Den minskade turnaround tiden (TAT, tiden från provtagning till det att provsvar lämnats ut) för analyssvar och snabbare återkoppling till patienter ger stora fördelar inom patientnära verksamhet. De vanligaste analysinstrumenten som används inom patientnära verksamhet är bänkplacerade instrument, så som DCA Vantage TM. De bänkplacerade instrumenten är mindre versioner av de instrument som används vid kliniska laboratorier inom sjukvården. Många steg vid analys på de bänkplacerade instrumenten har blivit automatiserade. Även med de mest utvecklade instrumenten måste patienten vara förberedd på rätt sätt det vill säga patienten ska vara fastande och ha rätt kroppsposition om så behövs och före alla provtagning ska patienten ha vilat 15 minuter. Provet måste också tas på ett korrekt sätt för att resultaten ska kunna vara tillförlitiga, till exempel måste rören tas i rätt ordning för att undvika att tillsatser överförs via lansetten till andar rör under provtagningen, stas får inte användas i mer än 1 minut och rören måste blandas väl direkt efter provtagning. Eftersom många patientnära analyser utförs av personal med begränsad erfarenhet av det laborativa arbetet är kontroller och lättanvända instrument extra viktiga (1, 2). Diabetes mellitus Diabetes mellitus är ett av de största hälsoproblemen under 2000-talet. The International Diabetes Federation (IDF) uppskattar att mer än 250 miljoner människor runt om i värden är drabbade av diabetes mellitus (3). Diabetes mellitus klassificeras som en grupp av heterogena sjukdomar med de gemensamma symtomen av hyperglycemi och glukosintolerans som beror på insulinbrist, minskad effekt av insulin eller både och. Diabetes mellitus delas in i fyra typer, typ 1-diabetes, typ 2-diabetes, graviditetsdiabetes och sekundär diabetes. Vid sekundärdiabetes har patienten utvecklat diabetes mellitus som en följdsjukdom av ett annat sjukdomstillstånd (4). För att glukos i blodet ska kunna tas upp av kroppens celler behövs hormonet insulin. Typ 1-diabetes utvecklas då en autoimmun reaktion bryter ner de insulinproducerande betacellerna i pankreas. Betacellerna kan då enbart producera en mindre mängd insulin eller inget insulin alls. Sjukdomen kan drabba människor i alla åldrar, men oftast är det barn eller ungdomar som insjuknar. De vanligaste symtomen är ökad törst, trötthet, konstant hunger, plötslig viktminskning och upprepade infektioner. Personer med typ 1-diabetes behöver dagligen injektioner med insulin för att hålla nivån av glukos i blodet stabil. Utan injektioner överlever inte patienten. Antalet fall av typ 1-diabetes ökar och orsaken är oklar men kan bero på ökade viktproblem, ökande ålder på nyblivna mammor och möjligtvis påverkar en faktor så som kostvanor (4). 2

7 Typ 2-diabetes karakteriseras av insulinresistens och insulinbrist. Patienter som utvecklat typ 2- diabetes kan ha haft sjukdomen i många år innan den upptäcks, då den kan komma mycket smygande. Sjukdomen uppkommer oftast hos patienter över 40 år, men kan även uppstå i tidigare åldrar. Rapporter om barn som drabbas av typ 2-diabetes ökar markant. Övervikt förknippas ofta med typ 2-diabetes då detta i sig kan orsaka insulinresistens vilket leder till ökade nivåer av glukos i blodet. Riskfaktorer för typ 2-diabetes är ökad ålder, genetiska faktorer och vissa etniska grupper har större risk för att utveckla diabetes mellitus. Till skillnad från typ 1-diabetiker är inte de som drabbas av typ 2-diabetes beroende av insulininjektioner, men kan behöva dem för att hålla glukosnivån stabil. En stabil glukosnivå kan ofta uppnås med en speciell diet och motion. Att antalet insjuknade i typ 2-diabetes ökar tros bero på att i i-länder blir populationen äldre, matvanor ändras, fysisk aktivitet minskar och andra ohälsosamma livsstilsval görs (4). Vd graviditetsdiabetes innehas glukosintolerans i varierande grad. Sjukdomen uppstår under graviditet och även om tillståndet fortskrider efter avslutad graviditet kvarstår diagnosen. Det är mycket viktigt att glukosnivån hålls stabil för att reducera framtida risker för fostret. Förhöjd glukosnivå under graviditeten kan leda till ökad storlek hos barnet vid födsel, förlossningstrauma och hypoglykemi. Barnet har även större risk för övervikt och onormal glukosmetabolism senare i livet. Kvinnor med graviditetsdiabetes har en ökad risk för att med ökande ålder utveckla typ 2-diabetes (4). I länder med stabil ekonomi anses diabetes mellitus vara den ledande orsaken till komplikationer så som blindhet, njursvikt och amputering av ben/fot. Diabetes mellitus anses i i-länder vara en av de största dödsorsakerna på grund av den ökade risken för hjärt-kärlsjukdomar. Förhöjda glukosnivåer kommer till slut att leda till vävnads- och organskada vilket i sin tur ofta leder till allvarliga sjukdomstillstånd. Hos barn kan en instabil nivå av glukos leda till att nervsystemet inte kan utvecklas normalt. Barn är också mer känsliga för brist på insulin och har en större risk för att snabbt bli så sjuka att de hamnar i diabeteskoma (4). HbA1c Glukos i blodbanan binds delvis in till hemoglobinet i erytrocyterna och förblir bundet tills erytrocyten bryts ned, cirka 120 dagar efter att erytrocyten bildats. Då glukosnivån i blodet stiger kommer fler sockermolekyler att bindas in till erytrocyterna (5). Glukos binds in genom att reagerar med bland annat aminogruppen i den N-terminala aminosyran valin. Valin finns i hemoglobinets β- kedjor och reagerar med glukos enligt följande schema: Hb + Glukos pre-hba1c HbA1c (Schiffbas) (Ketoamin) Schiffbasen står i relativt snabb jämvikt med icke-glykerat Hb och glukos. Schiffbasen undergår även en långsammare och irreversibel omlagring till HbA1c (ketoamin). Förutom det dominerande hemoglobinet A1 innehåller erytrocyten också HbA2 och HbF (fetal hemoglobin). Det finns även ett flertal postribosomalt modifierade hemoglobinfraktioner. Till dessa fraktioner hör HbA1c som är den fraktion som är av störst klinisk betydelse då det påvisar medelkoncentrationen av glukos som en person har haft under de senaste tre månaderna (6). HbA1c-analysen är den mest användbara för att kunna fastställa patientens blodsockernivå (5). Förhållandet HbA1c och icke-glykerat Hb rapporteras som resultat av en kvot HbA1c/Hb (mmol/mol). För personer under 50 år är referensintervallet 3

8 mellan mmol/mol och för personer över 50 år mellan mmol/mol (7). Det finns ett samband mellan höga HbA1c värde och utveckling av komplikationer som till exempel ögon-, njuroch kärlskador. HbA1c bestäms huvudsakligen enligt tre principer: jonbyteskromatografi, affinitetskromatografi och immunturbidimetrisk metod med mono- och polyklonala antikroppar. Provtagningen utförs till största del i Etylendiamintetraättiksyra (EDTA)-rör och provet är hållbart i upp till en vecka förvarat i kylskåp som helblod. Hemolyserat blod är hållbart i 2-3 dagar (6). Analys av HbA1c Variant TM II Turbo Variant TM II Turbo (Bio-Rad, USA) HbA1c kit-2.0 använder principen jonbyteskromatografi (Highperformance liquid chromatography (HPLC)). Variant TM II Turbo analyserar HbA1c mellan mmol/mol med kromatografisk separation av HbA1c med en katjonsbyteskolonn. Separationen är optimerad för att eliminera labilt HbA1c som är ett förstadie till HbA1c och karbamylerat hemoglobin som annars kan störa analysen. Proverna späds automatiskt av Variant TM II Turbo och injiceras till en kolonn. Variant TM II Turbo pumpar en gradient med ökande jonstyrka till kolonnen vilket ger en separation av hemoglobinet baserad på joniserade interaktioner med kolonnens material. De separerade hemoglobinmolekylerna passerar sedan genom flödescellen på filterfotometern där förändringar i absorbansen vid 415 nm uppmäts. HbA1c-toppens area på kromatogrammet (Se figur 1) beräknas med användning av en exponentiell modifierad gaussisk (EMG) algoritm som utesluter labilt HbA1c och karbamylerade toppareor från A1c-topparean (8, 9). Figur 1 Exempel på ett kromatogram där HbA1c-toppen är gråmarkerad. Framtaget och analysera på patientprov på Centrallasarettet Växjö, framtaget för detta ändamål. DCA Vantage TM analyzer DCA Vantage TM (Siemens, Deerfield, USA) är ett halvautomatiskt analyssystem som är utformat för kvantitativa mätningar av HbA1c i blod, mikroalbuminuri (låga albuminkoncentrationer i urin), kreatinin och albumin/kreatinin-kvot i urin. Instrumentet är avsett för patientnära verksamhet. DCA 4

9 Vantage TM består av en spektrofotometer som mäter intensiteten hos ljuset vid 531 nm som överförs genom ett optiskt fönster i reagenskassetten (10). För analys av HbA1c med DCA Vantage TM användes reagenssats för hemoglobin A1c. Vid analys mäts både koncentrationen av HbA1c specifikt och den totala hemoglobinkoncentrationen. Förhållandet mellan de två analyterna rapporteras som resultat av en kvot HbA1c/Hb (mmol/mol). Analysintervallet av HbA1c för DCA Vantage TM är mmol/mol. Triglycerider upp till 1347 mg/dl och Bilirubin upp till 20 mg/dl påverkar inte analysen. Alla reagenser för genomförande av de båda reaktionerna ingår i DCA-reagenskassett för HbA1c (Se figur 2) (11). Figur 2 DCA Vantage TM HbA1c-reagenskassett (11). Glaskapillären i plastkapillärhållaren fylls med blod och placeras i reagenskassetten (Se figur 2). Det är viktigt att analysen påbörjas inom 5 minuter när glaskapillären fyllts med blod. Detta, enligt Kent Hägg (Product Manager på Siemens), är för att kunna garantera att blodet inte koagulerat då blodet i den heparinbeklädda glaskapillären inte kan blandas. Vid mätning av den totala mängden hemoglobin oxideras hemoglobinet i provet till methemoglobin av kaliumferricyanid (1,5 % kaliumferricyanid i vatten med 21 % icke-reaktiva substanser). Methemoglobinet bildar sedan komplex med tiocyanat och den färgade slutprodukten tiocyan-methemoglobin mäts. Omfattningen av färgutvecklingen vid 531 nm är proportionell mot totalkoncentrationen av hemoglobin i provet (11). För bestämning av andelen specifikt HbA1c används en analys av latexagglutinationsinhibering (Se figur 3). Agglutinatorn är en syntetisk polymer med flera kopior av den immunoreaktiva delen av HbA1c och bildar komplex med latexpartiklar överdragna med HbA1c-specifika monoklonala antikroppar (2,5 % antikroppslatex i 10 mm glycinbuffert) som finns torkat i varje kassett. Agglutinatorn består av 0,005 % polymer av polyasparaginsyra kovalent bundet till HbA1c-hapten i 20 mm natriumcitratbuffert med 0,1 % bovint serumalbumin och 1 % icke-reaktiva substanser. Agglutinationsreaktionen mellan agglutinatorn och antikroppslatex ger en ökad ljusspridning som mäts vid 531 nm. HbA1c-molekylerna i helblodsprovet konkurrerar om de begränsade antalen inbindningsställena på antikroppslatexpartiklarna. När HbA1c binder in, hindras agglutinatorn att bindas in och det leder till en minskad agglutination och ljusspridning. Den minskade ljusspridningen mäts som en minskning av absorbansen vid 531 nm (11). 5

10 Figur 3 Analysprincip Latexagglutinationsinhibering. Agglutinatorn är en syntetisk polymer med flera kopior av den immunoreaktiva delen av HbA1c och bildar komplex med antikroppslatexpartiklar överdragna med HbA1c-specifika monoklonala antikroppar (11). Syfte Syftet med studien var att utföra en verifiering för att se om DCA Vantage TM kunde användas som ett komplementinstrument till huvudinstrumentet Variant TM II Turbo. Material och metod Provmaterial Patientproverna var venöst tagna i provrör med EDTA som antikoagulantia (Becton, Dickinson and Company). Proverna förvarades i kylskåp fram till analys. Studien utfördes på 35 patienter med olika typer av diabetes mellitus. Patienterna var mellan år (medelålder 63 år), 57 % var män och 43 % kvinnor. Proverna blandades på vagga i minst 10 minuter innan analys på helblod utfördes. HbA1c analys med DCA Vantage TM För varje analys av HbA1c-prov doppades spetsen på glaskapillären i helblod så att den fylldes med 10 µl blod. Kapillärrörets sida torkades av och plastkapillärhållaren placerades i reagenskassetten. Kassettens streckkod avlästes och placerades i instrumentets analysfack där den låstes fast. För att påbörja analysen drogs plastfliken i kassetten bort och luckan till instrumentet stängdes. På instrumentets skärm registrerades patientinformation och efter ungefär 6 minuter var analysen klar och resultatet kunde registreras. Efter analys kasserades analyskassetten (10). DCA Vantage TM kalibrerades efter var tionde prov, då ett nytt DCA systems HbA1c reagensats öppnades, med ett Siemens DCA systems kalibreringskort. Kalibreringen utfördes genom att kalibrationskortets streckkod avlästes av instrumentet, vid godkänd kalibrering bekräftades inläsningen med en ljudsignal (10). Precision inom serie För att bestämma precision inom serie för analysen HbA1c på DCA Vantage TM analyserades ett patientprov med låg HbA1c nivå (35 mmol/mol) och ett patientprov med hög HbA1c nivå (97 6

11 mmol/mol). Båda proverna analyserades 25 gånger och av resultaten beräknades medelvärde (MV), standardavvikelse (SD) och variationskoefficient (CV) för varje prov (12). Metodjämförelse För att jämföra komplementinstrumentet DCA Vantage TM med huvudinstrumentet Variant TM II Turbo valdes en population av 35 olika patientprover ut som tidigare samma dag analyserats av annan personal på Variant TM II Turbo. De 35 HbA1c-proverna analyserades på DCA Vantage TM. Proverna valdes ut med en spridd fördelning över analysintervallet för DCA Vantage TM ( mmol/mol) (13). De två metoderna jämfördes statistiskt med linjär regression med grafisk avbildning som beräknades på två olika sätt, Demings regressionsanalys och minsta kvadratmetoden. Demings regression beräknas genom att medelvärdet av avståndet från punkterna till regressionslinjen beräknas då sträckorna är vinkelräta mot regressionslinjen. Minsta kvadratmetoden beräknas då medelvärdet av sträckorna mellan punkterna till regressionslinjen mäts vertikalt (13). Kontroll Kontroller av analys för HbA1c till DCA Vantage TM består av en normal nivå med förväntat värde på 35,5 mmol/mol och gränsvärden mellan 23,5-47,5 mmol/mol och en abnormal nivå med förväntat värde på 95,6 mmol/mol och gränsvärden mellan 71,6-119,7 mmol/mol. Kontrollmaterialet som var frystorkat späddes upp med 6 droppar rekonstruktionsvätska och stod därefter i rumstemperatur i 15 minuter. Kontrollflaskorna vändes så att hela flaskans yta kom i kontakt med vätskan för att allt frystorkat material skulle lösas upp i vätskan. Kontrollen var klar för analys när materialet var homogent. Innan utförandet avlästes en streckkod på kontrollkortet för att registrera vilken kontroll som skulle analyseras. Kontrollerna utfördes på samma sätt som patientproverna. De två kontrollnivåerna ovan analyserades 15 gånger samma dag och MV, SD och CV beräknades (12). Precision inom och mellan dag De två kontrollnivåerna analyserades 5 gånger per dag i 5 dagar. MV, SD och CV beräknades för inomdags- och mellandagsvariation samt totalvärden för de båda kontrollerna (12). Etik Vid utförandet var proverna avidentifierade. Då proverna inte sparades i mer än två månader gäller inte biobankslagen men det är ändå viktigt att ha förståelse för att det finns en patient som har lämnat provet. Därför ska tystnadsplikten hållas och patientens tidigare provsvar som inte är relevanta för studien ska inte studeras. (14, 15). Resultat Precision inom serie Vid analys på DCA Vantage TM av det låga HbA1c patientprovet (35 mmol/mol) för precision inom serie blev resultaten vid 25 analyser mellan mmol/mol. MV beräknades till 34,3 mmol/mol med en SD på 0,9 mmol/mol och CV 2,6 %. Det höga HbA1c patientprovet (97 mmol/mol) gav vid 25 analyser resultat mellan mmol/mol. MV beräknades till 96,0 mmol/mol, SD till 3,3 mmol/mol och CV till 3,5 % (Se bilaga 1, tabell I). 7

12 DCA VantageTM (mmol/mol) Metodjämförelse Trettiofem HbA1c prover som analyserats på huvudinstrumentet Variant TM II Turbo analyserades på DCA Vantage TM för en metodjämförelse. Patientproverna analyserade på Variant TM II Turbo gav resultat mellan mmol/mol och på DCA Vantage TM mmol/mol. MV beräknades för Variant II Turbo till 59,6 mmol/mol och SD 22,9 mmol/mol. För DCA Vantage TM beräknades MV till 57,7 mmol/mol och SD till 22,6 mmol/mol (Se bilaga 1, tabell II). Från resultaten vid metodjämförelsen erhölls regressionslinjer (Se fig4). Den optimala regressionslinjen har värdet K=1 och I=0 och ses här som en svart streckad linje. Regression beräknad med Demings regressionsanalys är uppritad med grön linje och de två röda linjerna är minsta kvadratmetoden för X mot Y och Y mot X (Se fig 4). Regressionslinjens lutning (K) beräknades med Demings regression till 0,99 och med minsta kvadrantmetoden för X mot Y till 0,98 och Y mot X till 0,99. Hur y-axel (l) skärs beräknades med Deming regression till -0,86 och med minsta kvadratmetoden för X mot Y till -0,41 och för Y mot X till -1,3 (Se tabell I). 120 Metodjämförelse VariantTM II Turbo (mmol/mol) Figur 4 Metodjämförelse för HbA1c analys mellan Variant TM II Turbo och DCA Vantage TM med linjär regression. Demings regression är uppritad med en grön linje, 2 röda linjer för Y mot X och X mot Y vid minsta kvadratmetod, svart streckad linje är K=1 och l=0. Då samtliga linjer ligger nära varandra är de olika färgerna svåra att se. Tabell I Beräknat resultat (mmol/mol) för metodjämförelsens graf, K- och l-värden beräknade med Demings regression och minsta kvadratmetoden för X mot Y och Y mot X. K Deming 0,99-0,86 X mot Y 0,98-0,41 Y mot X 0,99-1,3 I 8

13 Kontroll Resultat för den normala HbA1c kontrollen (förväntat värde 35,5 mmol/mol, gränsvärden 23,5-47,5 mmol/mol), från 15 analyser gav värden mellan mmol/mol med ett MV på 36,1 mmol/mol och en SD på 1,0 mmol/mol och en CV på 2,7 %. Resultat för den abnormala HbA1c kontrollen (förväntat värde 95,6 mmol/mol, gränsvärden 71,6-119,7 mmol/mol) gav värden mellan mmol/mol med ett MV på 94,3 mmol/mol, en SD 2,8 mmol/mol och en CV 3,0 % (Se bilaga 1, tabell III). Precision inom och mellan dag För den normala kontrollen, med förväntat värde 35,5 mmol/mol, blev resultaten för precision inom och mellan dag för alla 25 analystillfällen mellan 34,0-37,0 mmol/mol. MV för mellan dagar blev 35,8-36,4 mmol/mol och inom dagar mellan 35,4-36,3 mmol/mol. SD för precision mellan dag blev 0,5-1,3 mmol/mol och inom dag 0,4-1,3 mmol/mol. CV mellan dag blev 1,5 3,9 % och inom dag 1,2-3,8 % (Se tabell II). Dessa resultat gav totalt MV på 35,8 mmol/mol, SD 1,1 mmol/mol och CV 3,1 % (Se tabell IV). Tabell II Precision inom och mellan dag, resultat för den normala HbA1c kontrollen (35,5 mmol/mol) på DCA Vantage TM (mmol/mol) DAG 1 DAG 2 DAG 3 DAG 4 DAG 5 MV: SD: CV (%): 1 37,0 36,0 36,0 34,0 36,0 35,8 1,1 3,1 2 37,0 36,0 37,0 36,0 36,0 36,4 0,5 1,5 3 36,0 36,0 34,0 34,0 33,0 34,6 1,3 3,9 4 36,0 36,0 37,0 37,0 36,0 36,4 0,5 1,5 5 34,0 37,0 36,0 36,0 36,0 35,8 1,1 3,1 MV: 36,0 36,2 36,0 35,4 35,4 SD: 1,2 0,4 1,2 1,3 1,3 CV (%): 3,4 1,2 3,4 3,8 3,8 För den abnormala kontrollen, med förväntat värde 95,6 mmol/mol, blev resultaten för precision inom och mellan dag för alla 25 analystillfällen mellan 89,0-98,0 mmol/mol. MV för mellan dagar blev 92,2-96,4 mmol/mol och inom dagar mellan 92,4-96,4 mmol/mol. SD för precision mellan dag blev 1,8-3,6 mmol/mol och inom dag 1,3-3,6 mmol/mol. CV mellan dag blev 1,9 3,9 % och inom dag 1,4-3,8 % (Se tabell II). Dessa resultat gav totalt MV på 94,0 mmol/mol, SD 2,8 mmol/mol och CV 3,0 % (Se tabell IV). Tabell III Precision inom och mellan dag, resultat för den abnormala HbA1c kontroll (95,6 mmol/mol) på DCA Vantage TM (mmol/mol) DAG 1 DAG 2 DAG 3 DAG 4 DAG 5 MV: SD: CV (%): 1 98,0 97,0 98,0 92,0 97,0 96,4 2,5 2,6 2 97,0 93,0 90,0 95,0 96,0 94,2 2,8 2,9 3 95,0 91,0 93,0 91,0 91,0 92,2 1,8 1,9 4 97,0 90,0 95,0 96,0 89,0 93,4 3,6 3,9 5 95,0 91,0 95,0 92,0 96,0 93,8 2,2 2,3 MV: 96,4 92,4 94,2 93,2 93,8 SD: 1,3 2,8 2,9 2,2 3,6 CV (%): 1,4 3,0 3,1 2,3 3,8 9

14 Tabell IV Sammanställning av samtliga resultat för HbA1c analys av precision inom och mellan dag för den normala kontrollen (35,5 mmol/mol) respektive abnormala kontrollen (95,6 mmol/mol). Normal Abnormal n: MV: 35,8 94,0 SD: 1,1 2,8 CV (%): 3,1 3,0 Diskussion Syftet med studien var att utföra en verifiering av instrument DCA Vantage TM för HbA1c-analys för att undersöka om DCA Vantage TM kunde införas som ett komplementinstrument till Variant TM II Turbo. Vid verifieringen utfördes analyser för att studera om instrumentet gav samma resultat varje gång då ett prov analyserades 25 gånger, så kallat precision inom serie. Resultaten för precision inom serie blev SD, 0,9 mmol/mol för låg nivå av HbA1c och 3,3 mmol/mol för hög nivåav HbA1c. CV för de båda proverna var efter 25 analyser 2,6 % för det låga HbA1c provet och 3,5 % för det höga HbA1c provet. Dessa låga procentuella skillnader i CV mellan analyser påverkar inte resultatet för HbA1c så att de skulle ge patienten en annorlunda behandling. För metoder med smalare referensintervall, så som kalcium, kan diagnosen för patienten påverkas mycket om metodens precision ger ett för högt CV. Större procentuella skillnader i CV så att resultatet påverkas kan finnas när nya instrument införs och det är därför viktigt med en väl genomförd verifiering. Att SD och CV har ett större värde på de prover med höga nivåer av analyt beror på att koncentrationen i provet är högre och felmarginalerna blir då ofta något större. Metodjämförelsen gav ett MV på 59,6 mmol/mol för huvudinstrumentet Variant TM II Turbo och 57,7 mmol/mol för DCA Vantage TM. Demings metod för regressionsanalys gav K-värdet: 0,99 och l-värdet: -0,86. För minsta kvadratmetoden blev K-värdet för X mot Y: 0,98 och för Y mot X: 0,99. Värdet för l för X mot Y blev -0,41 och för Y mot X -1,3. För både Deming och för minsta kvadratmetoden ligger K- värdet nära 1 och l-värdet nära 0. Om värdena varit exakt 1 för K och 0 för l skulle det ha inneburit att metoderna gav exakt samma resultat. Differensen mellan dessa värden i resultatet ses dock som marginella och därför anses metoderna ha god överrensstämmelse. Både Deming och minsta kvadratmetoden används för att de kan skilja sig mycket åt då analysintervallet är smalt och därför behövs båda för att kunna konstatera om någon skillnad mellan instrumenten existerar. Resultatet vid metodjämförelsen kan påverkas då det finns olika metoder för att kalibrera Variant TM II Turbo och om kalibreringsmetoden byts ut efter validering kan HbA1c-metoderna ha något större eller mindre differans. Resultaten för precision inom och mellan dag gav en medel SD på 1,1 mmol/mol för den normala kontrollen och 2,8 mmol/mol för den abnormala. Medel CV blev 3,1 % för den normala kontrollen och 3,0 % för den abnormala. Dessa resultat visar en bra precision och att instrumentet inte får speciellt mycket större felmarginal trots ökad koncentration på provet. Resultaten visar att instrumentet har bra precision både inom och mellan dag. Resultatet från kontrollstudien visade liknande resultat vilket betyder att så länge kontrollerna ligger inom godkända gränser så bör inget fel vid analys misstänkas. 10

15 Vid tidigare studier där DCA Vantage TM har jämförts med en HPLC-metod har resultaten blivit liknande. I studien som publicerats i Clinical Chemistry jämförs DCA Vantage TM med åtta andra patientnära instrument för analys av HbA1c. I denna studie var det bara två instrument som uppfyllde det generella kravet att ha ett totalt CV under 3 %, och ett av dem var DCA Vantage TM (3). För HbA1c-analysen är HPLC så kallad Golden standard (16). En annan studie visar dock att istället för HPLC kan en particle-enhanced immunoturbidimetric metod (PEITT) användas för att analysera HbA1c. Resultaten från denna studie som publicerats i Turkish Journal of Biochemistry visar att metoden ger pålitliga resultat och kan därför ses som en pålitlig metod. PEITT analyserar även HbA1c fortare och analysen är lättare att utföra än vid HPLC (17). Variant TM II Turbo beräknar resultatet för HbA1c genom att HbA1c-toppens area på kromatogrammet beräknas med användning av en EMG algoritm som utesluter labilt HbA1c och karbamylerade toppareor från HbA1c-topparean. Men i vissa fall blir inte separationen tillräcklig av de olika analyterna i kromatogrammet för att få klara avgränsningar mellan topparna. Vid dessa tillfällen är det fördelaktigt att analysera om provet med en annan analysmetod för att provsvaret ska kunna vara pålitligt. DCA Vantage TM är inget mängdinstrument då det maximalt går att utföra 9-10 analyser i timmen. Ur miljösynpunkt är det inte heller lämpligt att använda DCA Vantage TM som rutininstrument med många prover då det vid analys används mycket engångsmaterial med aluminium och hårdplast. Instrumentet är bra då det är enkelt att använda och många delar i analysen är automatiserade vilket gör att instrumentet kan användas i patientnära verksamhet. DCA Vantage TM har ett mycket enkelt underhåll och en kalibrering som består av ett kalibreringskort som dras efter vart tionde analyserat prov. Kontrollhanteringen är relativt enkel, de späds med rekonstruktionsvätskan och analyseras sedan som ett vanligt prov efter att instrumentet registrerat vilken kontroll som är aktuell. HbA1c är en viktig analys för att kontrollera medelblodsockernivån under en längre period hos patienter med diabetes mellitus och för att på så sätt minska de följdsjukdomar som kan uppstå vid förhöjda glukosnivåer under en längre tid. Att kunna utföra denna analys i patientnära verksamhet underlättar då resultatet för HbA1c kan fås snabbt och en dialog om resultatet kan föras med patienten på plats och en åtgärd kan om nödvändigt sättas in. Det är viktigt att HbA1c-nivån hos patienter kan konstateras ofta och enkelt. Därför är ett instrument som går att använda i patientnära verksamhet mycket användbart. För att patienten inte ska få olika resultat beroende på var de söker sjukvård, måste de instrument som finns i den patientnära verksamheten och i laboratorieverksamheten verifieras mot varandra. Vid denna verifiering upptäcktes ingen medicinskt betydelsefull skillnad mellan laboratorieverksamhetens Variant TM II Turbo och patientnära verksamhetsinstrumentet DCA Vantage TM. DCA Vantage TM kan därför införas som komplementinstrument för Variant TM II Turbo på laboratoriet för Klinisk Kemi vid Centrallasarettet Växjö. Erkännanden Ett stort tack till Laboratoriet för Klinisk Kemi i Växjö för att jag fick utföra mitt arbete där och för det varma välkomnandet och stödet på vägen. Speciellt vill jag tacka Madeleine Rosen och Katarina Skov- Poulsen. Under arbetets gång har jag fått mycket hjälp med frågor och material från Siemens och vill där speciellt tacka Kent Hägg och Kerstin Johansson. För hjälp och stöd vid skrivandet vill jag tacka Lars-Åke Malmqvist och Susanne Widell. 11

16 Referenser 1. Price CP. Point of care testing. BMJ May; 322 (7297): Burtis CA, Ashwood ER, Bruns DE, Tietz NW. Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics. 4th ed. Philadelphia: Saunders; Lenters-Westra E, Slingerland RJ. Six of Eight Hemoglobin A1c Point-of-Care Instruments Do Not Meet the General Accepted Analytical Performance Criteria. Clinical Chemistry. 2010; 56: 1: IDF Diabetes Atlas. What is Diabetes? : International Diabetes Federation; 2009; 4th: [ [ ] 5. DiabetesMonitor. The Abcs of Hemoglobin A1c Testing [cited ]; 6. Nilsson-Ehle P, Ganrot PO, Laurell C-B. Laurells Klinisk kemi i praktisk medicin. 8:e upplagan. Lund: Studentlitteratur; Analysförteckning; 2011 [cited ]; 8. Bio-Rad, Produktinformation. VariantTM II Turbo, HbA1c Kit Alm B, Schedvin G. B-HbA1c (IFCC), (VARIANT II Turbo). Bio-Rad, Metodbeskrivning Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Användarhandbok på DCA VantageTM Analyzer Produktinformation. DCATM Systems, Reagenssats för hemoglobin A1c Figurtillstånd från Siemens 12. Rosén M, Nilsson T. Anvisningar för Metod- och Instrument Validering/verifiering. Klinisk kemi och transfusionsmedicin, Växjö-Ljungby, Landstinget Kronoberg Cornbleet PJ, Gochman N. Incorrect least-squares regression coefficients in methodcomparison analysis. Clin Chem Mar; 25 (3): [ :54] [ :55] 16. Hemoglobin A1c (HbA1c) in Whole Blood (for Bio-Rad Diamat and Modular HPLC Systems). Recipe; 2009; [ ] 17. Ozcelik F, Yiginer O, Serdar MA, Kurt I, Oztosun M, Arslan E, et al. Comparison of Three Methods for Measurement of HbA1c. Turkish Journal of Biochemistry-Turk Biyokimya Dergisi. 2010; 35 (4):

17 Bilaga 1 Tabell I Precision inom serie av HbA1c analys för DCA Vantage TM, resultat för lågt (35 mmol/mol) och högt (97 mmol/mol) patientprov. Prov Låg (mmol/mol) Prov Hög (mmol/mol) 1 35,0 92,0 2 36,0 99,0 3 34, ,0 93,0 5 35,0 95,0 6 35, ,0 92,0 8 34,0 95,0 9 34,0 95, ,0 99, ,0 95, ,0 98, ,0 98, ,0 96, ,0 97, ,0 99, ,0 95, ,0 96, ,0 93, ,0 98, ,0 98, ,0 91, ,0 90, ,0 95, ,0 96,0 MV 34,3 96,0 SD 0,9 3,3 CV 2,6 % 3,5 %

18 Tabell II Metodjämförelse för HbA1c analys mellan metod 1: Variant TM II Turbo och metod 2: DCA Vantage TM, resultat av 35 patientprover. Metod METOD 1: METOD 2: 1 81,0 76,0 2 45,0 40,0 3 54,0 51,0 4 68,0 69,0 5 32,0 31,0 6 37,0 34,0 7 72,0 67, ,0 98,0 9 33,0 33, ,0 39, ,0 113, ,0 61, ,0 43, ,0 47, ,0 65, ,0 71, ,0 104, ,0 79, ,0 66, ,0 43, ,0 49, ,0 38, ,0 88, ,0 25, ,0 68, ,0 32, ,0 64, ,0 40, ,0 55, ,0 43, ,0 80, ,0 33, ,0 58, ,0 82, ,0 82,0 MV METOD 1: 59,6 SD METOD 1: 22,9 MV METOD 2: 57,7 SD METOD 2: 22,6

19 Tabell III Resultat för normal HbA1c kontroll och abnormal HbA1c kontroll för DCA Vantage TM (mmol/mol). Förväntat värde Normal 35,5 Abnormal 95,6 1 37,0 98,0 2 37,0 97,0 3 36,0 95,0 4 36,0 97,0 5 34,0 95,0 6 36,0 97,0 7 36,0 93,0 8 36,0 91,0 9 36,0 90, ,0 91, ,0 98, ,0 90, ,0 93, ,0 95, ,0 95,0 MV: 36,1 94,3 SD: 1,0 2,8 CV: 2,7 3,0

20 Kalmar Växjö Kalmar Tel Lnu.se