KOMPONENTER OCH REGENSER I STSEN Följande ingår i Directigen Flu +-testsatsen ColorPC-anordningar 20 Varje anordning med flödeskontrollenhet, innehåll

Directigen Flu + För differentierad direkt detektion av influenza - och -antigen Se symbolförteckningen vid slutet av bipacksedeln U L006712J 2006/09 Svenska VSEDD NVÄNDNING Directigen Flu +-testen är ett snabbt in vitro immunanalysmembrantest för direkt och kvalitativ detektion av influenza - och -virusantigener i prover från symtomatiska patienter i form av nasofarynxsköljning, nasofarynxaspirat, nasofarynxpinne, pinnprov från nedre näsmusslan, svalgpinne eller bronkoalveolärt lavage Directigen Flu +-testen är en differentierande test, och influenza -virusantigener kan därför skiljas från influenza -virusantigener i en enda test Testen är avsedd att användas som hjälpmedel vid diagnostik av infektioner med influenza - och -virus lla negativa resultat bör bekräftas med cellodling därför att negativa resultat utesluter inte infektion med influenzavirus och bör inte användas som ensam hållpunkt för behandling eller andra behandlingsbeslut Directigen Flu +-testen är ej avsedd för detektion av influenza C SMMNFTTNING OCH FÖRKLRING Influenza är en akut virussjukdom med årstidsbunden incidens Sjukdomen debuterar i sin klassiska form med plötslig feber, frossbrytningar, huvudvärk, muskelvärk och torrhosta De kliniska symtomen avklingar oftast inom en vecka om inte komplikationer tillstöter Influenza - eller -virus orsakar huvuddelen av de kliniskt betydelsefulla sjukdomsfallen, medan influenza C-virus endast ger en lindrig sjukdom som huvudsakligen drabbar de övre luftvägarna Patienter som misstänks ha influenza kan i vissa fall få lindring av antivirala medel mantadin 1 och rimantadin 1 finns att tillgå både för profylax och behandling, men endast för influenza Zanamivir 1 och oseltamivir 1 finns tillgängliga för behandling av både influenza - and Hos vuxna kan behandling med något av dessa medel lindra sjukdomens svårighetsgrad och duration om de sätts in inom 48 h efter insjuknandet Eftersom behandlingsmöjligheterna utvidgats och nu även omfattar alternativ för behandling av influenza, är det viktigt att snabbt kunna särskilja influenza från influenza, så att behandlande läkare får möjlighet att välja en selektiv antiviral intervention Eftersom endast amantadin och rimantadin är indicerade som influenzaprofylax, är det viktigt att fastställa huruvida det är influenza som orsakar symtomatisk sjukdom inom en viss institution (exempelvis ett sjukhem) eller område, så att lämpliga förebyggande åtgärder kan vidtas för känsliga patienter Det är därför viktigt att inte bara snabbt fastställa om influenzasjukdom föreligger utan också bestämma typen av föreliggande influenzavirus land de förfaranden som används för att diagnostisera influenza typ och kan nämnas snabb-immunanalys, immunfluorescens på direktprov, RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction), serologisk analys och bekräftande renodling 2-8 Immunfluorescens innebär att prover som fixerats på objektglas färgas med fluorescensmärkta antikroppar för att därefter granskas i fluorescensmikroskop 4,9,10 Vid odling isoleras virus först i cellodling, efterföljt av hemadsorption, immunfluorescens eller neutraliseringstester för att bekräfta närvaro av influenzavirus 10-12 Directigen Flu + antigendetektionstest är en immunmembranfilteranalys för detektion av influenza - eller -antigener som extraherats från lämpliga prover från symtomatiska patienter Testen tar totalt mindre än 15 min, och positiv reaktion fastställs genom en synlig färgförändring ntigen drift utgör inget problem för Directigen Flu +-testen, eftersom målantigenerna utgörs av nukleoproteiner, vilka är typspecifika och höggradigt bevarade 13-15 Eftersom Directigen Flu + är snabb och går lätt att utföra kan den utnyttjas som en akuttest för detektion av influenza - och -antigener, för snabb, relevant information vid diagnostisering av influenza nvändning av Directigen Flu + för differentiering av influenza och ger möjlighet till mer selektiv antiviral behandling PRINCIPER FÖR METODEN D Directigen Flu +-testen inleds med att influenza - eller -virusantigener extraheras från prover från patientens andningsvägar Det extraherade provet får passera genom en filterenhet ned i två brunnar i en ColorPC-anordning Eventuella influenza - eller -antigener från viabla eller icke viabla viruspartiklar i provet binds ospecifikt till ett triangelformat område på membranytan i - och -brunnen under det att provet passerar genom flödeskontrollenheten Efter att membranet tvättats påbörjas detektion av antigener fångats upp på membranet Monoklonala antikroppskonjugat (2) specifika för influenza -nukleoproteinantigenet tillsätts till testanordningens övre -brunn Monoklonala antikroppskonjugat specifika för influenza -nukleoproteinantigenet tillsätts till testanordningens nedre -brunn Efter att de monoklonala antikroppskonjugaten har tillsatts till ColorPC-membranet, bindsdessa till det adsorberade antigenet Kromogenet tillsätts sedan efter tvätt av membranet och får inkubera i fem min Efter tillsats av en reagens som hindrar fortsatt färgutveckling kan resultaten avläsas Utveckling av en lila triangel på membranet i antingen - eller -brunnen utgör ett positivt resultat för influenza respektive Om det endast utvecklas en lila kontrollpunkt utan någon synlig triangel är testen negativ

KOMPONENTER OCH REGENSER I STSEN Följande ingår i Directigen Flu +-testsatsen ColorPC-anordningar 20 Varje anordning med flödeskontrollenhet, innehållande kontrollpunkter med rekombinanta influenza (H1N1) och (Lee 40) -antigener i mitten av - respektive -brunnmembranet är förpackad i en foliepåse med torkmedel Extraction Reagent E 9,9 ml Extraktion, 1,6 % mukolytiskt agens och 7,4 % detergenter, med 0,2 % natriumazid (konserveringsmedel) Wash Reagent 1 5,1 ml Tvätt, 50 mm Tris och kanin-igg med 0,2 % natriumazid (konserveringsmedel) Detection Reagent 2 2,3 ml Detektion, monoklonala anti-influenza -antikroppar (från mus, klon 84 och 85), alkaliskt fosfataskonjugerade, med 0,2 % natriumazid (konserveringsmedel) Detection Reagent 3 2,3 ml Detektion, monoklonala anti-influenza -antikroppar (från mus, klon 9), alkaliskt fosfataskonjugerade, med 0,2 % natriumazid (konserveringsmedel) Wash Reagent 4 6,5 ml Tvätt, 5 % butanol, 2 M urea och 100 mm hepes med 0,2 % natriumazid (konserveringsmedel) Wash Reagent 5 10,5 ml Tvätt, 50 mm Tris, 150 mm NaCl och 16 mm inhiberande substans med 0,2 % natriumazid (konserveringsmedel) Substrate Reagent 6 5,8 ml Substrat, 0,73 mm kromogen Stop Reagent 7 4,1 ml Stopp, 150 mm citronsyra Control +/- 2,0 ml Flu -Positive och Flu -Negative Control, influenza -antigen (inaktivt rekombinant nukleoprotein, H1N1) med 0,1 % natriumazid (konserveringsmedel) Control +/- 2,0 ml Flu Positive och Flu Negative Control, influenza -antigen (inaktivt rekombinant nukleoprotein, Lee 40) med 0,1 % natriumazid (konserveringsmedel) DispensTube-rör 20 Rör för extrahering av prov och tillförsel av prov till anordningen DispensTube-spetsar 20 Spetsar för filtrering av prov som tillförs anordningen Varningar och försiktighetsbeaktanden: vsedd för in vitro-diagnostik 1 Om infektion med ett nytt influenza -virus misstänks, baserat på aktuella kliniska och epidemiologiska screeningskriterier som rekommenderats av allmänna hälsomyndigheter, bör prover insamlas med iakttagande av lämpliga infektionsförebyggande åtgärder vid nya virulenta influenzavirus och skickas till SL (Statens bakteriologiska laboratorium) eller till lokala laboratorier för analysering Virusodling bör inte utföras i dessa fall om inte en SL 3+-inrättning finns tillgänglig för mottagning och odling av proverna 2 Patogena mikroorganismer, inklusive hepatitvirus, humant immunbristvirus och nya influenzavirus, kan förekomma i kliniska prover "llmänna försiktighetsbeaktanden" 16-19 och institutionens riktlinjer bör följas vid hantering, lagring och kassering av alla prover och föremål som kontaminerats med blod eller andra kroppsvätskor ehållare och annat kontaminerat material skall steriliseras genom autoklavering före bortskaffning 3 Skillnader i prestanda kan ses när denna test används på prover från vuxna kontra barn, men specifika skillnader är inte kända 4 Reagenser får ej användas efter utgångsdatum 5 Reagenser från satser med olika partinummer får ej blandas Flasklocken får ej bytas ut mellan olika reagensflaskor 6 ColorPC-anordningen får ej återanvändas ndra inkuberingstider och temperaturer än de här angivna kan medföra felaktiga resultat 7 För att tillförsäkra korrekt tillförsel av droppar håll reagensflaskorna lodrätt (ca 2,5 cm ovanför röret eller membranytan på ColorPC) och dispensera försiktigt en droppe i taget i rask följd 8 Undvik att låta reagenserna komma i kontakt med hud och slemhinnor Skölj rikligt med vatten och kontakta läkare om reagenser ändå kommer i kontakt med hud eller slemhinnor 9 Reagenser innehåller natriumazid, vilket kan vara skadligt vid inhalation, om det nedsväljs eller vid hudkontakt Vid kontakt med syror frigörs mycket giftig gas Vid kontakt med huden, skölj omedelbart med rikligt med vatten Natriumazid kan reagera med bly- och kopparledningar och bilda högexplosiva metallazider Vid bortskaffning skall produkten spolas ut med stora mängder vatten för att förhindra ansamling av azid 10 nvänd pinnar med polyester- eller rayontopp med en aluminiumtråd för provtagning med nasofarynxpinne (NPS) Det har fastställts att kalciumalginatpinnar ej kan användas med Directigen Flu + 11 Reagenserna Control +/- och Control +/- är beredda från odlingar av rekombinanta celler, inte från virusodlingar Satsen skall ej användas om reagenserna Control +/- och Control +/- inte ger korrekt resultat 12 Ta ut ColorPC-anordningen ur foliepåsen omedelbart före användningen nvänd ej anordningen om torkmedel saknas i foliepåsen Förvaring och hantering: Förvaras vid rumstemperatur eller i kylskåp (2-25 ºC ) FÅR EJ FRYSS PROVTGNING OCH -HNTERING Transport och förvaring av prover Transportera färska prover till laboratoriet så snabbt som möjligt i lämpligt flytande transportsystem som hålls på is eller nedkylt till 2-8 ºC ehandla proverna så snart som möjligt efter provtagningen Vid behov kan proverna förvaras vid 2-8 C i högst 72 h eller vid -20 C i högst 7 dagar efter provtagningen Nytagna prover är att föredra framför frysta, eftersom frysningen kan försämra sensitiviteten Undvik upprepade nedfrysnings-/upptiningscykler Förvara ej prover i en självavfrostande frys 2

Det är mycket viktigt att korrekta metoder för provtagning och -beredning används Proverna får ej centrifugeras innan de testas med Directigen Flu +, eftersom avlägsnande av cellmaterial försämrar testens känslighet Prover som tagits tidigt i sjukdomsförloppet ger de högsta virustitrarna Transportmedier: Följande transportmedier har prövats och befunnits vara kompatibla med Directigen Flu +testen: Fysiologisk koksaltlösning Trypticase sojabuljong plus 0,5 % S Fosfatbuffrad koksaltlösning (PS) Trypticase sojabuljong plus 0,5 % gelatin PS plus 0,5 % gelatin Earle s Minimal Essential Medium (EMEM) PS plus 0,5 % bovint serumalbumin (S) EMEM med 0,5 % S Kalvinfusionsbuljong (Veal Infusion roth, VI) EMEM med 1 % S VI plus 0,5 % S EMEM med 0,5 % laktalbuminhydrolysat Viral Culturette EMEM med 1,0 % laktalbuminhydrolysat M4-medium CultureSwab med Stuart s Medium (se "Tillgänglighet") M5-medium CultureSwab med flytande mies-medium (se "Tillgänglighet") artels medium Sackarosfosfat ndra transportmedier kan användas om korrekt lämplighetstestning utförs Som en försiktighetsåtgärd bör man lämplighetstesta alla transportmedier med Directigen Flu + innan de tas i bruk För att lämplighetstesta transportmedier kan man ympa alikvoter av medierna med ett känt positivt material (som ej är den Control +/- eller Control +/- som ingår i satsen) och ett känt negativt material och därefter testa med analysen Korrekta resultat måste erhållas Provtagning och -förberedelse Följande provtyper kan användas: nasofarynxsköljning, nasofarynxaspirat, nasofarynxpinne, pinnprov från nedre näsmusslan, svalgpinne samt bronkoalveolärt lavage Inadekvat provtagning, oriktig provhantering och/eller transportering kan ge ett falskt negativt resultat; därför är övning i provtagning starkt rekommenderat på grund av vikten av bra provkvalitet och noggranna testresultat OS! Kraftigt slemhaltiga kan ibland inte absorberas genom ColorPC-membranet eller kan ge ej tolkningsbara resultat Sådana prover kan antingen spädas 1:4 med 0,9 % koksaltlösning eller virustransportmedium, eller justeras till McFarland-standard 1,0 varefter man blandar väl och testar en 200 µl-alikvot Förfarande vid användning med prov från nasofarynxsköljning och bronkoalveolärt lavage 1 Skölj- eller lavagevolymer på 2-3 ml rekommenderas 2 lltför stora skölj- eller lavagevolymer kan medföra försämrad sensitivitet 3 ehandla provet så som beskrivs i "Testförfarande" Förfarande vid användning med nasofarynxaspirat 1 Nasofarynxaspirat med en provvolym under 0,5 ml måste spädas i 2 ml transportmedium eller koksaltlösning innan de behandlas 2 spirerade prover på över 0,5 ml kräver tillsats av minst 4 ml transportmedium eller koksaltlösning 3 ehandla provet så som beskrivs i "Testförfarande" Förvarande vid användning med nasofarynxpinne, pinnprov från nedre näsmusslan eller svalgpinne 1 Svalgpinnar kan behandlas utan spädning med transportmedium genom direkt extraktion, så som beskrivs under "Testförfarande" Svalgpinnar kan även placeras i 1-2 ml transportmedium eller koksaltlösning omedelbart efter provtagning 2 Nasofarynxpinnar och pinnprover från nedre näsmusslan skall placeras i 1-2 ml transportmedium eller koksaltlösning omedelbart efter provtagning 3 Rör om väl med pinnen i transportmediet eller koksaltlösningen 4 vlägsna så mycket vätska som möjligt från pinnen 5 Kasta pinnen i lämpligt kärl 6 ehandla provet så som beskrivs under "Testförfarande" FÖRFRNDEN Tillhandahållet material: Se "Komponenter och reagenser i satsen" beträffande tillhandahållet material Material som krävs men ej medföljer: Erforderligt material och laboratorieutrustning för transport, förvaring, hantering och allokering av prover Vortex-mixer Testens prestanda: Se "VRNINGR OCH FÖRSIKTIGHETSEKTNDEN", "PROVTGNING OCH -HNTERING " och "TOLKNING V RESULTT" Reagenser, prover och ColorPC-anordningarna vara vid rumstemperatur (15-30 C) när de används TESTFÖRFRNDE Placera en DispensTube på avsedd plats i arbetsstationen Förberedelse av ColorPC-anordningen Ta ut en ColorPC-anordning ur foliepåsen omedelbart innan den skall användas Tryck ned flödeskontrollenheten så att den sitter stadigt i ColorPC-anordningens båda brunnar 3

E or E Provextraktion lla prover, utom svalgpinnar utan transportmedium: landa försiktigt Reagens E och dispensera 8 droppar Reagens E i ett DispensTube-rör landa provet väl Pipettera 200 µl prov i DispensTube-röret Svalgpinnar utan transportmedium: landa försiktigt Reagens E och dispensera 16 droppar Reagens E i ett DispensTube-rör Sätt ned provpinnen i DispensTube-röret Snurra pinnen i 15-30 sec och kläm samtidigt då och då på provtoppen genom väggarna på DispensTube-röret vlägsna provpinnen och kläm den samtidigt så att överflödig vätska pressas ut OS! Kvalitetskontroll Control +/- eller Control +/- kan användas i stället för patientprov för kvalitetskontroll Dispensera 8 droppar Reagens E i DispensTube-röret, och tillsätt därefter 4 droppar väl blandad Control +/eller Control +/- landa väl Följ anvisningarna under "Testförfarande" och dispensera droppar av extraherad Control +/omväxlande i båda brunnarna på en enstaka testanordning Control +/- fungerar både som positiv kontroll för influenza och som negativ kontroll för influenza Upprepa förfarandet i en annan anordning med Control +/- Control +/- fungerar både som positiv kontroll för influenza och som negativ kontroll för influenza Sätt i en DispensTube-spets i DispensTube-röret Vortexblanda eller blanda ordentligt OS! nvänd inte spetsar från andra Directigen-produkter Vänd DispensTube-röret uppochner och kläm försiktigt samtidigt som du håller i övre delen av röret, bort från spetsen OS! Om man klämmer på röret för nära spetsen kan spetsen skjutas ut och innehållet i röret läcka ut Droppe Dispensera det extraherade provet droppvis (men undvik för 1 3 5 7 mycket bubblor) genom att omväxlande droppa enstaka droppar i - resp -testbrunnen tills 4 droppar har tillsatts till varje brunn i ColorPC-anordningen Totalt skall alltså 8 droppar från varje extraherat prov tillsättas till varje enskild tes- 2 4 6 8 tanordning När man testar extraherade kontroller, måste den extraherade Control +/- tillsättas till båda brunnarna i en enstaka ColorPC-anordning, och på motsvarande sätt måste den extraherade Control +/- tillsättas båda brunnarna i en enda ColorPC-anordning Vänta medan provet absorberas fullständigt Om provet inte absorberats fullständigt av anordningen inom 5 min, skall provet spädas enligt anvisningarna i avsnittet "Provtagning och -förberedelse" och testen upprepas C Färgutveckling Ta bort flödeskontrollenheten Kassera den som biologiskt riskavfall 1 Reagens 1 - blanda försiktigt Tillsätt 2 droppar till varje brunn Vänta tills reagensen absorberats fullständigt 2 Reagens 2 - blanda försiktigt Tillsätt 2 droppar till enbart -brunnen Gå genast vidare med tillsats av Reagens 3 4

3 Reagens 3 - blanda försiktigt Tillsätt 2 droppar till enbart -brunnen Vänta tills reagenserna i - och -brunnen absorberats fullständigt Låt stå i 2 min 4 Reagens 4 - blanda försiktigt Tillsätt 3 droppar till varje brunn Vänta tills reagensen absorberats fullständigt 5 Reagens 5 - blanda försiktigt Tillsätt 3 droppar till varje brunn Vänta tills reagensen absorberats fullständigt 6 Reagens 6 - blanda försiktigt Tillsätt 3 droppar till varje brunn Vänta tills reagensen absorberats fullständigt (OS! Membranet blir eventuellt gult) Låt stå i 5 min 7 Reagens 7 - blanda försiktigt Tillsätt 2 droppar till varje brunn Vänta tills reagensen absorberats fullständigt TOLKNING V RESULTT Läs av testen under god belysning och anteckna resultaten Vid behov kan resultaten läsas av upp till 9 h efter det att Reagens 7 tillsatts (stoppreagensen) Ett positivt resultat bör rapporteras som positivt med avseende på närvaro av influenza - och/eller -antigen Ett negativt resultat bör rapporteras som presumtivt negativt med avseende på närvaro av influenza -/-antigen Positiv test för influenza (antigen närvarande) - En lila triangel (som kan ha varierande intensitet) syns i -brunnen på ColorPC-membranet och indikerar att influenza -antigen har påvisats i provet Detta resultat identifierar inte någon specifik subtyp av influenza -virus akgrundsytan skall vara ljusgul till ljust lila Det skall synas en lila kontrollpunkt i mitten av triangeln, såvida den inte överskuggas av en intensiv positiv reaktion Influenza -positiv Influenza -negativ Positiv test för influenza (antigen närvarande) - En lila triangel (som kan ha varierande intensitet) syns i -brunnen på ColorPC-membranet och indikerar att influenza -antigen har påvisats i provet akgrundsytan skall vara ljusgul till ljust lila Det skall synas en lila kontrollpunkt i mitten av triangeln, såvida den inte överskuggas av en intensiv positiv reaktion Influenza -positiv Influenza -negativ 5

Negativ test för influenza eller (inget antigen påvisat i respektive brunn eller brunnar) - Ingen lila triangel syns i vare sig -brunnen eller -brunnen, eller i båda brunnarna, vilket indikerar att influenza -antigen, influenza -antigen eller bådadera inte kunnat påvisas i provet Dessa resultat exkluderar inte infektion med influenzavirus En lila kontrollpunkt i antingen -brunnen, -brunnen eller bådadera på ColorPC-membranet indikerar att testen utförts korrekt och att reagenserna fungerat akgrundsytan skall vara ljusgul till ljust lila Negativ för influenza eller Ej tolkningsbar med avseende på influenza och Ej tolkningsbar test - Testen är ej tolkningsbar vare sig med avseende på influenza, influenza eller bådadera om man varken kan se en lila punkt eller en lila triangel i respektive brunn Eventuella ofullständiga trianglar skall även betraktas som ej tolkningsbara testresultat Om testen inte kan tolkas, skall den upprepas Testresultatet är inte heller tolkningsbart med avseende på influenza, influenza eller bådadera om en vit triangel är synlig på ColorPC-membranet och hela det omgivande bakgrundsmembranet är lila En svag kontrollpunkt kan eventuellt vara synlig i mitten av den vita triangeln Dessutom gäller att testresultatet ej är tolkningsbart om hela membranytan är lila och det inte syns någon kontrollpunkt För att komma till rätta med dessa problem skall man späda provet 1:4, antingen med 0,9 % koksaltlösning eller med transportmedium, och därefter upprepa testen Kraftigt slemhaltiga kan ibland inte absorberas genom ColorPC-membranet eller kan ge ej tolkningsbara resultat Sådana prover kan spädas 1:4 med koksaltlösning, blandas väl, och testas på nytt Kvalitetskontroll: Varje Directigen Flu + ColorPC-anordning innehåller både positiva och negativa interna metodkontroller Den lila kontrollpunkten i - och -brunnarna utgör en intern positiv metodkontroll som bekräftar att anordningen är immunologiskt intakt, att reagensen fungerar korrekt och att korrekt testförfarande har följts Obs! Kontrollpunktens intensitet kan variera mellan - och -brunnarna Membranområdet runt triangeln utgör den interna negativa metodkontrollen för anordningen Om det i detta område saknas markant färgutveckling som överskuggar triangeln eller kontrollpunkten, har testen utförts på korrekt sätt Flytande kontroller för positiv Control +/- och Control +/- medföljer även varje sats Dessa kontroller tillhandahålls för ytterligare kvalitetskontroller, för att demonstrera en positiv eller negativ reaktion Som ett minimum bör de flytande kontrollerna köras som en kvalitetskontroll för varje levererat parti Uppkomsten av en lila triangel på membranet i ColorPC-anordningens -brunn vid test av Control +/-, och i -brunnen vid test av Control +/-, är ytterligare en indikation på att membranet binder influenzaantigen på korrekt sätt Om det enbart uppstår en lila kontrollpunkt i ColorPC-anordningens -brunn när Control +/- används utgör detta ett korrekt negativt kontrollresultat för influenza som visar att reagensen fungerar korrekt och att korrekt testförfarande har använts På motsvarande sätt gäller att uppkomst av enbart en lila kontrollpunkt i -brunnen vid användning av Control +/utgör ett korrekt negativt kontrollresultat för influenza Satsen skall ej användas om Control +/- och Control +/- inte ger korrekta resultat De flytande kontrollerna kan också användas för att demonstrera en svagt positiv reaktion En svagare positiv reaktion kan demonstreras genom att man späder både Control +/- och Control +/- tillsammans, i ett och samma DispensTube -rör (2 droppar Control +/- och 2 droppar Control +/- tillsätts till 10 droppar Extraction Reagent E) Prestandan hos reagenserna och den använda tekniken kan också utvärderas med användning av känt positiva eller negativa prover Kvalitetskontroll måste utföras i enlighet med gällande bestämmelser eller ackrediteringskrav samt laboratoriets etablerade procedurer för kvalitetskontroll Det rekommenderas att användaren konsulterar tillämpliga CLSI (tidigare NCCLS)-riktlinjer och CLI-föreskrifter för lämpliga kvalitetskontrollförfaranden METODENS EGRÄNSNINGR Etiologin för luftvägsinfektion som orsakas av andra mikroorganismer än influenza - och -virus kan ej fastställas med denna test Directigen Flu +-testen kan detektera både viabla och icke viabla influenza - och -viruspartiklar Directigen Flu +-testens prestanda är avhängig antigenbelastningen och korrelerar inte nödvändigtvis med cellodlingar utförda på samma prov Låga nivåer av virusutsöndring kan ge ett falskt negativt resultat; därför utesluter ett negativt test inte helt möjligheten av en infektion med influenza, eller både influenza och Liksom med alla diagnostiska metoder skall de resultat som erhålls med Directigen Flu + vägas samman med annan klinisk information som är tillgänglig för läkaren Prestanda för influenza fastställdes när influenza /H3 och /H1 var de dominerande influenza -virus i cirkulationen När andra influenza -virus uppstår kan prestanda variera arn tenderar att utsöndra virus under längre tidsperioder jämfört med vuxna, vilket kan resultera i skillnader avseende känslighet mellan vuxna och barn Positiva och negativa prediktiva värden är starkt beroende av prevalens Falska positiva testresultat är mer sannolika under perioder med låg influenzaaktivitet när prevalensen är måttlig till låg Directigen Flu +-testens validitet vad gäller identifiering/bekräftelse av cellodlingsisolat har ej bevisats, och testen bör ej användas för detta ändamål Testens prestanda har ej fastställts med avseende på kontroll av antiviral behandling av influenza FÖRVÄNTDE VÄRDEN Frekvensen av positiva tester vid influenzatestning varierar beroende på provtagningsmetod, system för hantering/transport, påvisningsmetod, årstid, patientens ålder och bostadsort och - framför allt - den lokala sjukdomsprevalensen Prevalensen av influenza varierar från år till år I US har under de tre senaste åren prevalensen legat mellan 28 och 34 % 20 Incidensen av influenza -infektion är mer sporadisk än vad fallet är för influenza -infektion Under säsongen 1999-2000 var i US prevalensen av influenza hos patienter som fått diagnosen influenza 99,6 %, jämfört med en prevalens på 0,4 % för influenza 20 aserat på cellodlingsmetod, varierade den observerade 6

prevalensen i US under perioden för den kliniska prövningen av denna produkt mellan 0 % och 33,9 % för influenza och mellan 0 % och 16,2 % för influenza Den genomsnittliga prevalens som iakttogs under den kliniska prövningen av Directigen Flu + var 17,9 % för influenza och 2,6 % för influenza KLINISK PRESTND Prestandan hos Directigen Flu +-testen fastställdes i en multicenterstudie som utfördes vid sex kliniska centra och två läkarmottagningslaboratorier under influenzasäsongen 1999-2000 De kliniska centra var belägna i Kanada, Hong Kong och i geografiskt skilda områden i US Totalt 1262 prover i form av nasofarynxaspirat, nasofaryngxsköljning, nasofarynxpinnar, provpinnar från nedre näsmusslan, provpinnar från näsa/svalg, svalgpinnar eller bronkoalveolärt lavage från 1046 patienter med influenzasymtom testades med Directigen Flu +-testen Vid ett kliniskt centrum togs provpinnar både från nasofraynx och från nedre näsmusslan på alla 216 patienterna Provpopulationerna innefattade 58 frysta, arkiverade prover vilka utgjordes av på förhand utvalda influenza -positiva, influenza -positiva och influenza--/-negativa prover Fördelningen av de frysta proverna är angiven i var och en av tabellerna nedan De prover som utvärderades i studien samlades in och transporterades till laboratoriet i enlighet med rutinerna för varje laboratorium Nedanstående tester utfördes på varje prov: Directigen Flu +, cellodling och direktfärgning med hjälp av fluorescerande antikroppar (DF, direct fluorescent antibody) Eventuellt återstående prover arkiverades vid högst -20 ºC Metoder Cellodling: För cellodlingen ympades en del av provet i celler från cellinjerna Rhesus Monkey Kidney (RMK) eller Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) Cellerna undersöktes med avseende på förekomst av cytopatologiska effekter (CPE) Förekomst av influenza eller i infekterade celler bekräftades med direktfärgning med hjälp av fluorescerande antikroppar (DF-teknik) Prover som var negativa för CPE efter fjorton dagar färgades med DF för verifiering av det negativa resultatet Direktfärgning av provet med DF: Vid DF-testning direkt på provet användes en del av provet till ett utstryk som undersöktes med direkt fluorescerande antikroppar mot influenza och RT-PCR: RT-PCR utfördes på alla tillgängliga prover som var negativa i odlingar och positiva i DF-test direkt på provet Dessutom utvärderades en undergrupp av proverna med andra resultatkombinationer med RT-PCR Klinisk noggrannhet: För alla utvärderade prover var den totala sensitiviteten hos Directigen Flu +-testen 86,2 % för influenza respektive 80,8 % för influenza, vid jämförelse med odling Den totala specificiteten var 90,7 % för influenza och 99,5 % för influenza, vid jämförelse med odling För influenza, var 96 prover odlingsnegativa och Directigen-positiva DF direkt på provet var positivt för 77 av de 96 proverna RT-PCR utfördes på 86 av de 96 proverna; totalt var 78 positiva enligt RT-PCR Frekvensen av ej tolkningsbara resultat med Directigen Flu + var 0,08 % för både influenza och influenza Nasofarynxaspirat n=350 (1 ej tolkningsbart Directigen-resultat är ej medtaget i tabellen och ej heller vid uppskattning av prestanda för metoden Cellodlingsresultat +/- -/+ -/- Directigen Flu + +/- 44 0 26* -/+ 0 28 6** -/- 2 4 239 *v de 26 proverna var 20/26 positiva enligt DF och 23/25 positiva enligt RT-PCR **v de 6 proverna var 6/6 negativa enligt DF och 5/5 negativa enligt RT-PCR Nasofarynxprov innefattar: Nasofaryngxsköljning och/eller nasofarynxpinne n=512 95 % CI Influenza Sensitivitet 95 7% 44/46 85 2-99 5 Specificitet 91 4% 277/303 87 6-94 3 Influenza Sensitivitet 87 5% 28/32 71 0-96 5 Specificitet 98 1% 311/317 95 9-99 3 Cellodlingsresultat 95 % CI +/- -/+ -/- Influenza Sensitivitet 88 5% 100/113 81 1-93 7 Directigen Flu + +/- 100 0 41* Specificitet 89 7% 358/399 86 3-92 5 -/+ 0 12** 0 Influenza Sensitivitet 70 6% 12/17 44 0-89 7 -/- 13 5** 341 Specificitet 100% 495/495 99 3-100 *v de 41 proverna var 32/41 positiva enligt DF och 30/35 positiva enligt RT-PCR ** Frysta (arkiverade) prover för influenza Obs! v de 50 frysta arkiverade prover som testades, var 10/13 odlingspositiva prover positiva och 37/37 odlingsnegativa prover negativa för influenza vid test med Directigen Flu + För influenza var 12/17 odlingspositiva prover positiva och 33/33 odlingsnegativa prover negativa vid test med Directigen Flu + 7

Näs-/svalgprover innefattar: Svalgpinnar och/eller provpinnar från nedre näsmusslan n=389 Cellodlingsresultat +/- -/+ -/- Directigen Flu + +/- 56 0 29* -/+ 0 0 0 -/- 17 1** 286 *v de 29 proverna var 25/29 positiva enligt DF och 25/26 positiva enligt RT-PCR ** Frysta (arkiverade) prover för influenza Obs! v de 5 frysta arkiverade prover som testades, var 3/3 odlingspositiva prover positiva och 2/2 odlingsnegativa prover negativa för influenza vid test med Directigen Flu + För influenza var 0/1 odlingspositiva prover positiva och 4/4 odlingsnegativa prover negativa vid test med Directigen Flu + ronkoalveolärt lavage: n=11 Cellodlingsresultat +/- -/+ -/- Directigen Flu + +/- 0 0 0 -/+ 0 2* 0 -/- 0 0 9 * Frysta (arkiverade) prover för influenza **N/ = Ej tillämpligt 95 % CI Influenza Sensitivitet 76 7% 56/73 65 4-85 8 Specificitet 90 8% 287/316 87 1-93 8 Influenza Sensitivitet 0 0% 0/1 0 0-97 5 Specificitet 100% 388/388 99 1-100 95 % CI Influenza Sensitivitet N/** N/** N/** Specificitet 100% 11/11 71 5-100 Influenza Sensitivitet 100% 2/2 15 8-100 Specificitet 100% 9/9 66 4-100 Obs! v de 3 frysta arkiverade prover som testades var 3/3 odlingsnegativa prover negativa för influenza vid test med Directigen Flu + För influenza var 2/2 odlingspositiva prover positiva och 1/1 odlingsnegativt prov negativt vid test med Directigen Flu + nalys av parade prover: Vid ett kliniskt centrum togs provpinnar både från nasofraynx och från nedre näsmusslan på alla 216 patienterna lla prover från detta centrum var negativa för influenza, både enligt odling och enligt Directigen Flu + Det förelåg inga statistiskt signifikanta skillnader mellan provtyperna, vare sig för Directigen Flu +-testen eller för cellodling Directigen Flu + Nasofarynxpinne + Provpinne från + 53 5 nedre näsmusslan 5 153 % överensstämmelse = 206/216 = 95,4 % Cellodling: Nasofarynxpinne + Provpinne från + 25 9 nedre näsmusslan 7 175 % överensstämmelse = 200/216 = 92,6 % 8

nalytisk specificitet och korsreaktivitet: Directigen Flu +-testen utvärderades med användning av totalt 90 mikroorganismer (58 bakterier, två jästsvampar och 30 virus) akterie- och jästisolat testades i koncentrationer om 10 7 till 10 8 cfu/ml M pneumoniae testades i en koncentration om > 10 8 CCU/mL Virusisolat testades i titrar på mellan 10 4 och 10 10 TCID 50 /ml Influenza C testades i en titer på 1,6 X 10 10 CEID 50 /ml Ingen av nedan angivna mikroorganismer och inget av nedan angivna virus gav positivt resultat med Directigen Flu +-testen Mikroorganismpane cinetobacter baumannii Kingella kingae Prevotella oralis ctinobacillus suis Klebsiella pneumoniae Proteus mirabilis acteroides fragilis Lactobacillus casei Protein vulgaris ordetella pertussis Lactobacillus fermentum Pseudomonas aeruginosa Candida albicans Lactobacillus plantarum Salmonella choleraesuis underart minnesota Candida glabrata Legionella pneumophila Serratia marcescens Cardiobacterium hominis Listeria monocytogenes Staphylococcus aureus Chlamydia psittaci Moraxella catarrhalis Staphylococcus aureus-(cowen 1) Chlamydia trachomatis Mycobacterium avium Staphylococcus epidermidis Corynebacterium diphtheriae Mycobacterium intracellulare Streptococcus bovis II grupp D Eikenella corrodens Mycobacterium tuberculosis Streptococcus mutans Enterococcus faecalis Mycoplasma orale Streptococcus oralis Enterococcus gallinarum Mycoplasma pneumoniae Streptococcus pneumoniae Escherichia coli Neisseria gonorrhoeae Streptococcus pyogenes grupp Fusobacterium nucleatum Neisseria meningitidis Streptococcus sanguis Gardnerella vaginalis Neisseria mucosa Streptococcus sp grupp Haemophilus aphrophilus Neisseria sicca Streptococcus sp grupp C Haemophilus influenzae Neisseria subflava Streptococcus sp grupp F Haemophilus parainfluenzae Peptostreptococcus anaerobius Streptococcus sp grupp G Haemophilus paraphrophilus Porphyromonas asaccharolyticus Veillonella parvula Viruspanel denovirus typ 3 HSV typ 2 denovirus typ 5 Influenza C/Taylor/1233/47 denovirus typ 7 Mässlingsvirus Edmonston denovirus typ 18 Påssjukevirus Coronavirus Parainfluenza typ 1 Coxsackievirus typ 9 (Griggs) Parainfluenza typ 2 Coxsackievirus typ 5 (Faulkner) Parainfluenza typ 3 Coxsackievirus typ 6 (Schmitt) Rhinovirus typ 1 Coxsackievirus typ 21 (Kuykendall) Rhinovirus typ 2 Coxsackievirus typ 9 P (ozek) Rhinovirus typ 13 Cytomegalovirus D-169 Rhinovirus typ 16 Echovirus typ 2 Rhinovirus typ 37 Echovirus typ 3 RSV Echovirus typ 6 RSV HSV typ 1 VZV Interfererande substanser Nedanstående ämnen testades med Directigen Flu +-testen utan att någon påverkan observerades i analysen från något av ämnena vid de testade halterna: helblod (2 %), 4 nässprayer (25 %), acetylsalicylsyra (20 mg/ml), 3 munsköljvätskor (25 %), ibuprofen (10 mg/ml), oseltamivir (0,5 mg/ml), zanamivir (1 mg/ml), klorfeniraminmaleat (5 mg/ml), 4 halspastiller (25 %), guaifenesin (20 mg/ml), difenhydraminhydroklorid (5 mg/ml), dextrometorfanhydrobromid (10 mg/ml), pseudoefedrinhydroklorid (20 mg/ml), acetaminofen (216 mg/ml), klemastinfumarat (0,35 mg/ml), fenylpropanolaminhydroklorid (20 mg/ml) 9

nalytisk sensitivitet Den analytiska sensitiviteten bestämdes för totalt 13 influenzastammar; 7 influenza - och 6 influenza -stammar Influenzavirusstam Typ Detektionsgräns (CEID 50 ) /PR/8/34 (H1N1) 8 2 X 10 3 1/FM/1/47 (H1N1) 5 9 X 10 2 /NWS/33 (H1N1) 1 6 X 10 2 1/Denver/1/57 (H1N1) 6 5 X 10 1 /Port Chalmers/1/73 (H3N2) 2 9 X 10 2 /Victoria/3/73 (H3N2) 3 3 X 10 4 /New Jersey/8/76 (H1N1) 2 1 X 10 2 /Lee/40 1 2 X 10 6 /llen/45 1 8 X 10 2 /Maryland/1/59 4 6 X 10 1 /GL/1739/54 2 5 X 10 3 /Taiwan/2/62 6 6 X 10 2 /Hong Kong/5/72 2 3 X 10 3 Reaktivitet och specificitet för influenza - och -stammar Directigen Flu +-testen utvärderades med hjälp av en panel av 62 influenzastammar lla humana och animala influenza -stammar gav positiva testresultat för influenza och negativa för influenza lla humana influenza - stammar gav positiva testresultat för influenza och negativa för influenza lla kända hemagglutinin- och neuraminidas-subtyper av influenza är representerade nedan Influenzavirusisolat från människa Virustyp Influenzavirusisolat från människa Virustyp /PR/8/34 (H1N1) /Human/HongKong/481/97 (H5N1) 1/FM/1/47 (H1N1) /Human/HongKong/482/97 (H5N1) /NWS/33 (H1N1) /Human/HongKong/228156/97 (H5N1) 1/Denver/1/57 (H1N1) /Human/HongKong/229540/97 (H5N1) /New Jersey/8/76 (Hsw N1) (H1N1) /Human/HongKong/242095/97 (H5N1) /HongKong/9821/2000 (H1N1) /Human/HongKong/1073/99 (H9N2) /HongKong/2997/98 (H1N1) /Human/HongKong/1074/97 (H9N2) /HongKong/5405/2000 (H1N1) /Lee/40 /HongKong/6611/2000 (H1N1) /llen/45 /HongKong/15946/2000 (H1N1) /GL/1739/54 /HongKong/16051/2000 (H1N1) /Taiwan/2/62 /Port Chalmers/1/73 (H3N2) /Maryland/1/59 /Victoria/3/73 (H3N2) /HongKong/5/72 /HongKong/114313/2000 (H3N2) /Hong Kong/28637/2000 /HongKong/117393/2000 (H3N2) /Hong Kong/27254/2000 /HongKong/114591/2000 (H3N2) /Hong Kong/28636/2000 /HongKong/119563/2000 (H3N2) /Hong Kong/29130/2000 /HongKong/120277/2000 (H3N2) /Hong Kong/29276/2000 /Hong Kong/68012/2000 (H3N2) /Hong Kong/35952/2000 Influenzavirusisolat från djur Virustyp Influenzavirusisolat från djur Virustyp /Kalkon/Kansas/4880/80 (H1N1) /Kalkon/Ontario/6118/67 (H8N4) /sien/57 (H2N2) /Kyckling/HongKong/G9/97 (H9N2) /nd/new York/6750/78 (H2N2) /Gris/HongKong/9/98 (H9N2) /Gris/HongKong/5212/99 (H3N2) /Kalkon/Wisconsin/66 (H9N2) /Kalkon/England/69 (H3N2) /Vaktel/HongKong/G1/97 (H9N2) /nka/hongkong/477/78 (H4N6) /nka/hongkong/865/80 (H10N3) /Kyckling/labama/75 (H4N8) /Kyckling/Tyskland/N/49 (H10N7) /Kalkon/Wisconsin/68 (H5N9) /nka/memphis/546/74 (H11N9) /Gås/HongKong/38/79 (H6N1) /nka/lberta/60/76 (H12N5) /Kalkon/Kanada/63 (H6N8) /Mås/MD/704/77 (H13N6) /Kalkon/Oregon/71 (H7N3) /nd/gurjev/263/82 (H14N5) /nka/hongkong/47/76 (H7N2) /Lira/W/2576/79 (H15N6) OS! Prestanda för detektering av influenza -virus i humana prover, när subtyper av icke-/h3 och icke-/h1 influenza -virus uppstår som humanpatogener, har inte fastställts Reproducerbarhet: Reproducerbarheten för Directigen Flu +-testen utvärderades med en 20-provspanel som innefattade två nivåer (låg positiv och hög positiv) av influenza, två nivåer (låg positiv och hög positiv) av influenza samt negativa kontroller De låga positiva proverna för både influenza och influenza var vid eller nära den lägsta visuella detektionsgränsen för Directigen Flu +-testen Den totala noggrannheten hos Directigen Flu +-testen var 95 % för influenza och 98 % för influenza 10

Reproducerbarhet på läkarmottagningslaboratorier: En utvärdering av Directigen Flu +-testen genomfördes av fem personer på tre läkarmottagningslaboratorier med samma 20-provspanel som i avsnittet ovan om reproducerbarhet Två laboratorieassistenter, en provtagningspersonal, en receptionist och ett sjukvårdsbiträde utförde testerna Panelen testades under tre på varandra följande dagar Den totala noggrannheten var 93 % för influenza och 92 % för influenza TILLGÄNGLIGHET Kat nr eskrivning 256010 Directigen Flu + (Influenza and virus)-sats, 20 tester 220099 L CultureSwab, Single Swab, Liquid Stuart, förpackning med 50 220093 L CultureSwab, Single Swab, Liquid mies, förpackning med 50 REFERENSER 1 Walsh, Paul, et al 2000 Physician s Desk Reference, Medical Economics Company, New Jersey 2 Kaiser, L, Couch, R, Galasso, G J, Glezen, W P, Webster, R G, Wright, P F, and Hayden, F G 1999 First international symposium on influenza and other respiratory viruses: summary and overview Kapalua, Maui, Hawaii, December 4-6, 1998 ntiviral Res, 42:149-176 3 Cox, N J, and ender, C 1995 The molecular epidemiology of influenza viruses Virology, 6:359-370 10 4 Todd, S J, Minnich, L, and Waner, J L 1995 Comparison of rapid immunofluorescence procedure with TestPack RSV and Directigen Flu for diagnosis of respiratory syncytial virus and influenza virus J Clin Microbiol 33:1650-1651 5 McElhaney, J E, Gravenstein, S, Krause, P, Hooton, J W, Upshaw, C M, and Drinka, P 1998 ssessment of markers of the cell-mediated immune response after influenza virus infection in frail older adults Clin Diag Lab Immunol 5:840-844 6 Fan, J, Henrickson, K J, and Savatski, L L 1998 Rapid simultaneous diagnosis of infections with respiratory syncytial viruses and, influenza viruses and, and human parainfluenza virus types 1, 2, and 3 by multiplex quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction-hybridization assay (hexaplex) Clin Infect Diseases 26:1397-1402 7 Wright, K E, Wilson, G R, Novosad, D, Dimock, C, Tan, D, and Weber, J M 1995 Typing and subtyping of influenza viruses in clinical samples by PCR J Clin Microbiol 33:1180-1184 8 Kendal, P 1985 Influenza Viruses p 341-357 Laboratory Diagnosis of Viral Infections In H Lennette, (ed ) Marcel Dekker, Inc, New York 9 McQuillen, J, Madeley, C R, and Kendal, P 1985 Monoclonal antibodies for the rapid diagnosis of influenza and virus infections by immunofluorescence Lancet ii:911-914 10 Guenthner, S H, and Linnemann, C C, Jr 1988 Indirect immunofluorescence assay for rapid diagnosis of influenza virus Laboratory Medicine 19:581-583 11 Minnick, L L, and Ray, C G 1986 Early testing of cell cultures for detection of hemadsorbing viruses J Clin Microbiol 25:421-422 12 Schmidt, N J, Ota, M, Gallo, D, and Fox, V L 1982 Monoclonal antibodies for rapid, strain specific identification of influenza virus isolates J Clin Microbiol 16:763-765 13 Shu, L L, ean, W J, and Webster, R G 1993 nalysis of the evolution and variation of the human influenza virus nucleoprotein gene from 1933 to 1990 J Virol 67:2723-2729 14 Dowdle, W R, Kendal, P, and Noble, G R 1980 Influenza Virus, p 836-884 Manual of Clinical Microbiology, 3rd edition, In Lennette, et al (ed ), merican Society for Microbiology, Washington, D C 15 Kendal, P, and Dowdle, W R 1986 Influenza Virus p 515-520 Manual of Clinical Laboratory Immunology, 3rd edition, In Lennette et al (ed ) merican Society for Microbiology, Washington, D C 16 National Committee for Clinical Laboratory Standards 2001 pproved Guideline M29-2 Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections, 2nd ed NCCLS, Wayne, Pa 17 Garner, J S 1996 Hospital Infection Control Practices dvisory Committee, U S Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention Guideline for isolation precautions in hospitals Infect Control Hospital Epidemiol 17:53-80 18 U S Department of Health and Human Services 1999 iosafety in microbiological and biomedical laboratories, HHS Publication (CDC) 4 th ed U S Government Printing Office, Washington, D C 19 Directive 2000/54/EC of the European Parliament and of the Council of 18 September 2000 on the protection of workers from risks related to exposure to biological agents at work (seventh individual directive within the meaning of rticle 16(1) of Directive 89/31/EEC) Official Journal L262, 17/10/2000, p 0021-0045 20 Covalciuc K, Webb K, and Carlson C 1999 Comparison of Four Clinical Specimen Types for detection of Influenza and Virus by Optical Immunoassay (FLU OI TEST) and Cell Culture Methods J Clin Microbiol 37: 3971-3974 11

ecton, Dickinson and Company 7 Loveton Circle m Sparks, Maryland 21152 U S 800-638-8663 ENEX Limited ay K 1a/d, Shannon Industrial Estate Shannon, County Clare, Ireland Tel: 353-61-47-29-20 Fax: 353-61-47-25-46 D, D Logo, L, ColorPC, Culturette, Directigen, DispensTube and Trypticase are trademarks of ecton, Dickinson and Company CultureSwab is a trademark of Difco Laboratories, Inc, a subsidiary of ecton, Dickinson and Company 2006 D