18-19 december 2006 Christina Fjæraa Doktorand, avd för kemi och biomedicinsk vetenskap Karlstads Universitet Christina.fjaeraa@kau.se 054-7001687 Immunologi Laboration; Epstein Barr Virus (EBV) serologi. Oxblodshemolysat test (OCH) Epstein Barr Virus ELISA (EBNA) 1
OCH Referenser. Jawas et al: Medical Microbiology. Delves, Martin, Burton and Roitt: Roitt s essential immunology (eleventh edition). Kapitel, 6 och 7. Serologen, Centralsjukhuset Karlstad Inledning. Mononucleosis infectiosa (MI) är en infektionssjukdom som orsakas av Epstein Barr- virus (EBV). Symptomen är långvarig feber och lymfkörtelsvullnader. Sjukdomen drabbar framför allt unga människor och kallas i USA för kissing disease. EBV ses även i cancerceller hos patienter med Burkitt s lymfom. Hos patienter med MI kan man i blodutstryk påvisa retningspåverkade lymfocyter (kallas även McKinley- celler eller aktiverade lymfocyter), heterofila antikroppar och specifika EBV antikroppar. EBV infekterar B- lymfocyter. In vitro metoder visar att dessa infekterade B- lymfocyter transformeras och kommer tidigt att producera s.k. heterofila antikroppar som är av IgM typ. Mer än 95 % av alla patienter med primär EBVinfektion har heterofila IgM- antikroppar. Heterofila antikroppar är dock inte specifika, så de kan skyllas en rad olika tillstånd som CMV- infektion, hepatit, primär Herpes- simplex- tonsillit, maligna blodsjukdomar, tidigare nämnda Burkitt s lymfom mm. Heterofila antikropparna har bl. a. förmågan att agglutinera fårblodkroppar (Paul Bunnels reaktion) samt binda till nöterytrocyter (OCH). Varför dessa heterofila antikroppar har denna specificitet är idag inte förklarat. En vanlig metod för att identifiera heterofila antikroppar är OCH- metoden. Det finns även olika snabbtest av varierande kvalité kommersiellt tillgängliga. 2
Material. Späd veronalbuffert (VB) 1/5 i destillerat vatten. Marsvinskomplement 15 % i VB (färdigt på is). OBS: komplementet har en kontinuerlig omsättning och är därför på samma sätt som enzymer känsliga för optimala temperaturer. Det betyder att vid 4ºC är de hyfsat satta ur funktion. Se till att hålla dem där, annars kommer de sista som använder komplementet att få enbart negativa prov! Nöterytrocyter 1% i VB (färdigt på is). OBS: håll kallt. 10 patientprover (Serum) Inaktiverade vid 56ºC 35 60 minuter. U- bottnade mikrotiterplattor. Utförande. 1. Ta fram och märk en U- bottnad mikrotiterplatta. A B C D E F G H -K +K P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 2. Tillsätt 90 µl spätt VB till alla brunnarna i rad A och 50 µl spätt VB till alla brunnarna i rad B-H. Undvik bubblor! 3
3. Blanda kontrollerna och proverna ordentligt genom att vända på rören några gånger. Tillsätt 10 µl positiv kontroll i brunn A1 och 10 µl negativ kontroll i brunn A2. Tillsätt 10 µl patientprov 1 i brunn A3, 10 µl patientprov 2 i brunn A4 osv. till och med patientprov 10 i brunn A12. 1. Skaka plattan försiktigt (knacka med handen på sidan av plattan, var försiktig så att inget åker ur brunnen!) 2. Titrera med 50 µl. Detta innebär att du från brunn A1 suger upp 50 µl av blandningen positiv kontroll och VB och pytsar i brunn B1. Blanda genom att suga upp och pytsa ut 3-4 gånger. Sug upp 50 µl från brunn B1 och pytsa i brunn C1 och blanda. Fortsätt tills du kommer till brunn H1. Du avslutar genom att suga upp 50 µl från brunn H1 och kasta bort. Fortsätt sedan på motsvarande sätt med den negativa kontrollen och de 10 patientproverna. Räkna ut spädningen i brunnarna. (Serumspädning 1/?). 3. Tillsätt 25 µl komplement till alla brunnarna. OBS: håll komplementet på is! 4. Tillsätt 50 µl nöterytrocyter till alla brunnarna. OBS: håll på is! 5. Skaka plattan försiktigt (som ovan). Inkubera 1 timme i 37ºC. (Värmeskåp). 4
Avläsning och redovisning. Reaktion Utseende - Kompakt knapp i botten på brunnen. +/- Liten ring i botten på brunnen. + Stor ring/ matta av agglutinerade partiklar i stora delar av brunnen. ++ Matta av agglutinerade partiklar täcker hela brunnen. Läs av och se om det har inträffat en agglutination. Vad har hänt i brunnarna? Försök att beskriva både en positiv och en negativ reaktion. Bestäm titrarna för positiv kontroll och patientproven samt ange om det är en specifik reaktion. I denna analysmetod räknas serumspädningen. 5
Epstein Barr Nuclear Antigen (EBNA) Referenser. Jawetz et al: Medical Microbiology Delves, Martin, Burton and Roitt: Roitt s essential immunology (eleventh edition). Kapitel, 6 och 7. Biotest- Anti-EBV IgG ELISA manual. Inledning. Antikroppsmönstret mot olika EBV- antigen varierar beroende på vilken fas av EBV- infektion patienten är i. Efter en primärinfektion med Epstein Barr virus (EBV) bildas olika EBV- antikroppar. En av dessa är IgG mot EBNA (kärnantigen). Antikropparna kommer efter 1-6 månader och kvarstår livet ut. Om en patient har IgG mot EBNA kan man därmed utesluta primär EBV- infektion. Utförande. Skriv ut EBNA- manual från Biotest (länk finns på kurshemsidan) och följ instruktionerna. Under testutförande, spädning av prov 1:21, välj förspädning i rör. Ni har 10 serumprover. Blank, positiv och negativ kontroll skall köras som dubbelprov, patientproverna som enkelprov. Ni skall därför ta loss två rader med brunnar från racket i kitet. Ert pipetterings- schema kommer att se ut som följande: 1 2 A Blank P3 B Blank P4 C +K P5 D +K P6 E -K P7 F -K P8 G P1 P9 H P2 P10 6
Tolkningschema för resultat från OCH och EBNA. EBNA - EBNA + OCH OCH + Ingen ev. mycket tidig EBVinfektion. Ingen primär EBVinfektion, men har haft det tidigare. Primär EBV- infektion eller annan virusinfektion. Svagt +: sen primärinfektion. Starkt +: kronisk EBVinfektion. HIV? Leukemi? Lymfom? 7