LightCycler SeptiFast Test MG

FÖR ANVÄNDNING MED: LightCycler SeptiFast Test MG för användning med instrumentet LightCycler 2.0 (serienummer 1415001 och senare) För in vitro-diagnostisk användning. LightCycler SeptiFast Kit MG 54 Tests REF : 04 469 046 001 SeptiFast Lys Kit MG 100 Tests REF : 04 404 432 001 SeptiFast Prep Kit MG 10 Tests REF : 04 404 459 001 SeptiFast Software Set v2.0 REF : 05 164 443 001 AVSEDD ANVÄNDNING LightCycler SeptiFast Test MG är ett in vitro-test för nukleinsyreamplifiering för detektion och identifiering av bakterie- och svamp-dna från mikroorganismer som beskrivs närmare i SeptiFast Test Master List (SML) i humant K-EDTA-blod med hjälp av instrumentet LightCycler 2.0. Testet används i kombination med klinisk bedömning, fastställda mikrobiologiska analyser och/eller andra laboratoriemarkörer som ett hjälpmedel vid hantering av patienter med misstänkt sepsis och andra bakterie-/svampinfektioner i blodomloppet. SAMMANFATTNING OCH FÖRKLARING AV TESTET Sepsis är en av de främsta orsakerna till dödlighet och sjukdom på sjukhus, oftast orsakad av bakteriemi och/eller fungemi. Rätt antibiotisk behandling och snabbt påbörjad behandling är kritiska faktorer som kan minska sjukdom och dödlighet som associeras med sepsis. Andelen patienter som initialt behandlats med olämpliga antibiotiska regimer vid intensivvårdsenheter är betydande och varierar mellan 11 och 46 % (1,2,3). På sjukhus tar det vanligen minst 48 timmar att identifiera bakterie-/svamppatogenen (patogenerna), och medicinmottagligheten som hör till, från blododlingar (1). Snabb patogendetektion genom molekylära diagnostikverktyg kan underlätta snabb diagnos av bakteriemi/fungemi och tidigare tillförsel av rätt antibiotisk behandling. Samtidigt minskar man olämplig överanvändning.av antibiotika som verkar på bred front (4,5). LightCycler SeptiFast Test MG är utformad för att detektera mikroorganismer som orsakar cirka 90 % av alla infektioner i blodomloppet (1,6). Medan mikrobiologiska metoder detekterar livsdugliga mikoorganismer detekterar detta test både livsdugliga och ej livsdugliga mikoorganismer samt även fritt mikrobiellt DNA. Target-arterna listas i SeptiFast Test Master List (SML) i tabell 1. Dessa arter detekterades som positiva med hjälp av LightCycler SeptiFast Test MG vid interna studier och/eller kliniska försök. Några av dessa arter hör till dem som oftast behandlas på ett felaktigt sätt: Enterococcus spp.; E. coli; Candida spp.; Klebsiella spp. (6). Dessutom är tidig identifiering viktigt för några av target-arterna i SML, eftersom de orsakar infektioner som är ytterst svåra att behandla: Acinetobacter spp., Stenotrophomonas spp., Enterococcus spp., Candida spp., Pseudomonas spp. (6). Fler än en art i ett prov kan detekteras. Följaktligen är realtids-pcr-resultat ytterligare ett verktyg för att underlätta en tidig klinisk bedömning. Tabell 1: SeptiFast Test Master List (SML) Gram (-) Gram (+) Svampar Escherichia coli Staphylococcus aureus Candida albicans Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) KNS 1 Candida tropicalis Serratia marcescens Streptococcus pneumoniae Candida parapsilosis Enterobacter (cloacae/aerogenes) Streptococcus spp. 2 Candida glabrata Proteus mirabilis Enterococcus faecium Candida krusei Pseudomonas aeruginosa Enterococcus faecalis Aspergillus fumigatus Acinetobacter baumannii 3 Stenotrophomonas maltophilia 1 Koagulasnegativa stafylokocker (arter som representerar gruppen KNS listas i tabell 8). 2 Arter som representerar gruppen Streptococcus spp. listas i tabell 8. 3 Arter som ofta kallas A. calcoaceticus-a. baumannii (Acb-komplex) detekteras inte (8). Avsnittet med information om revidering av dokumentet finns i slutet av det här dokumentet. 04802900001-07SV 1 Doc Rev. 7.0

ANVÄNDNINGSPRINCIPER LightCycler SeptiFast Test MG baseras på 3 grundläggande processer: Extraktion genom mekanisk lysering och rening av DNA PCR-amplifiering av target DNA i realtid i 3 parallellreaktioner (grampositiva bakterier, gramnegativa bakterier och svampar) och detektering via särskilda hybridiseringsprober Automatisk resultatgenerering efter smälttoppsanalys Extraktion Den mekaniska lyseringen av proverna utförs med hjälp av SeptiFast Lys Kit MG och instrumentet MagNALyser. De lyserade proverna inkuberas med SeptiFast Prep Kit MG vid förhöjd temperatur med en proteas- och kaotropisk lyseringsbuffert som frigör nukleinsyran och skyddar det frigjorda DNA mot DNaser i blod. En definierad volym med internkontroll (IC) tillsätts i varje prov tillsammans med lyseringsreagens. IC består av syntetiska dubbelsträngade DNA-molekyler med primerbindningsställen som är identiska med målsekvensernas dito. IC innehåller unika H- probbindningsregioner som gör att differentiering av amplifierad IC från target-specifik amplicon kan ske. Efter tillsats av bindningsbuffert överförs blandningen till en centrifugeringskolumn med en glasfiberfilterinsertion. Humant genomiskt och bakterie-/svamp-target DNA binds till glasfiberytan. Obundna ämnen, t.ex. salter, proteiner och andra cellulära fragment, tas bort i två tvättsteg. När tvättningen är klar elueras de adsorberade nukleinsyrorna i förhöjd temperatur. Eluaten undergår PCR-analys. PCR-amplifiering och detektion i realtid Val av target Det interna transkriberade spacer-området (ITS) har valts ut som målområde för bakterie- och svampartdifferentiering. Det medger en högre analytisk sensitivitet än enskilda kopieringsgener, eftersom det finns en mängd operoner i genomerna för bakterier och svampar. Vidare är ITS mer artspecifik än ribosomala RNA och därför bäst lämpad för artdifferentiering. Det ligger mellan 16S och 23S ribosomala DNA-sekvenser av alla gram(+) och gram(-) bakterier och mellan 18S och 5,8S ribosomala DNA-sekvenser av alla svampar. Amplifiering Innan PCR-amplifieringen minskas risken för ampliconsmitta genom att använda AmpErase (uracil-n-glykosylas)-enzym. Det identifierar och katalyserar nedbrytning av DNA-strängar som innehåller deoxiuridin, men inte DNA som innehåller deoxitymidin. De extraherade proverna tillsätts i amplifieringsblandningen som innehåller hot-start Taq-polymeras i de LightCycler -kapillärer (100 µl) MG där PCR-amplifiering sker. Varje target hos de specificerade arterna amplifieras med antingen generiska eller specifika primers. En blandning av targets amplifieras samtidigt i reagenskontrollerna (RCs). Realtidsdetektion av PCR-produkter via H-prober Amplicon detekteras via fluorescens med hjälp av ett par särskilda H-prober. De här fluorescensmärkta H-proberna hybridiseras till en intern sekvens av det amplifierade fragmentet under bindningsfasen för amplifieringscykeln. Den utsända fluorescensen mäts av instrumentet LightCycler 2.0 i en av de fyra olika detektionskanalerna. Efter att amplifieringen har avslutats utförs en smältkurvsanalys. Smälttemperaturen T M beror på längd, sekvens och grad av homologi mellan proben och target DNA. Proberna är utformade för att särskilja de arter som detekteras i en kanal genom deras T M. Automatiserad identifiering av arter och kontroller Smälttemperaturerna (T M s) för prover och kontroller analyseras via ett tilldelat identifieringsprogram (SeptiFast Identification Software) och en rapport skapas. Låga koncentrationer av koagulasnegativa stafylokocker (KNS) och streptokocker som speglar intervallet av arbetsgångens smitta visas därför inte. Om det finns ett positivt resultat för Staphylococcus aureus bör en efterföljande meca resistenstestning övervägas. Ytterligare information finns i bipacksedeln för LightCycler SeptiFast meca Kit MG (P/N: 04 488 814 001). REAGENS SeptiFast Lys Kit MG P/N: 04 404 432 001 100 Tests LM (lyseringsmatris) 100 x glas-/keramikpartiklar SeptiFast Prep Kit MG P/N: 04 404 459 001 10 Tests [1] LB (lyseringsbuffert) < 50 % guanidintiocyanat 20 % Triton X-100 Hälsoskadlig 20 x 1 500 µl [2] PK (proteinas K) 2 % proteinas K Glycerol + ++ 2 x 850 µl [3] BB (bindningsbuffert) < 50 % guanidintiocyanat 20 % Triton X-100 Hälsoskadlig Hälsoskadlig 10 x 1 000 µl 04802900001-07SV 2 Doc Rev. 7.0

[4] IRB (inhibitionsborttagningsbuffert) < 50 % guanidin-hcl < 40 % etanol [5] WB (tvättbuffert) < 0,2 % natriumklorid < 80 % etanol + SeptiFast Prep Kit MG P/N: 04 404 459 001 10 Tests Hälsoskadlig Mycket brandfarligt 10 x 1 800 µl 10 x 1 600 µl [6] EB (elueringsbuffert) 10 x 400 µl Tris-HCl-buffert BET (blodextraktionsrör) 1 x 50 FC (filterkolumner) 2 x 5 LightCycler SeptiFast Kit MG P/N: 04 469 046 001 54 Tests [1a] RM 1a (reaktionsmix 1a) 3 U/µl FastStart Taq polymeras < 0,1 % AmpErase-enzym (uracil-n-glykosylas) 3 x 27 µl [1b] RM 1b (reaktionsmix 1b) < 1 % Brij < 0,1 % magnesiumlösning < 0,1 % dntp [2] DM G+ (detektionsblandning, grampositiv) < 0,001 % primer, prober för G+ < 1 % Brij [3] DM G- (detektionsblandning, gramnegativ) < 0,001 % primer, prober för G- < 1 % Brij [4] DM F (detektionsblandning svampar) < 0,001 % primer, prober för F < 1 % Brij [5] RC G+ (reagenskontroll, grampositiv) < 0,001 % DNA-kontrolltemplat för G+ EDTA [6] RC G- (reagenskontroll, gramnegativ) < 0,001 % DNA-kontrolltemplat för G- EDTA [7] RC F (reagenskontroll svampar) < 0,001 % DNA-kontrolltemplat för F EDTA [8] IC (internkontroll) < 0,001 % pågående DNA-kontrolltemplat för G+, G-, F EDTA [9] NC (negativ kontroll) < 35 % polyetenglykol 10 000 3 x 620 µl 3 x 126 µl 3 x 126 µl 3 x 126 µl 1 x 330 µl 1 x 330 µl 1 x 330 µl 5 x 100 µl 10 x 1 600 µl 04802900001-07SV 3 Doc Rev. 7.0

SeptiFast Software Set v2.0 P/N: 05 164 443 001 1 x SeptiFast Identification Software v2.0 SeptiFast Macro v2.0 SeptiFast meca Macro v1.0 SeptiFast MCC Macro v1.0 SeptiFast Proof Files v2.0 VARNINGAR OCH SÄKERHETSÅTGÄRDER Allmänna varningar och säkerhetsåtgärder För in vitro-diagnostisk användning. Detta test är endast avsett att användas med humant blod som samlats i K-EDTA. Pipettera inte med munnen. Ät, drick eller rök inte i laboratorium. Använd puderfria engångshandskar, laboratorierock och ögonskydd när du hanterar prover och kitets reagens. Tvätta händerna noga efter hantering av prover och testreagens. Blanda inte reagens från olika loter. Blanda inte reagens från olika kit, förutom de som krävs för Master Mix. Kassera oanvända reagens, avfall och prover enligt gällande nationella, regionala och lokala föreskrifter. Använd inte kit efter utgångsdatum. Kontakta din Roche-representant om du vill erhålla säkerhetsdatablad (MSDS). Prover ska behandlas som smittbärande i enlighet med säkra laboratorierutiner, som exempelvis de rutiner som beskrivs i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (8) och i CLSI-dokument M29-A (9). Rengör och desinficera alla arbetsytor och handskar noggrant med DNA dekontaminationsreagens (t.ex. LTK-008 ). Försäkra dig om att handskarna är resistenta mot DNA dekontaminationsreagens. Använd engångshandskar, laboratorierock och ögonskydd när du hanterar reagens. Undvik att dessa reagens kommer i kontakt med hud, ögon och slemhinnor. Tvätta omedelbart med stora mängder vatten vid eventuell kontakt. Brännskador kan annars uppstå. Vid spill av dessa reagens ska du späda med vatten innan spillet torkas upp. Undvik att lyseringsbuffert (LB) och bindningsbuffert (BB) kommer i kontakt med hud, ögon och slemhinnor. Tvätta omedelbart med rikliga mängder vatten vid eventuell kontakt. Brännskador kan annars uppstå. Späd med vatten innan spillet torkas upp. Låt inte LB och BB komma i kontakt med hypokloritlösning (blekmedel). Denna blandning kan bilda en mycket giftig gas. Arbetsgången på laboratoriet ska börja i pre-amplifieringsområdet och fortsätta mot post-amplifieringsområdet (amplifiering/detektion). Pre-amplifieringsarbeten inbegriper reagensberedning och provextraktion. Förbrukningsmaterial och utrustning ska speciellt tilldelas varje pre-amplifieringsarbete och får inte användas för andra arbeten eller flyttas mellan områden. Handskar ska användas i alla områden. Byt handskar innan ett område lämnas. Utrustning och förbrukningsmaterial som används för reagensberedning får inte användas vid prov- eller kontrollhantering eller för pipettering eller bearbetning av amplifierat DNA eller andra källor för target DNA. Förbrukningsmaterial och utrustning för post-amplifiering ska alltid stanna kvar i post-amplifieringsområdet. Förekomsten av AmpErase-enzym i Master Mix minskar risken för amplicon-smitta. Smitta från positiva kontroller och positiva prover kan dock endast undvikas om god laboratoriesed iakttas och de förfaranden som beskrivs i denna bipacksedel noga följs. Särskilda varningar och säkerhetsåtgärder för användning av LightCycler SeptiFast Test MG DNA från target-organismer för LightCycler SeptiFast Test MG förekommer i miljön. För att undvika falskt positiva resultat genom detektion av sådant miljömässigt DNA (DNA-smitta) är det nödvändigt att skapa en arbetsgång som är fri från kontaminerande DNA. Det är i synnerhet användaren som kan vara källan till DNA-smitta, eftersom den mänskliga huden och de övre luftvägarna innehåller olika mikroorganismer som också är target-organismer i LightCycler SeptiFast Test MG [t.ex. streptokocker och koagulasnegativa stafylokocker (KNS)]. Följande principer är rekommendationer som syftar till att undvika DNA-smitta. Reagens och förbrukningsmaterial för LightCycler SeptiFast Test MG Reagenser och engångmaterial för LightCycler SeptiFast Test MG har utvecklats för att minimera bakteriell DNA-smitta. MG-produkter är utformade för högsensitiv detektion av nukleinsyra från bakterier och svampar. Patentskyddade tillverkningsprocesser utvecklades för att eliminera DNA-smitta som kan interferera med sådana analyser. Undvik onödigt öppnande och stängande av reagensflaskor. Kläder och handskar Använd puderfria handskar under hela arbetsgången. Undvik att exponera huden använd handskar som går utanpå laboratorierockens ärmar. Byt handskar omedelbart vid kontaminering eller behandling med DNA-kontaminerande reagens (t.ex. LTK-008 ; handskarna måste vara resistenta mot reagenset). Rör inte handflate- och fingerytan på hanskarna när du tar på dem. Skötsel av det laminära flödet Rengör arbetsytorna i det laminära flödet med DNA dekontaminationsreagens efter varje extraktion. OBS! Försäkra dig om att utrustningen är resistent mot DNA dekontaminationsreagens. Rengör alla ytor inuti det laminära flödet regelbundet (väggar, utrymmen under bottenplattan, golvplattan). Se till att det laminära flödet är DNA-fritt om det används av flera användare. Slå på UV-ljuset och luftströmmen i minst 30 minuter innan du börjar arbeta. Slå av UV-ljuset medan du arbetar. Skötsel av PCR-arbetsstation Rengör arbetsytorna på PCR-arbetsstationen med DNA dekontaminationsreagens efter varje PCR-beredning. Rengör alla ytor inuti PCR-arbetsstationen regelbundet. Slå på UV-ljuset i minst 30 minuter innan du börjar arbeta. Se till att UV-ljuset har slagits av när du arbetar. OBS! Byt UV-lampa på det laminära flödet och PCR-arbetsstationen enligt tillverkarens anvisningar. 04802900001-07SV 4 Doc Rev. 7.0

Behandling av enheter och förbrukningsvaror Lämna, om möjligt, särskilda förbrukningsvaror och enheter som använts för LightCycler SeptiFast Test MG i det laminära flödesfacket. Bestråla alla objekt med UV-ljuset i minst 30 minuter innan du börjar arbeta. Använd endast DNA-fritt förbrukningsmaterial (se avsnittet Material som ej medföljer förpackningen). Använd dem endast en gång. Använd capping tool för att stänga kapillärer (se användarhandboken för instrumentet LightCycler 2.0 för hanteringsanvisningar). Se användarhandboken för instrumentet LightCycler 2.0 (kapitlet Underhåll ) om kapillärer går sönder. Säkerhetsåtgärder vid pipettering Öppna reagensflaskorna, pipettera spetsfacken och kapillärfacken under det laminära flödet. Använd inte samma pipettspetsar och kapillärer utanför det laminära flödet. Rör inte kanten eller gängorna på en öppen flaska. Rör vid flaskan när du pipetterar under kanten. Rör inte kanten på en öppen kapillär. Lägg alla objekt som använts under förfarandet under det laminära flödet i logisk ordning (undvik korspipettering). Vid spill ska du avsluta det pågående arbetsmomentet och omgående behandla arbetsområdet med DNA dekontaminationsreagens (t.ex. LTK-008 ) FÖRVARING OCH HANTERING SeptiFast Lys Kit MG Förvaras i 15 till 25 C. Öppna flaskorna endast en gång. Återanvänd dem inte. Använd inte efter utgångsdatum. SeptiFast Prep Kit MG Förvara i 15 till 25 C (får varken frysas eller förvaras i kylskåp). Öppna PK (flaska 2) maximalt 3 gånger. Öppna andra flaskor endast en gång och kassera allt oanvänt reagens. Blanda inte reagens från olika loter inom en extraktionskörning. Använd inte efter utgångsdatum. LightCycler SeptiFast Kit MG Förvaras i 15 till 25 C. Förvaras mörkt. Förvara Master Mix (blandningar med [1a], [1b] och [2] eller [3] eller [4]) i 2 till 8 C i maximalt 3 dagar. Förvara RC i 2 till 8 C i upp till 10 dagar efter användning eller frys omgående i 15 till -25 C efter varje användning. Öppna RC maximalt 6 gånger. Öppna andra flaskor endast en gång och kassera allt oanvänt reagens. Blanda inte reagens från olika loter inom en PCR-körning. Använd inte efter utgångsdatum. MATERIAL SOM MEDFÖLJER SeptiFast Lys Kit MG P/N: 04 404 432 001 100 Tests SeptiFast Prep Kit MG P/N: 04 404 459 001 10 Tests LightCycler SeptiFast Kit MG P/N: 04 469 046 001 54 Tests SeptiFast Software Set v2.0 (medföljer en gång) P/N: 05 164 443 001 MATERIAL SOM BEHÖVS MEN INTE MEDFÖLJER Kan köpas från Roche Instrumentet LightCycler 2.0 med programversion 4.1 03 531 414 001 LightCycler -kapillärer MG (100 µl) 03 612 066 001 LC-karusellcentrifug 2.0 03 709 582 001 MagNALyser-instrument (230 V) 03 358 976 001 LightCycler Multicolor Compensation Set 04 484 355 001 SeptiFast kylblock 04 555 864 001 Kan köpas från andra företag Centrifugera med swingout-rotor för 15 ml rör min. 4 200 g-kraft (t.ex. Eppendorf) 1 x Centrifuge 5810 2 x adaptrar (1par) med element för 15 ml-rör med konisk botten 1 x swingout-rotor min. 4 200 x g VWR International 521-0076 521-0061 521-0044 Centrifug (t.ex. Eppendorf) 1 x MiniSpin VWR International 521-0012 2 termomixrar (t.ex. Eppendorf) 2 x termomixer komfort inkl. 1 x termoblock för 24 x 2,0 ml-flaskor och 1 x termoblock för 8 x 15 ml-flaskor VWR International 460-1112 460-1116 460-1120 04802900001-07SV 5 Doc Rev. 7.0

Rör/flaska rullmixer (t.ex. Stuart Scientific) 1 x rullmixer 1 x Vortex DNA-fria flaskor och spetsar (t.ex. MG-förbrukningsartiklar, greiner bio-one) 5 ml filterspetsar MG 1 ml filterspetsar MG 100 µl filterspetsar MG 20 µl filterspetsar MG 1 ml serumpipett MG 1,5 ml rör MG VWR International 445-5210 444-1372 greiner bio-one 940525MG 750289MG 772289MG 774289MG 700371MG 616202MG 1,5 ml rör med skruvkork, sterila Sarstedt 72.692.105 eller motsvarande DNA-dekontaminationsreagens (t.ex. biodelta GmbH) LTK-008 set Pipett 1 5 ml (t.ex. Thermo Life Sciences) 1 x finnpette 1 5 ml Pipettera 10 1000 µl (t.ex. Eppendorf) 2 x referens 100 1000 µl 2 x referens 10 100 µl 1 x referens 2 20 µl (endast för meca testning) Fack för laminärt flöde (t.ex. Cleanair) BioSafety Cabinet EF 4E PCR-arbetsstationen (t.ex. Safety Cabinet Solutions Ltd.) Biocap Passive DNA PCR Cabinet Positiv kontrollmaterial Erhålls hos andra företag eller bereds i användarens laboratorium (se avsnittet Förslag på beredning av positiv kontrollmaterial). biodelta GmbH 200-000 VWR International 613-2520 VWR International 613-3650 613-3649 613-3647 VWR International 135-0055 VWR International 135-6576 PROVTAGNING, TRANSPORT OCH FÖRVARING AV PROVER OBS! Hantera alla prover och kontroller som potentiellt smittbärande. Provtagning LightCycler SeptiFast Test MG är endast avsett att användas med K-EDTA-blodprover. Blod ska samlas i sterila rör med K-EDTA som antikoagulant. Transport och förvaring av prover Vid transport av helblod ska gällande bestämmelser för transport av etiologiska agens följas (10). Helblod måste transporteras/förvaras i 15 till 25 C eller i 2 till 8 C i upp till 3 dagar eller i 15 till 25 C i upp till 4 timmar. Hållbarhet för eluat Använd behandlade prover direkt efter DNA-rening. Förvara en portion som ska beredas för påföljande meca-test, om så behövs (ytterligare information finns i LightCycler SeptiFast meca Kit MG). Eluat kan förvaras i 15 till 25 C i upp till 30 dagar eller i 2 till 8 C i upp till 8 dagar eller i 15 till 25 C i upp till 4 timmar. BRUKSANVISNING Installera instrumentet LightCycler 2.0 och PCR-arbetsstationen Färgkompensation Översikt: Färgkompensationsobjekt (CCO) genereras på instrumentet LightCycler 2.0 med hjälp av Multicolor Compensation Set. Färgkompensationsobjekten måste kvalificeras innan användning. Förbereda Multicolor Compensation-experiment Använd LightCycler Multicolor Compensation Set (P/N: 04 484 355 001). Använd elueringsbuffert (EB, flaska 6 i SeptiFast Prep Kit MG) (P/N: 04 404 459 001). OBS! Totalt krävs 70 µl elueringsbuffert. Överbliven elueringsbuffert (EB, flaska 6 från SeptiFast Prep Kit MG) kan användas. Överbliven elueringsbuffert måste förvaras i 15 till 25 C och kan användas i upp till 6 månader. 1. Ta en flaska elueringsbuffert (EB, flaska 6 från ett SeptiFast Prep Kit MG). 2. Tina alla flaskor utom flaska 1 (CCB) i LightCycler Multicolor Compensation (MCC) Set, blanda innehållet försiktigt och låt det hastigt sjunka till botten. 3. Placera sex LightCycler -kapillärer (20 µl) i positionerna 1 till 6 i LightCycler -provkarusellen. 4. Bered en spädning på 1:6 av CC530 (flaska 2, LightCycler MCC Set) med elueringsbuffert (EB, flaska 6 från SeptiFast Prep Kit): Pipettera 50 µl elueringsbuffert (flaska 6, SeptiFast Prep Kit MG) i ett 1,5-ml sterilt rör med skruvkork och tillsätt 10 µl CC530 (flaska 2). Blanda dem försiktigt och låt blandningen hastigt sjunka till botten. 04802900001-07SV 6 Doc Rev. 7.0

5. Pipettera 20 µl av varje komponent i separata kapillärer i följande ordning: Rotorposition 1: EB (flaska 6, SeptiFast Prep Kit MG) Rotorposition 2: CC530 (spädd flaska 2) Rotorposition 3: CC610 (flaska 3) Rotorposition 4: CC640 (flaska 4) Rotorposition 5: CC670 (flaska 5) Rotorposition 6: CC705 (flaska 6) OBS! Minska inte volymen. Ändra inte kapillärordningen i LightCycler -provkarusellen. 6. Förslut varje kapillär med en propp. Låt innehållet sjunka till botten med LC Carousel Centrifuge 2.0 och flytta LightCycler -provkarusellen till instrumentet LightCycler 2.0. Starta och spara färgkompensationskörning (CCR) Information om installation och användning av SeptiFast MCC_Macro_v1.0 eller senare finns i användarhandbok A för instrumentet LightCycler 2.0, Köra ett Roche-makro. OBS! Använd inte fältet <assay lot number> i makroguiden. Ange alternativt information om lotnummer i motsvarande fält i provredigeraren. 1. Spara körningen (t.ex. med följande namn: SeptiFast_CCR_ÅÅMMDD-xx, YY = år, MM = månad, DD = dag, xx = körningsnummer). 2. När körningen är avslutad skapas en rapport automatiskt. 3. Skriv ut rapporten och spara utskriften. Validering av körning: Om rapporten för LightCycler Multicolor Compensation Set flaggas (t.ex. <User Developed or Modified Test Method>) är MCC-körningen ogiltig. Upprepa körningen. Skapa ett CC-objekt (CCO) 1. Aktivera modulen för färgkompensationsanalys och tryck på knappen <save CC object>. 2. För att få en så entydig identifiering som möjligt av SIS (SeptiFast Identification Software) ska färgkompensationsobjektet sparas på följande sätt: SeptiFast_CCO_ÅÅMMDD-xx (ÅÅ = år, MM = månad, DD = dag, xx = körningsnummer, t.ex. SeptiFast_CCO_050313-01). OBS! Färgkompensationsobjektet måste kvalificeras innan det används med LightCycler SeptiFast Test MG eller LightCycler SeptiFast meca Test MG. Utför ett LightCycler SeptiFast Test-experiment för kvalificering av färgkompensationsobjektet För kvalificering av ett nytt färgkompensationsobjekt krävs en LightCycler SeptiFast Test-körning med en RC och en NC som uppfyller kriterierna för acceptans enligt Checklista för kvalificering av färgkompensationsobjekt del 1. Vi rekommenderar att ett dedikerat LightCycler SeptiFast Testexperiment som består av reagenskontroller (RC) och 5 negativa kontroller (NC) utförs så att en NC kan väljas för kvalificering av färgkompensationsobjekt. OBS! Om en giltig LightCycler SeptiFast Test-körning som uppfyller SIS-kriterierna redan finns på LightCycler 2.0-instrumentet kan man välja att fortsätta med avsnittet Välj en giltig LightCycler SeptiFast Test-körning för kvalificering av färgkompensationsobjektet. Använd SeptiFast Lys Kit MG (P/N: 04 404 432 001). Använd SeptiFast Prep Kit MG (P/N: 04 404 459 001). Använd LightCycler SeptiFast Kit MG (P/N: 04 469 046 001). Använd mallen för Checklista för kvalificering av färgkompensationsobjekt del 1 (finns i det här avsnittet). 1. Utför ett LightCycler SeptiFast Test-experiment med hela arbetsgången (inklusive provberedning och PCR). Experimentet består av RC och NC för alla 3 analyserna. Vi rekommenderar att ytterligare fyra NC används som prov 1 till 4. OBS! En detaljerad beskrivning av prov- och kontrollberedning, reagensberedning, beredning av PCR och laddning och användning av instrumentet LightCycler 2.0 finns i respektive avsnitt i den här bipacksedeln. OBS! Spara körningen med ett namn som ger otvetydig identifiering (t.ex. Qualification_ÅÅMMDD-xx, YY = år, MM = månad, DD = dag, xx = körningsnummer). 2. Analysera körningen enligt beskrivningen i avsnittet Toppdetektion och automatisk providentifiering och avsluta med att skriva ut SIS-rapporten (SeptiFast Identification Software). 3. Fyll i Checklista för kvalificering av färgkompensationsobjekt del 1 för att utvärdera resultaten för FLAGS och COMMENTS i RUN FLAGS eller ASSAY FLAGS och resultaten i Specimen-rutan för de 4 prov-nc som angetts i SIS-rapporten. Den här checklistan måste användas för dokumentation. 4. Gå tillbaka till LightCycler SeptiFast Test-körningen och utvärdera båda Abs Quant-modulerna [G(+) 610 och 640] enligt Checklista för kvalificering av färgkompensationsobjekt del 1. Den här checklistan måste användas för dokumentation. Börja med Abs Quant-modulen G(+) 610. Följ instruktionerna nedan även för Abs Quant-modulen G(+) 640. Rulla ned till analysmodulen [Abs Quant G(+) 610 Module] och klicka på den. Gör analysfönstret större genom att klicka på listen. Kontrollera om det finns en CP. Skriv in ett J (Ja) eller N (Nej) i kolumnen CP eller CP i [ ] beroende på resultatet. Slutför dokumentationen genom att skriva ut analysresultatfönstret i programmet LightCycler (välj <print window> i menyn File). En kopia av utskrifterna måste sparas. Bekräfta att det här steget är utfört genom att sätta en markering i kolumnen Print Window i Checklista för kvalificering av färgkompensationsobjekt del 1. 5. Kontrollera om kriterierna för acceptans enligt Checklista för kvalificering av färgkompensationsobjekt del 1 har uppfyllts. 6. Välj en av de negativa kontrollerna utan CP och fortsätt med avsnittet Kvalificering av färgkompensationsobjekt (CCO). OBS! En LightCycler SeptiFast Test-körning som uppfyller alla kriterier för acceptans kan användas som dedikerad LightCycler SeptiFast.ixo-fil för alla vidare kvalificeringar av färgkompensationsobjekt. En LightCycler SeptiFast Test-körning som inte uppfyller alla acceptanskriterier får inte användas för kvalificering av färgkompensationsobjekt. Upprepa i detta fall LightCycler SeptiFast Testexperimentet med helt nya negativa kontroller. 04802900001-07SV 7 Doc Rev. 7.0

Checklista för kvalificering av färgkompensationsobjekt del 1 (kontroll av LightCycler SeptiFast Test-körning och val av en negativ kontroll) Vi rekommenderar att du kopierar den här checklistan för att ha som dokumentation. Operator s Name / Date: LightCycler SeptiFast Test run (*.ixo-file): Se avsnittet Utför ett LightCycler SeptiFast Test-experiment för kvalificering av färgkompensationsobjektet, steg 2 och 3: Analysera LightCycler SeptiFast Test-körningen. Exportera LightCycler SeptiFast Test-körningen. Utvärdera resultaten för FLAGS eller COMMENTS i Run Flags och Assay Flags i SIS-rapporten. Run Flags (J/N) Assay Flags (J/N) Acceptanskriterium 1: Ett Nej (N) i Run Flags och Assay Flags. OBS! Vid ett JA (J) i Run Flags eller Assay Flags ska arbetsgången för LightCycler SeptiFast Test upprepas med helt nya negativa kontroller. Utvärdera resultaten i Specimen-rutan i SIS-rapporten för de 4 prov-nc (endast tillämpligt för en dedikerad LightCycler SeptiFast Testkörning med 4 prov-nc). Acceptanskriterium 2: Θ : no analyte detected i resultatkolumnen för en prov-nc. OBS! Prov-NC med en analyt som har detekterats får inte användas för vidare analys. Skriv ut SIS-rapporten för dokumentation. Print SIS Report Se avsnittet Utför ett LightCycler SeptiFast Test-experiment för kvalificering av färgkompensationsobjektet, steg 4 till 6: Gå tillbaka till LightCycler SeptiFast Test-körningen för att analysera båda Abs Quant-modulerna [G(+) 610 och 640]. Prov Abs Quant G(+) 610 CP eller CP i [ ] (J/N) Abs Quant G(+) 640 #NC# Endast tillämpligt för en dedikerad LightCycler SeptiFast-körning med 4 prov-nc: Prov 1-NC Prov 2-NC Prov 3-NC Prov 4-NC Print Window 610 Print Window 640 Acceptanskriterium 3: Ett Nej (N) i kolumnen CP eller CP i [ ] för både Abs Quant G(+) 610 och Abs Quant G(+) 640-modulerna i minst en negativ kontroll. OBS! Om alla negativa kontroller inte uppfyller det här acceptanskriteriet ska arbetsgången för LightCycler SeptiFast Test upprepas med helt nya negativa kontroller. Acceptanskriterium 1, 2 och 3 är uppfyllda: JA NEJ Körningen kan användas för kvalificering av färgkompensationsobjekt Körningen kan inte användas för kvalificering av färgkompensationsobjekt Negativ kontroll som valts för kvalificeringen (provnamn): 04802900001-07SV 8 Doc Rev. 7.0

Välj en giltig LightCycler SeptiFast Test-körning för kvalificering av färgkompensationsobjektet Fortsätt alternativt till avsnittet Utför ett LightCycler SeptiFast Test-experiment för kvalificering av färgkompensationsobjektet. Endast tillämpligt om en giltig LightCycler SeptiFast Test-körning som uppfyller de giltighetskriterier som beskrivs i avsnittet Utför ett LightCycler SeptiFast-experiment för kvalificering av färgkompensationsobjektet redan är tillgänglig på instrumentet LightCycler 2.0. Använd mallen för Checklista för kvalificering av färgkompensationsobjekt del 1 (finns i avsnittet Utför ett LightCycler SeptiFast Testexperiment för kvalificering av färgkompensationsobjektet ). 1. Välj en tidigare utförd LightCycler SeptiFast Test-körning som är giltig. Den här körningen ska ha bekräftats som giltig av respektive SIS-rapport. 2. Tillämpa det nya färgkompensationsobjektet på den giltiga LightCycler SeptiFast Test-körningen: Öppna den valda giltiga LightCycler SeptiFast Test-filen. Öppna Run-modulen. Välj det nya färgkompensationsobjektet i menyn <Color Compensation (On)> på följande sätt (se bild 1): Klicka på <Color Compensation (On)>. Klicka på <Select Color Compensation >. Bild 1: Tillämpa ett färgkompensationsobjekt En dialogruta öppnas (<Select Object>). Leta upp och välj det nya färgkompensationsobjektet. Klicka på <OK>. En annan dialogruta öppnas (<Color Compensation Channels>). Inaktivera inte någon av kanalerna. Klicka på <OK>. Gör på samma sätt med alla de 12 Tm-hämtningsmodulerna (3 analyser, 4 kanaler) och de 2 absoluta kvantifikationsmodulerna. 3. Analysera LightCycler SeptiFast-körningen enligt beskrivningen i avsnittet Utför ett LightCycler SeptiFast Test-experiment för kvalificering av färgkompensationsobjektet, steg 2 och 3. 4. Utvärdera båda Abs Quant-modulerna [G(+) 610 och 640] enligt beskrivningen i avsnittet Utför ett LightCycler SeptiFast Test-experiment för kvalificering av färgkompensationsobjektet, steg 4 till 6. 5. Spara körningen med det nyligen tillämpade färgkompensationsobjektet. En dialogruta öppnas (<Change Log>). Skriv in orsaken till ändringarna (t.ex. nytt färgkompensationsobjekt har tillämpats). Kvalificering av färgkompensationsobjekt (CCO) 1. Öppna den speciella LightCycler SeptiFast Test-filen. 2. Kvalificera färgkompensationsobjektet med hjälp av den valda negativa kontrollen (se Checklista för kvalificering av färgkompensationsobjekt del 1 ). 3. Utvärdera alla T M -hämtningsmoduler enligt Checklista för kvalificering av färgkompensationsobjekt del 2. Den här checklistan måste användas för dokumentation. Följ instruktionerna nedan för alla T M -hämtningsmoduler och T M -targetintervall. Börja med T M -hämtningsmodul G(+) 640: Klicka på analysmodulen [t.ex. TM-hämtning G(+) 640]. Aktivera den valda negativa kontrollen tillsammans med #RC# för att få en översikt. (Automatisk värdering anpassas efter den högsta toppen.) Redigera baseline med de aktuella CCO-kvalificerings-baseline -värdena som anges i kolumnen CCO-kvalificerings-baseline i Checklista för kvalificering av färgkompensationsobjekt del 2 (se bild 2). OBS! Varje Target T M -intervall kräver en ny och annan baseline-inställning för kontroll av den negativa kontrollen. Aktivera endast den valda negativa kontrollen (se bild 3). Automatisk värdering anpassas efter bakgrundfluorescensen för den negativa kontrollen. Baseline kanske inte längre är synlig. Bild 2: Smältkurvor för RC och NC (översikt) RC NC CCO-kvalificerings-baseline 04802900001-07SV 9 Doc Rev. 7.0

Bild 3: Analysresultatfönster för NC i programmet LightCycler CCO-kvalificerings-baseline NC Target T M -intervall Välj två T M -staplar för att markera de undre och övre värdena för Target T M -intervallet. Information om ändring av värdena i TM-stapelrutorna finns i Checklista för kvalificering av färgkompensationsobjekt del 2, kolumnen Target T M -intervall. Kontrollera den maximala fluorescenshöjden för den valda negativa kontrollen inom Target T M -intervallet. Skriv in ett J (Ja) eller N (Nej) i kolumnen Maximal fluorescenshöjd nedanför CCO-kvalificerings-baseline beroende på resultatet. Slutför dokumentationen genom att skriva ut analysresultatfönstret i programmet LightCycler (välj <print window> i menyn File). En kopia av utskrifterna måste sparas. Bekräfta att det här steget är utfört genom att sätta en markering i kolumnen Print Window i Checklista för kvalificering av färgkompensationsobjekt del 2. 4. Upprepa steg 3 tills alla Target T M -intervall i alla T M -hämtningsmoduler som anges i Checklista för kvalificering av färgkompensationsobjekt del 2 har analyserats och dokumenterats genom den ifyllda checklistan och utskrifterna. 5. Kontrollera om kriterierna för acceptans enligt Checklista för kvalificering av färgkompensationsobjekt del 2 har uppfyllts. Ett färgkompensationsobjekt som uppfyller kriterierna för acceptans är giltigt och kan användas i sex månader. En ny färgkompensationskörning och kvalificering måste utföras var sjätte månad. Felsökning Så snart som kriterierna för acceptans enligt Checklista för kvalificering av färgkompensationsobjekt del 2 inte uppfylls är färgkompensationsobjektet inte giltigt och får inte användas. MCC-experimentet måste upprepas och en ny CCO-kvalificering måste utföras för det nya färgkompensationsobjektet. Om CCO-kvalificeringen misslyckas för ett tredje färgkompensationsobjekt ska du kontakta närmaste Rocherepresentant. 04802900001-07SV 10 Doc Rev. 7.0

Checklista för kvalificering av färgkompensationsobjekt del 2 Vi rekommenderar att du kopierar den här checklistan för att ha som dokumentation. Operator s Name / Date: LightCycler SeptiFast Test-körning som använts för kvalificering av färgkompensationsobjekt (*.ixo-fil): Negativ kontroll som valts för kvalificeringen (provnamn): CCO (*.ixo-fil): Se avsnittet Kvalificering av färgkompensationsobjekt (CCO) steg 1 till 4: Kvalificera färgkompensationsobjektet med hjälp av den valda negativa kontrollen. T M -hämtningsmodul Prov CCO-kvalificeringsbaseline Target T M -intervall Maximal fluorescenshöjd nedanför CCOkvalificerings-baseline (J/N) Print Window T M -hämtning G(+) 640 NC 0,029 49,03 56,04 NC 0,037 59,07 63,07 T M -hämtning G(+) 670 NC 0,061 49,32 53,42 T M -hämtning G(+) 705 NC 0,031 60,33 64,33 T M -hämtning G( ) 640 NC 0,039 55,48 62,37 NC 0,004 63,81 68,06 T M -hämtning G( ) 670 NC 0,256 48,88 53,38 NC 0,223 55,50 60,00 T M -hämtning F 670 NC 0,107 49,51 53,51 Kriterium för acceptans: Ett JA (J) i kolumnen Maximal fluorescenshöjd nedanför CCO-kvalificerings-baseline för alla T M -hämtningsmoduler och CCO-kvalificerings-baselines i den valda negativa kontrollen. JA NEJ Färgkompensationsobjektet är giltigt och kan användas i sex månader. Färgkompensationsobjektet får inte användas. Se avsnittet Felsökning. Installation av SeptiFast Identification Software v2.0 (SIS): För installation av uppdateringar ska du kontrollera om ytterligare information medföljer produkten. 1. Logga in på LightCycler -datastationen som administratör. 2. Sätt i SeptiFast Software Set-CD-skivan i CD-enheten på LightCycler -datastationen. OBS! Om programinstallationen inte startar automatiskt startar du installationen av SIS manuellt genom att klicka på filen setup.exe som finns på CD-skivan SeptiFast Software Set. 3. För installation första gången: Om Microsoft.NET 1.1 framework inte är installerat kommer du att uppmanas att installera programmet i början av SIS-setup. Microsoft.NET 1.1 framework måste installeras, annars kommer inte SIS att fungera korrekt. 4. Tryck på <OK> för att starta SIS-installationen och följ installationsguiden. 5. Välj <just me> om endast en användare ska arbeta med LightCycler -datastationen, och välj <everyone> om fler än en användare ska arbeta med LightCycler -datastationen. 04802900001-07SV 11 Doc Rev. 7.0

6. Bekräfta fönstret <Setup succeeded> med <OK> (SIS kan nu startas från skrivbordet genom att du klickar på ikonen). 7. Datamappen för *.ixo-filer: <C:\Export to SIS> skapas automatiskt. Test för korrekt installation av SIS (för test with LightCycler SeptiFast Test MG och LightCycler SeptiFast meca Kit MG): 1. Alla proof-filer kopieras automatisk från SeptiFast Software Set-CD-skivan till mappen <C:\Export to SIS>. 2. Dubbelklicka på SIS-ikonen på skrivbordet och tryck på <Start>. 3. Välj proof-fil från <C:\Export to SIS> (SeptiFast Proof v2.0.ixo respektive SeptiFast meca Proof v2.0). 4. Välj NO för att bekräfta om LightCycler -rapporten innehåller flaggan <User Developed or Modified Test Method>. 5. Filen analyseras automatiskt och data visas. 6. Skriv ut rapporten. 7. Öppna och skriv ut de korrelerande pdf-filerna (SeptiFast Proof v2.0.pdf respektive SeptiFast meca Proof v2.0.pdf). 8. Den utskrivna rapporten och proof.pdf:en måste matcha varandra. Om inte ska du kontakta din Roche-representant. 9. Utför steg 3 8 med den andra proof-filen. Avinstallation av SIS: 1. Logga in på LightCycler -datastationen som administratör. 2. Klicka på <Start> i aktivitetsfältet på LightCycler -datastationen. 3. Välj <Settings - Control Panel - Add/Remove Programs>. 4. En lista på alla aktuella installerade program visas. Klicka på <SIS>. 5. Välj <Remove> och bekräfta med <Yes>. Installation av SeptiFast Macros: 1. Installera makros från CD-skivan SeptiFast Software Set v2.0. 2. Se användarhandboken för instrumentet LightCycler 2.0 för installation av makro ( för in vitro diagnostisk användning ). Förbereda facket för laminärt flöde och PCR-arbetsstationen 1. Rengör och sanera noggrant det laminära flödesfacket och PCR-arbetsstationen (t.ex. med LTK-008 ). 2. Slå på i minst 30 minuter: UV-ljuset och luftströmmen för det laminära flödesfacket, UV-ljus för PCR-arbetsstationen. 3. Slå av UV-ljuset medan du arbetar. 4. Öppna LightCycler SeptiFast Kit MG och ta ut: 1 flaska IC och 1 flaska NC och låt dem tina i 2 till 8 C i ett rack för extraktion (medföljer ej). 1 flaska RM 1a, RM 1b, DM G+, DM G-, DM F, RC G+, RC G-, RC F och låt dem tina i SeptiFast kylblock till 2 till 8 C under extraktion. 5. Slå på: Termomixer 1 (för 15 ml-rör) och ställ in på 56 C, termomixer 2 (för 2,0 ml-rör) och ställ in på 70 C. 6. Placera tillräckligt med EB (1 flaska per prov/nc) i termomixer 2 (70 C). 7. Ställ provrör med blod eller provflaskor på rullmixern och blanda i 30 minuter. Bearbeta omedelbart. Prov- och kontrollextraktion OBS! Utför alla hanteringssteg i facket för laminärt flöde. Förslag på beredning av positiv kontrollmaterial När extraktionsproceduren väl har satts igång måste alla steg fullföljas. Positiv kontrollmaterial kan köpas från andra företag. Om det bereds i användarens laboratorium ska välkarakteriserade kliniska isolater väljas enligt den lokala prevalensen och den kliniska inverkan. Dessa isolerade kolonier ska resuspenderas och spikas i negativt blod till en koncentration på ungefär 300 CFU/ml. För positiv kontroll kan ATCC material 33592, en meticillinresistent S. aureus, användas som ger möjlighet att använda eluat som positiv kontroll även för LightCycler SeptiFast Test MG och LightCycler SeptiFast meca Kit MG (P/N: 04 488 814 001). Stammen odlades i 18 24 timmar i 28 till 37 C på blodagar (5 % fårblod) och resuspenderades i buffert till 0,5 McFarland (~1,5x10 8 CFU/ml). Denna suspension är spikad i negativt blod till en slutlig koncentration på 300 CFU/ml. Pre-lyseringsförfarande med SeptiFast Lys Kit MG OBS! Läs användarhandboken för instrumentet MagNALyser noggrant. 1. Använd 1 lämpligt märkt flaska LM för varje prov eller NC. 2. Öppna flaskan och överför 1 500 µl provblod eller NC. 3. Stäng röret ordentligt. OBS! Märk inte korken på rören. 4. Pre-lysera prover i instrumentet MagNALyser i 70 sekunder i 7 000 rpm. 5. Låt flaskorna stå utanför instrumentet i 10 minuter. Centrifugera inte! Extraktion med SeptiFast Prep Kit MG OBS! Allt reagens ska vara klara lösningar. Om fällning har bildats ska du värma upp lösningen (till högst 37 C). Skaka försiktigt tills fällningen löses upp. 1. Tillsätt 150 µl PK i BET 1. 2. Tillsätt 1 ml pre-lyserat prov eller NC till BET 1. Undvik att pipettera lyseringsmatris eller skum. 3. Förslut och vortexa kort. 4. Tillsätt 10 µl IC. Använd en ny pipettspets för varje prov eller NC. 5. Tillsätt innehållet i 2 flaskor LB, förslut och vortexa omedelbart och noga. 6. Inkubera 15 minuter i 56 C genom att blanda försiktigt (t.ex. 500 rpm med Eppendorf termomixer). OBS! Alla vätskor i BET 1 måste täckas med inkubering. 7. Tillsätt innehållet i 1 flaska BB, förslut och vortexa. 8. Sätt FC på BET 2. Rör inte innersidan eller uttaget för FC. 9. Pipettera hälften av extraktionsblandningen från BET 1 på FC-filtret (cirka 2,7 ml). 10. Förslut och centrifugera BET 2-FC-enheten i 1 minut i 1 900 x g. 11. Pipettera återstoden av extraktionsblandningen från BET 1 på FC-filtret (cirka 2,7 ml). Använd en ny pipettspets för varje prov eller NC. 12. Förslut och centrifugera BET 2-FC-enheten i 3 minuter i 1 900 x g. 13. Sätt FC på BET 3. Kassera BET 2 med genomflöde. 14. Tillsätt innehållet i en flaska IRB på FC-filtret i BET 3. 04802900001-07SV 12 Doc Rev. 7.0

15. Förslut och centrifugera BET 3-FC-enheten i 2 minuter i 4 200 x g. 16. Tillsätt innehållet i en flaska WB på FC-filtret i BET 3. 17. Förslut och centrifugera BET 3-FC-enheten i 10 minuter i 4 200 x g. 18. Sätt FC på BET 4. Kassera BET 3 med genomflöde. 19. Centrifugera BET 4 i 1 minut i 4 200 x g. 20. Sätt FC på BET 5. Kassera BET 4. 21. Pipettera 300 µl föruppvärmd EB (70 C) i mitten av FC. 22. Förslut och inkubera i 5 minuter i rumstemperatur. 23. Centrifugera i 2 minuter i 4 200 x g. 24. Kassera FC. Överför eluat i 1,5 ml-flaskor (t.ex. med serumpipetter från greiner bio-one). Undvik kontakt med rörets sida. Reagensberedning med LightCycler SeptiFast Kit MG OBS! Vi rekommenderar att du utför alla hanteringssteg i en PCR-arbetsstation åtskilt från extraktionsstället. 1. Ta ut SeptiFast kylblock med reagensflaskor från kylskåpet, dekontaminera med DNA-dekontaminationsreagens (t.ex. LTK-008 ) och överför till PCR-arbetsstationen. 2. Vortexa de tinade reagensen kort (utom RM 1a) och låt alla reagens hastigt sjunka till botten. (Om fällningar har bildats, värm upp lösningen till 37 C i 5 minuter och blanda försiktigt tills fällningarna har lösts upp.) 3. Placera flaskorna med tinat reagens samt eluatflaskor i de angivna positionerna i SeptiFast-kylblocket. 4. Öppna flaskorna RM 1b, RM 1a, DM G+, DM G- och DM F. 5. Pipettera 600 µl RM 1b i RM 1a och blanda försiktigt genom att pipettera upp och ner. 6. Pipettera 200 µl reaktionsmix från 1a i varje flaska DM G+, DM G- och DM F för att skapa Master Mix MM G(+), MM G(-) och MM F; blanda försiktigt genom att pipettera upp och ner. Beredning av PCR-reaktioner 1. Placera det antal kapillärer som krävs i SeptiFast-kylblocken, 3 kapillärer för RC (positionerna 1, 2, 3), 3 kapillärer för eluat av NC (positionerna 4, 5, 6), 3 kapillärer för varje eluat av prover (positionerna 7 och uppåt). 2. Pipettera 50 µl av MM G(+) i varje kapillär på den översta raden. 3. Pipettera 50 µl av MM G(-) i varje kapillär på mellanraden. 4. Pipettera 50 µl av MM F i varje kapillär på den nedersta raden. 5. Öppna den första proveluatflaskan. Börja med flaskan på höger sida om SeptiFast-kylblocket. 6. Pipettera 50 µl av proveluat i var och en av de tre kapillärerna ovan, som innehåller MM G(+), MM G(-) och MM F. OBS! Byt spets vid varje pipetteringssteg. 7. Stäng de tre kapillärerna med capping tool (ingår i instrumentet LightCycler 2.0; se användarhanboken för LightCycler 2.0 för instruktioner om användning). 8. Fortsätt med de återstående proveluaten enligt beskrivningen för steg 5 7. Pipettera sist NC-eluat i kapillärerna i positionerna 4, 5 och 6. 9. Öppna RC G+. 10. Pipettera 50 µl i kapillären för position 1. 11. Stäng kapillären och därefter RC G+. 12. Pipettera RC G- och RC F i kapillärpositionerna 2 respektive 3, enligt beskrivningen för steg 9 11. 13. Överför alla kapillärer efter deras nummer i LightCycler -provkarusellen. 14. Centrifugera LightCycler -provkarusellen med LC 2.0-karusellcentrifugen. 15. Placera LightCycler -provkarusellen i instrumentet LightCycler 2.0. Förvaring av återstående reagens och eluat 1. Märk alla oanvända Master Mix-blandningar MM G(+), MM G(-) och MM F med antal återstående reaktioner och datum. Placera flaskorna i motsvarande positioner i SeptiFast-kylblocket. 2. Master Mix MM kan förvaras i 2 till 8 C i upp till 3 dagar. För nästa körning kan sparad Master Mix (MM) fyllas på med färskt MM för att uppnå den volym med arbetslösning som krävs. Denna lösning måste användas omedelbart. 3. Märk eluatprover och NC med körningsnummer och datum och förvara enligt anvisningarna. 4. Kassera alla tomma reagensflaskor. Laddning och drift av instrumentet LightCycler 2.0 OBS! Vi rekommenderar att du kör instrumentet LightCycler 2.0 i ett rum som är åtskilt från DNA-rening och beredning av arbetslösningar. 1. Starta SeptiFast Macro SeptiFast_2.0_04469046001 (se användarhandboken för instrumentet LightCycler 2.0, kapitlet Köra ett Roche-makro ). OBS! Fortsätt inte körningen om användaren är utloggad. Starta en ny körning med ett nytt namn. OBS! Använd inte fältet <assay lot number>. Om du vill lägga till analyslotnumret till körningen ska du skriva in informationen i respektive fält i provredigeraren. 2. Spara körningen med ett namn som ger otvetydig identifiering (t.ex. användarnamn och datum). 3. Minska antalet prover från standardladdningslistan om färre än 7 prover krävs. Ta bort alla 3 kapillärerna för ett prov i listan, inte bara 1 eller 2 av de 3 parallellanalyserna. Om för många kapillärer oavsiktligt raderas ska du inte lägga till dem utan starta om proceduren från början. 4. Det är möjligt att skriva in patientspecifika data i <parenteser> istället för att använda standardinställning [t.ex. G(+) <Namn_01> istället för G(+) <prov 1>]. Texten måste vara identisk för de 3 parallellanalyserna i en provlista för att säkerställa rätt providentifiering av SIS. Alternativt kan du lämna standardinställningarna och, om så behövs, använda <Run Note> för att skriva in data. 5. När all provspecifik information har lagts till fortsätter du med kitguiden och startar körningen i instrumentet LightCycler 2.0. OBS! Vissa specialtecken som ' och < > ` och kan orsaka problem med namnkonventionen när man anger ett namn i namnfältet. OBS! Ändra inte prefixen G(+), G(-), F. Byt inte namn på reagenskontroller [t.ex. G(+) #RC#] och negativa kontroller [t.ex. G(+) #NC#]. 6. När körningen är avslutad ska du kontrollera vätskenivån i kapillärerna (resultat för en kapillär är ogiltiga om volymen i kapillären är variabel). 04802900001-07SV 13 Doc Rev. 7.0

Toppdetektion och automatiserad providentifiering Allmän förklaring av analysmoduler OBS! Starta inte dataanalys medan körning pågår i instrumentet LightCycler 2.0. Manuell T M -hämtning kräver 12 T M -hämtningsmoduler (3 analyser, 4 kanaler). Den absoluta kvantifikationsmodulen kräver inte något ingripande av användaren förutom en visuell kontroll. Manuell T M -hämtning kan utföras i upp till 6 toppar med hjälp av T M -staplar (upp till 6 toppar kan markeras för vilket givet prov eller vilken given kontrollkurva som helst). T M -stapelinställningarna för varje analysmodul är fördefinierade i SeptiFast-makrot. Alla kurvor för den valda bilden visas i smälttoppens fönster. Du kan välja eller välja bort T M -staplar utan att generera en flagga. Baseline för varje analysmodul är fördefinierad i SeptiFast-makrot. Du får inte ändra eller välja bort baselines. Om du råkar ändra ska du skriva in de rätta värdena från tabell 3: Baseline-värden. Om fler än en kapillär aktiveras visas inställningarna för den första kapillären i kryssrutan. Byte av staplar påverkar alla aktiverade kapillärer. OBS! Ändra inte följande inställningar: <Channel>, <Color Compensation>, <Program>, <Method>, <Show Shoulders>, <Peak Area> eller <Peak Width>. Inställningen <Display - Peak Height> kan väljas. Topparna är definierade som maximalt över baseline. Riktningsförändringar är inte toppar. Undantag är RC G-, kanal 610 (t.ex. bild 4, kurva 2) och 670 samt RC F, kanal 705. I kurva 1 är de två vänstra topparna maximum och måste markeras med staplar. I kurva 2 visas en av topparna (t.ex. den andra) som en riktningsförändring, men måste även den markeras. I kurvorna 3 och 4 saknas en av topparna. Endast två istället för tre staplar måste aktiveras. Bild 4: RC G-, CH 610 kurva 1 kurva 2 kurva 3 kurva 4 Justera varje T M -stapel så att den placeras på den maximala toppen (över baseline), med fokus på T M -intervallen i tabell 2. Markerade toppar utanför de angivna T M -intervallen rapporteras inte i SIS-rapporten. Tabell 2: T M -intervall för giltiga toppar CH 610 CH 640 CH 670 CH 705 Lågt T M [ C] Högt T M [ C] Lågt T M [ C] Högt T M [ C] Lågt T M [ C] Högt T M [ C] Lågt T M [ C] Högt T M [ C] G(+) 48 53 49 64 49 59 45 65 G(-) 52 66 55 69 48 65 57 62 F 56 61 44 58 49 62 51 62 Värdena för dessa baselines är fördefinierade enligt följande tabell och får inte ändras. (Om värdena skulle råka ändras ska du skriva in dem igen enligt tabellen, annars kommer körningen att flaggas.) Tabell 3: Baseline-värden CH 610 CH 640 CH 670 CH 705 G(+) 0,159 0,027 0,061 0,027 G(-) 0,234 0,001 0,236 0,065 F 0,196 0,033 0,111 0,059 Justera T M -staplarna 1. När körningen är avslutad visar experimentguiden <Analyses have been created>. 2. Flytta fönstret till nederst på sidan (tryck inte på <Finish>). 3. Se till att T M - och baseline-värdena är synliga. 4. Klicka på analysmodulen [t.ex. T M -hämtning G(+) 610]. 5. Aktivera alla positioner i analysen för att få en översikt [t.ex. G(+)]. 6. Klicka endast på positionen G(+) #RC#. 7. Justera T M -staplarna så att den maximala toppen går över baseline, med fokus endast på de giltiga T M -intervallen (se tabell 2: T M -intervall för giltiga toppar). Om det inte finns någon topp över baseline måste T M -stapeln raderas (inaktivera bocken i respektive ruta). I slutet av T M -hämtningen för en särskild kapillär får endast den maximala toppen markeras med T M -staplar (plana linjer, lutningar eller riktningsförändringar får inte markeras, förutom för de organismer som anges här). I vissa fall kan låga koncentrationer av E. faecium (G+, CH 705, T M 51,8 55,9) och C. albicans (F, CH 640, T M 53,4 57,5) uppträda som riktningsförändring av respektive IC-topp (G+, CH 705, T M 45,5 49,6; F, CH 640, T M 44,8 48,0). Markera dessa riktningsförändringar med T M -staplar vid T M 53,9 (G+, CH 705) och T M 55,5 (F, CH 640). 04802900001-07SV 14 Doc Rev. 7.0

8. Aktivera nästa position [t.ex. G(+) #NC#] tillsammans med G(+) #RC# för att få en översikt. (Automatisk värdering anpassas efter den högsta toppen.) 9. Aktivera endast den valda positionen [t.ex. G(+) #NC#]. (Automatisk värdering anpassas efter bakgrundstoppen för NC. Baseline kanske inte längre är synlig.) 10. Fortsätt med toppdetektion enligt beskrivningen för steg 5 7. 11. När du har avslutat den första analysen [t.ex. T M -hämtning G(+) 610] fortsätter du med nästa, enligt beskrivningen för steg 4 10. Avsluta T M -hämtning 1. Flytta experimentguiden till mitten av skärmen och tryck på <Finish>. 2. En rapport skapas automatiskt och måste skrivas ut. 3. Körningen sparas automatiskt. OBS! Om några ändringar har gjorts i de patientspecifika uppgifterna i det <inramade> området för programmet LightCycler, måste användaren uppdatera databasen genom att markera och klicka på ikonerna Abs Quant G(+) 610 och Abs Quant G(+) 640. 4. Exportera *.ixo-filen till <C:\Export to SIS>. 5. Kontrollera om rapporten innehåller flaggor och om <run state: complete> visas. 6. Om det förekommer flaggor eller om andra meddelanden som gäller körningsstatus visas i LightCycler -programrapporten (LCS) är körningen ogiltig och alla prover måste testas om. Automatisk toppidentifiering med SeptiFast Identification Software (SIS) 1. Dubbelklicka på SIS-ikonen på skrivbordet och tryck på <Start>. 2. Välj körning från mappen <C:\Export to SIS> och ladda *.ixo-filen. 3. Välj Yes eller No för att bekräfta om LightCycler -rapporten innehåller flaggan <User Developed or Modified Test Method> eller inte. 4. *.ixo-filen analyseras automatiskt och data visas i en rapport. 5. Skriv ut SIS-rapporten. RESULTAT Validering av körning Valideringen utförs automatiskt med SIS (SeptiFast Identification Software) v2.0. Ogiltiga körningar visas och markeras med. Om körningen är ogiltig måste hela körningen (alla 3 analyser) upprepas. Systemfel som kan ogiltigförklara en körning anges i avsnittet Felsökning i det här dokumentet. Analysvalidering Flaggor som kan genereras i förhållande till de tre olika analysernas giltighet och deras betydelse visas i tabell 4. Tabell 4: Flaggor för analys- och provvalidering Kommentarer Betydelse ASSAY FLAG NC: IC not detected För NC detekterades ingen target och ingen IC ASSAY FLAG NC: < CH, TM, PH, CP 1 >,< art > För NC detekterades en art ASSAY FLAG NC: more amplicons detected Ytterligare en flagga om fler än 3 amplicon detekterades för NC ASSAY FLAG RC: No amplicon: <art> En eller flera amplicon för RC detekterades inte ASSAY FLAG RC: more amplicons not detected Ytterligare en flagga om fler än 3 amplicon inte detekterades för RC SPECIMEN FLAG IC not detected För IC detekterades ingen target och ingen IC. 1 CP visas endast för G(+) kanal 610, 640. Tolkning av resultat FLAGGOR och KOMMENTARER kan genereras med SIS (SeptiFast Identification Software) v2.0 som RUN FLAGS, ASSAY FLAGS och FLAGS i SPECIMEN-rutan (se nedan). Kontrollera i alla rutor i utskriften om det finns FLAGGOR eller KOMMENTARER. Bild 5: Specimen-rutan Specimen Assay Data Result Flags Comment G(+) <CH..., TM..., PH..., CP...> <art> SeptiFastprov G(-) F 1 CP-värden visas endast för G(+) kanal 610, 640. Mer information finns i COMMENT-fälten i RUN FLAGs och ASSAY FLAGs. Provresultat Namnen på <arterna> i RESULT-fältet indikerar att provet har befunnits positivt för den relevanta mikroorganismen. Beräknade data för de aktuella topparna visas i fältet DATA, inklusive kanalen (CH), smältpunkt (T M ), topphöjd (P H ) och korsningspunkt (CP 1 ). Symbolen i RESULT-fältet betyder att ingen analyt detekterades inom de definierade kriterierna för arterna. 04802900001-07SV 15 Doc Rev. 7.0

Tolkning av CP-värden för G(+) kanaler 610 eller 640 Resultat som visas i de absoluta kvantifikationsanalysmodulerna för programmet LightCycler måste verifieras mot de resultat som visas i SISrapporten. 1. Klicka på ikonen Abs Quant 610. 2. Se till att den resultatkolumn där CP-värdena visas är synlig genom att flytta fönstren med kurvor åt höger på skärmen. 3. Välj en enskild kapillärposition för vilken CP-värdet visas. Kontrollera amplifieringstillväxtkurvan visuellt och försäkra dig om att tillväxten och det CP-värde som visas överensstämmer. 4. Jämför det provresultat som visas med motsvarande provresultat i SIS-rapporten med hjälp av "CP cut-off rule" (regel för Cp-gränsvärde) som förklaras nedan. Försäkra dig om att resultaten överensstämmer. Om inte ska du kontakta din Roche-representant för att få hjälp. 5. Upprepa steg 2 till 4 ovan för alla kapillärpositioner där ett CP-värde visas. 6. Klicka på ikonen Abs Quant 640. 7. Upprepa steg 2 till 5 ovan för alla kapillärpositioner där ett CP-värde visas. Regel för CP-gränsvärde Flera av organismerna i SML (SeptiFast Master List) förekommer i kroppen som normalflora och kan överföras till SeptiFast Test genom blodtagningen. Regeln för Cp-gränsvärde (CP cut-off rule) är en programfunktion som reducerar positivitetsvärdet för vissa organismer som lever i kommensalism baserat på antagandet att de är smittämnen och inte kausala agens för verklig infektion. Regeln för CP-gränsvärde gäller bara CoNS och Streptococcus spp. och har angetts för 20 cykler. Ett CP-värde på < 20 motsvarar ett positivt resultat, medan ett CP-värde på > 20 anses vara en kontaminering och visas som ett negativt resultat i SIS-rapporten. meca-testning Om det finns ett positivt resultat för Staphylococcus aureus bör en efterföljande meca resistenstestning övervägas. Ytterligare information finns i bipacksedeln till LightCycler SeptiFast meca Kit MG (P/N: 04 488 814 001). KVALITETSKONTROLL En negativ kontroll (NC) och en vardera av 3 reagenskontroller (RC) måste finnas i var och en av de 3 parallellanalyserna [G(+), G(-), F] för varje testkörning. NC och RC måste placeras på definierade positioner enligt beskrivningen i avsnittet Beredning av PCR-reaktioner. Vi rekommenderar att du kör ett positivt material från Roche som positiv kontroll genom hela arbetsgången (se avsnittet Material som ej medföljer förpackningen). SIS fastställer resultaten för IC, NC och RC. Om kontrollerna inte uppfyller de definierade specifikationerna flaggas alla provresultat i motsvarande fält i SPECIMEN-rutan. Kontrollera SPECIMEN-rutan i körningsutskriften om det finns flaggor och kommentarer så att du säkerställer att resultaten är giltiga. Negativ kontroll (NC) För varje analys i en giltig körning måste NC vara negativ medan dess interna kontroll måste vara positiv. Om NC inte uppfyller dessa kriterier flaggas alla provresultat som ingår i analysen. Resultaten för den här analysen är ogiltiga och ska inte rapporteras. Resultat från andra giltiga analyser inom samma giltiga körning är giltiga och kan rapporteras. Hela körningen måste emellertid upprepas eftersom programmet LightCycler inte fungerar korrekt om en eller två av tre analyser upprepas. Reagenskontroll (RC) För varje analys i en giltig körning måste RC vara positiv för amplicon targets för RC. Om RC inte uppfyller detta kriterium flaggas alla provresultat som ingår i analysen. Resultaten för den här analysen är ogiltiga och ska inte rapporteras. Resultat från andra giltiga analyser inom samma giltiga körning är giltiga och kan rapporteras. Hela körningen måste emellertid upprepas eftersom programmet LightCycler inte fungerar korrekt om en eller två av tre analyser upprepas. Positiv kontroll Den externa positiva kontrollen måste vara positiv. Om de positiva företagsinterna materialen eller de externa positiva kontrollerna inte uppfyller kriteriet är hela körningen ogiltig och måste upprepas. Ingen flagga visas av SIS. Internkontroll (IC) Internkontrollen måste detekteras positiv för alla negativa prover liksom den negativa kontrollen. Om IC inte uppfyller kriteriet är provresultatet ogiltigt och flaggas. Om ogiltiga kontroller förekommer måste du upprepa hela processen (prov- och kontrollextraktion, amplifiering och detektion för alla 3 analyserna). Om kontrollerna är konsekvent ogiltiga ska du kontakta Roche för teknisk hjälp. 04802900001-07SV 16 Doc Rev. 7.0

FELSÖKNING Tabell 5: Systemmeddelanden som visas i flaggdelarna av SIS-utskriften Systemmeddelande (visas i Sannolik orsak flaggdelarna av SIS-utskriften) User Developed or Modified Test Method CCC File Name: Multiple CCC used! Color Compensation has expired on DD-Month-YY Körningen är ogiltig; trolig orsak finns beskriven i användarhandboken för instrumentet LightCycler 2.0. Standardinställningar för makrot (t.ex. baselines, körningsprotokoll etc.) kan ändras. Två eller flera olika färgkompensationsfiler är aktiva i en eller flera analysmoduler Färgkompensationsobjektet är äldre än sex månader Om ett eller flera prover saknas på SIS-rapporten ska du kontrollera om: 1) Någon av de tre analyskapillärerna för ett prov har fel namn, dvs. de analysspecifika prefixen (G+, G-, F) har råkat raderas eller 2) En eller flera provkapillärer har fått fel namn eller så saknas provkapillärer. För att korrigera ska du öppna den ursprungliga *.ixo-filen i programmet LightCycler och kontrollera stavningen av provnamn i provredigeraren. Ändra till standardnamn, spara och exportera igen. TESTETS BEGRÄNSNINGAR Detta test har endast validerats för användning med humant blod som samlats i K-EDTA-antikoagulant. Testning av andra provtyper kan ge felaktiga resultat, falskt negativa eller falskt positiva. Resultatens tillförlitlighet förutsätter rätt provtagning, transport, förvaring och behandling av prover. Användning av den här produkten ska begränsas till personal som utbildats speciellt för arbetsgången med LightCycler SeptiFast Test MG. Egenskaperna för LightCycler SeptiFast Test MG är fastställda för blod som innehåller 1 000 30 000 WBC/µl. Aktuell taxonomi för mikroorganismer är huvudsakligen beroende av fenotypklassificering (biokemiska och fysiologiska egenskaper) och är kanske inte identisk med genetiska bestämningar. Trots att primers och prober är utformade mot maximalt konserverade regioner på det interna transkriberade spacer-området (ITS), kan den target-specifika smälttemperaturen (T M ) hos H-proberna påverkas av slumpmässig sekvensvariation som påträffas hos mikrobiella arter. I vissa fall när flera organismer från SML presenteras i arten blir inte alla arter rapporterade. Åtgärd Öppna den ursprungliga *.ixo-filen i programmet LightCycler och kontrollera baseline-värden enligt tabell 3. Spara och exportera igen. Välj rätt färgkompensation och beräkna en gång till. Skapa och kvalificera ett nytt färgkompensationsobjekt. Invalid Macro Felaktigt makro körs Sök efter rätt makro i programmet LightCycler och/eller i SeptiFast Software Set v2.0. Invalid Baseline Baseline-värdena kan ha ändrats av misstag Öppna den ursprungliga *.ixo-filen i programmet LightCycler och kontrollera baseline-värden enligt tabell 3. Spara och exportera igen. Invalid Control Tube En eller flera kontroller har fel namn Öppna den ursprungliga *.ixo-filen i programmet LightCycler och kontrollera stavningen av kontrollnamn i provredigeraren. Ändra till standardnamn, spara och exportera igen. Missing Sample Tube Invalid LightCycler SW Version No Manual T M Calling En eller flera provkapillärer har fel namn eller provkapillärer saknas Felaktig version av programmet LightCycler används Ingen manuell T M -hämtning har utförts (vare sig i någon prov- eller analysmodul). Makro har avslutats utan analys Öppna den ursprungliga *.ixo-filen i programmet LightCycler och kontrollera stavningen av provnamn i provredigeraren. Ändra till standardnamn, spara och exportera igen. Öppna programmet LightCycler och sök efter numret på rätt version. Öppna den ursprungliga *.ixo-filen i programmet LightCycler och utför T M -hämtning. Spara och exportera igen. + additional run flags Fler än 5 körningsflaggor har detekterats Försök att åtgärda specifikt beskrivna flaggor och analysera om körningen med SIS. Invalid CCC File Name Två eller flera olika färgkompensationsfiler är aktiva i en eller flera analysmoduler Välj rätt färgkompensationsfil och beräkna en gång till. 04802900001-07SV 17 Doc Rev. 7.0

KLINISK UTVÄRDERING Resultat från klinisk studie Diagnostisk sensitivitet och specificitet beräknades inte eftersom ingen lämplig referensmetod finns tillgänglig. Totalt analyserades 358 prover från 177 sepsis-patienter med antingen BC eller PCR. Prover med arter som inte ingår i SML exkluderades. Tabell 6: Antal arter funna i EDTA-blod under den kliniska studien endast BC endast PCR båda metoderna Staphylococcus aureus 1 17 7 CoNS 14 --- 4 Streptococcus pneumoniae --- 1 --- Streptococcus spp. --- 3 1 Enterococcus faecalis --- 11 2 Enterococcus faecium 1 23 4 Acinetobacter baumannii 1 --- 1 Enterobacter aerogenes / cloacae --- 8 --- Escherichia coli --- 8 6 Klebsiella pneumoniae / oxytoca --- 15 3 Proteus mirabilis --- --- --- Pseudomonas aeruginosa --- 8 --- Serratia marcescens --- --- --- Stenotrophomonas maltophilia --- 2 --- Aspergillus fumigatus --- --- --- Candida albicans --- 8 6 Candida glabrata --- --- 1 Candida krusei --- --- --- Candida parapsilosis --- --- --- Candida tropicalis --- --- --- Alla mikroorganismer 17 104 35 04802900001-07SV 18 Doc Rev. 7.0

ICKE-KLINISK EGENSKAPSUTVÄRDERING Interfererande ämnen Följande ämnen interfererar inte med detektionen av bakterie- och svamp-dna genom detta test. Tabell 7: Interfererande ämnen Nummer Varunamn Aktiv komponent Tillverkare 1 x C max 3 x C max enhet 1 Piperacillin Piperacillin Hexal 4,0 12,0 mg/ml 2 Fortum Ceftazidim GlaxoSmithKline 0,50 1,5 mg/ml 3 Zienam Imipenem/Cilastatin MSD Sharp & Dohme 0,27 0,67 mg/ml 4 Tazobac Piperacillin/Tazobaktam Wyeth Pharma 0,75 2,3 mg/ml 5 Ciprobay Ciprofloxacin Bayer 33,3 100,0 µg/ml 6 Vancomycin Vankomycin Lilly 83,0 250,0 µg/ml 7 Refobacin Gentamicin Merck 80,0 240,0 µg/ml 8 Zyvoxid Linezolid Pfizer 0,10 0,30 mg/ml 9 Sobelin Klindamycin Pfizer 0,30 0,90 mg/ml 10 InfectoClont Metronidazol Infectopharm 83,3 250,0 µg/ml 11 Diflucan Flukonazol Pfizer 0,13 0,39 mg/ml 12 Cancidas Caspofungin MSD Sharp & Dohme 8,3 25,0 µg/ml 13 Amphotericin B Amfotericin B Bristol-Myers Squibb 20,0 60,0 µg/ml 14 Novalgin Metamizol Aventis Pharma 0,83 2,5 mg/ml 15 Dexahexal Dexametason Hexal 1,3 4,0 µg/ml 16 ARA-cell Cytarabin cellpharm 63,3 190,0 µg/ml 17 Arterenol Norepinefrin (Noradrenalin) Aventis Pharma 4,8 14,4 µg/ml 18 Aquo-Trinitrosan Glycerolnitrat Merck 1,3 4,0 µg/ml 19 Heparin-Natrium-5000- ratiopharm Heparin ratiopharm 0,83 2,5 I.U./ml Analytisk sensitivitet Den analytiska sensitiviteten hos LightCycler SeptiFast Test MG analyserades genom träffsannolikhetsanalys för varje analyt i en serie med spädningar om 100, 30 och 3 CFU/ml i EDTA-blod från friska blodgivare (se tabell 8). Minimisensitiviteten 30 CFU/ml erhölls för alla arter, förutom för Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae och Streptococcus mitis (100 CFU/ml). Tabell 8: Arter som testats genom träffsannolikhetsanalys Target Antal positiva/antal testade Target Antal positiva/antal testade Koncentration [CFU/ml] Koncentration [CFU/ml] 100 30 3 100 30 3 Acinetobacter baumannii 8/8 12/12 11/20 Klebsiella pneumoniae 8/8 12/12 17/20 Aspergillus fumigatus 8/8 12/12 20/20 Proteus mirabilis 8/8 12/12 16/20 Candida albicans 8/8 12/12 12/20 Pseudomonas aeruginosa 8/8 12/12 5/20 Candida glabrata 8/8 12/12 10/20 Serratia marcescens 8/8 12/12 19/20 Candida krusei 8/8 12/12 8/20 Staphylococcus aureus 8/8 12/12 8/20 Candida parapsilosis 8/8 12/12 7/20 Staphylococcus epidermidis 1 8/8 1/12 0/20 Candida tropicalis 8/8 12/12 9/20 Staphylococcus haemolyticus 1 8/8 0/12 0/20 Enterobacter aerogenes 8/8 12/12 16/20 Stenotrophomonas maltophilia 8/8 12/12 18/20 Enterobacter cloacae 8/8 12/12 12/20 Streptococcus pneumoniae 8/8 7/12 1/20 Entercoccus faecalis 8/8 12/12 15/20 Streptococcus agalactiae 2 8/8 7/12 0/20 Entercoccus faecium 8/8 12/12 17/20 Streptococcus pyogenes 2 8/8 9/12 4/20 Escherichia coli 8/8 12/12 20/20 Streptococcus mitis 2 8/8 9/12 0/20 Klebsiella oxytoca 8/8 12/12 14/20 1 Arter som representerar gruppen KNS i SML i tabell 1. 2 Arter som representerar gruppen Streptococcus spp. i SML i tabell 1. 04802900001-07SV 19 Doc Rev. 7.0

Analytisk specificitet Inklusivitet För att testa ITS-målområdets likformighet och homogenitet, togs kliniska isolater från ett flertal geografiska områden i Europa (södra, mellersta, norra), Japan och USA. Totalt 1 709 isolater karakteriserades med mikrobiologiska metoder och testades med LightCycler SeptiFast Test MG [se tabell 1 SeptiFast Test Master List (SML)]. Isolaterna från USA och Japan omfattar inte Aspergillus fumigatus, Candida krusei och Staphylococcus haemolyticus. Inom grupperna Streptococcus spp. och koagulasnegativa stafylokocker (KNS), testades de arter som visas i tabell 9 positivt med LightCycler SeptiFast Test MG. Isolaterna från Japan omfattar inte Aspergillus fumigatus och Candida krusei. Tabell 9: Arter som representerar grupperna Streptococcus spp. respektive koagulasnegativa stafylokocker (KNS) testades positivt med LightCycler SeptiFast Test MG Streptococcus spp. Koagulasnegativa stafylokocker (KNS) S. agalactiae S. hominis subsp. novobiosepticus S. anginosus S. pasteuri S. bovis S. warneri S. constellatus S. cohnii subsp. urealyticum S. cristatus S. hominis subsp. hominis S. gordonii S. lugdunensis S. intermedius S. cohnii subsp. cohnii S. milleri S. capitis subsp. ureolyticus S. mitis S. capitis subsp. capitis S. mutans S. caprae S. oralis S. saprophyticus S. parasanguinis S. saprophyticus subsp. saprophyticus S. pneumoniae S. xylosus S. pyogenes S. epidermidis S. salivarius S. haemolyticus S. sanguinis S. thermophilus S. vestibularis S. viridans Avvikande resultat påträffades i färre än 1,2 % av alla resultat. 6 av 143 Enterobacter (aerogenes/cloacae)-stammar var identiska med Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) inom sitt ITS-område och tolkades som Klebsiella (pneumoniae/oxytoca). Citrobacter freundii och Salmonella enterica kan vara identiska med Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) respektive E. coli inom sina ITS-områden och tolkas som Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) respektive E. coli. 14 av 160 Streptococcus viridans-stammar var identiska med Streptococcus pneumoniae inom ITS-området och tolkas som S. pneumoniae. I sällsynta fall kan det hända att Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) inte detekteras om en mutation inom target-sekvensen orsakar en förskjutning av smältpunkten. 04802900001-07SV 20 Doc Rev. 7.0