cobas KRAS Mutation Test KRAS

Transkript

1 cobas KRAS Mutation Test FÖR IN VITRO-DIAGNOSTISK ANVÄNDNING. cobas DNA Sample Preparation Kit DNA SP 24 Tests P/N: cobas KRAS Mutation Test KRAS 24 Tests P/N: MEDDELANDE: Köpet av denna produkt ger köparen rätten att använda den för amplifiering och detektion av nukleinsyrasekvenser via PCR (polymerase chain reaction) och relaterade processer för human in vitro-diagnostik. I det här dokumentet tilldelas inget allmänt patent eller annan licens förutom den särskilda användningsrätt som beviljas vid köpet. AVSEDD ANVÄNDNING cobas KRAS Mutation Test, för användning med cobas 4800-systemet, är ett realtids-pcr-test för identifiering av mutationer i kodonerna 12, 13 och 61 i KRAS-genen i DNA från formalinfixerad paraffininbäddad mänsklig tumörvävnad av kolorektal cancer och icke småcellig lungcancer. SAMMANFATTNING OCH FÖRKLARING AV TESTET KRAS-protein: KRAS-proteinet ingår i familjen små G-proteiner. KRAS fungerar som en GDP/GTP-reglerad strömbrytare för överföring av extracellulära signaler som påverkar celltillväxt, apoptos och remodellering av aktincytoskelettet. Mutationer som påverkar aminosyrorna 12, 13 eller 61 som förekommer i olika humana maligniteter, inklusive kolorektal cancer (CRC) och icke småcellig lungcancer (NSCLC), låser enzymet i GTP-bunden, aktiverad form och resulterar i konstitutiv aktivering, vilket bidrar till den onkogena processen. 1 Kolorektal cancer (CRC): KRAS-mutationer observeras i 24 % 43 % av kolorektala tumörer. 2-3 Trots att över punktmutationer i KRAS-genen har identifierats förekommer de flesta i kodonerna 12 eller 13 (~82 % i kodon 12 och ~17 % i kodon 13); KRAS-mutationer i andra kodoner (t.ex. kodon 61) är mindre vanliga (1 % 4 % av mutationerna). Kodon 61-mutationer är inte vanligt förekommande, men har visat sig resultera i konstitutiva aktiveringar av KRAS precis som mutationer i kodon 12 och 13, 4 och publicerade uppgifter indikerar att kodon 61-mutationer kan förutsäga brist på respons på anti-egfr monoklonal antikroppsbehandling. 5-6 Cetuximab och panitumumab är monoklonala antikroppar som är riktade mot den epidermala tillväxtfaktorreceptorn (EGFR) och som är godkända för användning på patienter med metastaserande kolorektal cancer. Trots att 50 % till 80 % av kolorektala tumörer har ett ökat EGFR-uttryck, har EGFR-uttryck och genamplifiering endast ett begränsat prediktivt värde vid bestämning av sannolikheten för respons på cetuximab eller panitumumab. 7 Nu finns dock starka bevis för att närvaro av KRAS-mutationer korrelerar med brist på respons på EGFR-riktad antikroppsbehandling hos patienter med metastaserande kolorektal cancer och att användning av EGFR-riktad antikroppsbehandling i den här patientgruppen kan vara skadlig i vissa situationer. 8-9 Stödjande bevisning för den här upptäckten kommer från: Retrospektiva analyser av enarmade studier Retrospektiva analyser av randomiserade studier Prospektiva randomiserade studier 14 Som en följd av dessa studier rekommenderas KRAS-mutationstestning för urval av patienter för anti-egfr-antikroppsbehandling av ledande onkologi-organisationer i USA (ASCO, NCCN) och Europa (ESMO). 17 Dessutom har reglerande myndigheter i USA och Europa begränsat användningen av dessa agens till patienter med KRAS-vildtyp-tumörer Icke småcellig lungcancer (NSCLC): Ett antal återkommande molekylära avvikelser har identifierats i NSCLC. Point-mutationer i KRAS-genen har påträffats i 10 % till 30 % av tumörer med långt framskriden NSCLC, framför allt men inte uteslutande i adenocarcinom. 20 Oftast påverkar somatiska KRAS/RASmutationer kodonerna 12, 13 och 61, vilket resulterar i ansamling av aktivt KRAS/RAS-protein i cellen och påföljande aktivering av de signaleringsvägar som är delaktiga i malign transformation. Enligt de rapporter som publicerats har patienter med KRAS-positiv långt framskriden NSCLC en sämre prognos 21 och gagnas kanske inte av adjuvant kemoterapi 22 eller EGFR TKI-behandling. 23 Det har också visat sig att patienter vars tumörer innehåller EGFR-mutationer inte innehåller KRAS-mutationer och vice versa. 24 Sådana patienter utgör en särskild grupp av NSCLC-patienterna och har ett stort behov av klinisk vård som inte har uppfyllts på grund av färre tillgängliga behandlingsalternativ jämfört med de patienter vars tumörer är KRAS-vildtyp. Avsnittet med information om revidering av dokumentet finns i slutet av det här dokumentet SV 1 Doc Rev. 5.0

2 cobas KRAS Mutation Test cobas KRAS Mutation Test är en PCR-baserad analys utformad för identifiering av förekomst av somatiska mutationer som involverar kodonerna 12, 13 och 61 i proto-onkogenen KRAS, och identifierar således patienter med avancerad CRC som sannolikt inte gagnas av behandling med anti-egfr monoklonala antikroppar eller patienter med NSCLC som kanske inte gagnas av adjuvant kemoterapi eller erlotinib. ANVÄNDNINGSPRINCIPER cobas KRAS Mutation Test baseras på två grundläggande principer: (1) manuell provpreparation för att få fram genomiskt DNA från formalinfixerad, paraffininbäddad vävnad (FFPET), och (2) PCR-amplifiering av mål-dna med hjälp av komplementära primerpar och två oligonukleotidprober märkta med fluorokromer. En prob är utformad för att detektera KRAS-kodon 12/13-sekvensen i exon 2, och den andra proben är utformad för att detektera KRAS-kodon 61-sekvensen i exon 3 i KRAS-genen. Mutationsdetektion uppnås genom smältkurvsanalys med analysinstrumentet cobas z 480. Mutant kontroll, negativ kontroll och kalibrator ingår i varje körning för att bekräfta körningens giltighet. Preparation FFPET-prover bearbetas och genomiskt DNA isoleras med cobas DNA Sample Preparation Kit, en generisk manuell provpreparation baserad på nukleinsyrabindning till glasfiber. Ett avparaffinerat 5 μm snitt av ett FFPET-prov lyseras genom inkubering i förhöjd temperatur med proteas och en kaotropisk lyserings-/bindningsbuffert som frigör nukleinsyror och skyddar det frigjorda genomiska DNA mot DNaser. Därefter tillsätts isopropanol till lyseringsblandningen som sedan centrifugeras genom en kolonn med ett glasfiberfilter. Under centrifugeringen binds genomiskt DNA till glasfiberfiltrets yta. Obundna ämnen, t.ex. salter, proteiner och andra cellulära föroreningar tas bort genom centrifugering. De adsorberade nukleinsyrorna tvättas och elueras sedan med en vattenbaserad lösning. Mängden genomiskt DNA bestäms spektrofotometriskt och justeras till en fastställd koncentration som ska tillsättas i amplifierings-/detektionsmixen. Målsekvensen amplifieras och detekteras sedan med analysinstrumentet cobas z 480 med hjälp av de amplifierings- och detektionsreagens som medföljer i kitet cobas KRAS Mutation Test. PCR-amplifiering Val av målsekvens Kitet cobas KRAS Mutation Test använder primers som definierar en 85 baspar lång målsekvens för exon 2 innehållande KRASkodonerna 12 och 13 och en 75 baspar lång målsekvens för exon 3 innehållande KRAS-kodon 61 i humant genomiskt DNA. Hela KRAS-genen amplifieras inte utan endast sekvenserna mellan primrarna. Målsekvensamplifiering Ett derivat av DNA-polymeras från Thermus-arten Z05 används för målsekvensamplifiering. Först värms PCR-reaktionsmixen så att det genomiska DNA:t denatureras och primrarnas målsekvenser exponeras. När reaktionsmixen svalnar binder uppströms- och nedströmsprimers till mål-dna-sekvenserna. Z05 DNA-polymeras, i närvaro av divalenta metalljoner och överskott av dntp, förlänger varje bunden primer och syntetiserar därmed en andra DNA-sträng. Detta slutför den första PCR-cykeln och ger en dubbelsträngad DNA-kopia som innehåller de 85 och 75 baspar långa målsekvenserna i KRAS-genen. Proceduren upprepas i cykler, där varje cykel effektivt fördubblar mängden amplicon-dna. Hela KRAS-genen amplifieras inte utan endast sekvenserna mellan primerparen. Automatiserad mutationsdetektion i realtid Analysinstrumentet cobas z 480 kan i realtid mäta mängden fluorescens som genereras av specifika PCR-produkter. Efter amplifiering utsätts varje amplicon som genererats med cobas KRAS Mutation Test för ett smältprogram där temperaturen ökas från 40 C till 95 C (TaqMelt). Den vildtyp-specifika proben binder till både vildtyp och mutant amplicon vid låga temperaturer. I bundet tillstånd är fluorescein-reporterfluorokromen på 5'-änden av proben tillräckligt långt borta från quencherfluorokromer i probens 3'-ände, vilket gör att fluorokromen kan sända ut ljus med en specifik våglängd. När temperaturen stiger dissocieras proben från amplicon, vilket gör att quencherfluorokromen kan komma nära fluorokromen och minska mängden mätbar fluorescens. Amplicon med en perfekt matchning till proben (vildtyp) smälter vid en högre temperatur än amplicon med en eller flera felmatchningar (mutationer). Mängden fluorescens vid varje temperaturhöjning mäts och smälttemperaturerna beräknas. Förekomst av en mutant KRAS-sekvens i exon 2, kodonerna 12 och 13 samt i exon 3, kodon 61 kan detekteras när smälttemperaturerna är inom specifika intervall. För att undvika detektion av tysta mutationer i kodon 12 och kodon 13 (ingen aminosyraförändring) fungerar en modifierad bas som universell bas och genererar en smälttemperatur inom vildtypintervallet. Selektiv amplifiering Selektiv amplifiering av målnukleinsyrasekvenser från provet kan göras med cobas KRAS Mutation Test genom användning av AmpErase (uracil-n-glykosylas) och deoxiuridintrifosfat (dutp) 25. AmpErase-enzymet känner igen och katalyserar nedbrytning av DNA-strängar som innehåller deoxiuridin, men inte DNA som innehåller tymidin. Deoxiuridin finns inte i naturligt förekommande DNA, men alltid i amplicon på grund av användningen av dutp i stället för tymidintrifosfat som en av nukleotiodtrifosfaterna i reaktionsmixreagenset. Följaktligen innehåller endast ampliconen deoxiuridin. Deoxiuridin gör kontaminerande amplicon känsligt för nedbrytning av AmpErase-enzym före DNA-amplifieringen. AmpErase-enzymet, som ingår i reaktionsmixreagenset, katalyserar klyvning av DNA innehållande deoxiuridin vid deoxiuridinnukleosiderna genom att öppna deoxiriboskedjan vid C1-positionen. Vid uppvärmning i det första PCR-steget vid alkaliskt ph bryts amplicon-dna-kedjan vid deoxiuridinets position vilket ger icke amplifierbart DNA. AmpErase-enzym är inaktivt vid temperaturer över 55 C, d.v.s. genom alla termocyklersteg. Därför förstörs inte nybildade amplicon. cobas KRAS Mutation Test har visat sig inaktivera minst 10 3 kopior av KRAS-mutant amplicon innehållande deoxiuridin per PCR SV 2 Doc Rev. 5.0

3 REAGENS cobas DNA Sample Preparation Kit cobas DNA-provpreparationskit (P/N: ) DNA TLB (DNA-vävnadslyseringsbuffert) Tris-HCl-buffert Kaliumklorid 0,04 % EDTA 0,1 % Triton X-100 0,09 % natriumazid PK (Proteinas K) Proteinas K (frystorkat) Xn Proteinas K DNA SP 24 test 1 x 10 ml 1 x 100 mg Hälsoskadlig DNA PBB (DNA-paraffinbindningsbuffert) Tris-HCl-buffert 49,6 % guanidinhydroklorid 0,05 % urea 17,3 % Triton X-100 Xn 49,6 % (viktprocent) guanidin-hcl 1 x 10 ml Hälsoskadlig WB I (DNA-tvättbuffert I) Tris-HCl-buffert 64 % guanidinhydroklorid Xn 64 % (viktprocent) guanidin-hcl 1 x 25 ml Hälsoskadlig WB II (DNA-tvättbuffert II) Tris-HCl-buffert Natriumklorid DNA EB (DNA-elueringsbuffert) Tris-HCl-buffert 0,09 % natriumazid FT (filterrör med kork) CT (uppsamlingsrör) 1 x 12,5 ml 1 x 6 ml 1 x 25-pack 3 x 25-pack SV 3 Doc Rev. 5.0

4 cobas KRAS Mutation Test (P/N: ) KRAS MIX (KRAS-reaktionsmix) Tricinbuffert Kaliumacetat Kaliumhydroxid Glycerol 4,76 % dimetylsulfoxid 0,1 % ProClin 300 konserveringsmedel < 0,9 % dntps < 0,1 % Z05 DNA-polymeras (mikrobiellt) < 0,1 % AmpErase-enzym (uracil-n-glykosylas) (mikrobiellt) MGAC (magnesiumacetat) Magnesiumacetat 0,09 % natriumazid KRAS 12/13 OM (KRAS Codon 12/13 Oligo Mix) Tris-HCl-buffert EDTA Poly-rA RNA (syntetiskt) 0,1 % ProClin 300 konserveringsmedel < 0,01 % uppströms- och nedströms-kras-primers < 0,01 % fluorescensmärkt KRAS-prob KRAS 61 OM (KRAS Codon 61 Oligo Mix) Tris-HCl-buffert EDTA Poly-rA RNA (syntetiskt) 0,1 % ProClin 300 konserveringsmedel < 0,01 % uppströms- och nedströms-kras-primers < 0,01 % fluorescensmärkt KRAS-prob KRAS 24 test 4 x 0,3 ml 4 x 0,2 ml 2 x 0,3 ml 2 x 0,3 ml KRAS MC (KRAS-mutationskontroll) Tris-HCl-buffert EDTA Poly-rA RNA (syntetiskt) 0,05 % natriumazid < 0,001 % plasmid-dna som innehåller KRAS exon 2- och 3-sekvenser (mikrobiellt) < 0,001 % KRAS vildtyp-dna (cellodling) KRAS CAL (KRAS-kalibrator) Tris-HCl-buffert EDTA Poly-rA RNA (syntetiskt) 0,05 % natriumazid < 0,001 % KRAS vildtyp-dna (cellodling) DNA SD (DNA-spädningsbuffert) Tris-HCl-buffert 0,09 % natriumazid 4 x 0,1 ml 4 x 0,1 ml 2 x 3,5 ml SV 4 Doc Rev. 5.0

5 VARNINGAR OCH FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER A. FÖR IN VITRO-DIAGNOSTISK ANVÄNDNING. B. Det här testet är avsett för användning med formalinfixerade paraffininbäddade vävnadsprover från kolorektal cancer och icke småcellig lungcancer. C. Pipettera inte med munnen. D. Ät, drick eller rök inte i laboratoriet. E. Undvik mikrobiell kontamination och DNA-kontamination av reagens. F. Kassera oanvända reagens och avfall enligt gällande nationella, regionala och lokala föreskrifter. G. Använd inte kit efter utgångsdatum. H. Blanda inte reagens från olika kit eller loter. I. Handskar ska användas och ska bytas mellan hantering av prover och reagens för att undvika kontamination. J. För att undvika kontamination av Working Master Mix (Working MMX) med DNA-prover ska amplifiering och detektion utföras i ett område som är separerat från DNA-isolering. Arbetsområdet för amplifiering och detektion ska rengöras ordentligt innan preparation av Working MMX. En korrekt rengöring innebär att alla rack och pipetter torkas av ordentligt med en lösning med 0,5 % natriumhypoklorit* och därefter torkas av med en lösning med 70 % etanol. K. DNA PBB och WB I innehåller guanidinhydroklorid. Utspilld vätska som innehåller den här bufferten torkas upp med lämplig laboratoriedetergent och vatten. Om spill med potentiellt smittbärande agens förekommer ska det aktuella området först rengöras med laboratoriedetergent och vatten, och därefter med 0,5 % natriumhypoklorit. Om spill förekommer på analysinstrumentet cobas z 480 ska anvisningarna i instrumenthandboken till analysinstrumentet cobas z 480 följas. *OBS: Vanliga hushållsblekmedel innehåller normalt 5,25 % natriumhypoklorit. En utspädning 1:10 med hushållsblekmedel ger en lösning med 0,5 % natriumhypoklorit. L. Prover ska behandlas som smittbärande i enlighet med säkra laboratorierutiner som exempelvis de rutiner som beskrivs i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 26 och i CLSI-dokument M29-A3 27. M. DNA PBB innehåller Triton X-100 som är irriterande för slemhinnor. Undvik kontakt med ögon, hud och slemhinnor. N. DNA TLB, DNA EB, MGAC, KRAS MC, KRAS CAL och DNA SD innehåller natriumazid. Natriumazid kan reagera med bly- eller kopparrör och bilda mycket explosiva metallazider. Förhindra aziduppbyggnad genom att spola med mycket kallt vatten om lösningar som innehåller natriumazid hälls ut i avloppet. O. Xylen är en farlig kemikalie som ska användas i dragskåp. Kassera den som kemiskt avfall enligt gällande nationella, regionala och lokala föreskrifter. P. Använd engångshandskar, laboratorierock och ögonskydd när du hanterar reagens. Undvik att dessa material kommer i kontakt med hud, ögon och slemhinnor. Tvätta omedelbart med stora mängder vatten vid eventuell kontakt. Brännskador kan annars uppstå. Om spill förekommer, späd med vatten innan spillet torkas upp. Q. Alla engångsartiklar är avsedda att användas en gång. Återanvänd dem inte. R. Använd inte engångsartiklar efter utgångsdatum. S. Använd inte natriumhypokloritlösning (blekmedel) vid rengöring av analysinstrumentet cobas z 480. Rengör analysinstrumentet cobas z 480 enligt anvisningarna i instrumenthandboken till analysinstrumentet cobas z 480. T. Ytterligare varningar, försiktighetsåtgärder och procedurer för att minska kontaminationsrisken för analysinstrumentet cobas z 480 finns i instrumenthandboken till analysinstrumentet cobas z 480. U. Användning av sterila engångspipetter och DNase-fria pipettspetsar rekommenderas SV 5 Doc Rev. 5.0

6 FÖRVARING OCH HANTERING A. Förvara DNA TLB, DNA PBB, WB I, WB II, DNA EB, PK, FT och CT i C. När förpackningen öppnats är DNA TLB, DNA PBB, WB I, WB II, DNA EB och PK hållbara i upp till 8 användningstillfällen under 90 dagar, dock längst till angivet utgångsdatum. B. Efter tillsats av sterilt, nukleasfritt vatten till PK ska oanvänd upplöst PK förvaras i portioner om 450 μl i 20 C. Efter upplösning måste PK användas inom 90 dagar, dock innan angivet utgångsdatum. C. Efter tillsats av absolut etanol ska WB I och WB II förvaras i C. Dessa arbetslösningar är hållbara i 90 dagar, dock längst till angivet utgångsdatum. D. Förvara KRAS MIX, MGAC, KRAS 12/13 OM, KRAS 61 OM, KRAS MC, KRAS CAL och DNA SD i 15 till 25 C. När förpackningen öppnats är reagensen hållbara i upp till 4 användningstillfällen under 60 dagar, dock längst till angivet utgångsdatum. E. Låt alla reagens tina i 15 C till 30 C i minst 1 timme innan användning. Efter att reagens har tinats ska de användas inom 1 timme, och oanvända reagens ska återföras till förvaring i 15 C till 25 C inom 1 timme. Efter att reagensflaskorna har öppnats kan de, med undantag för DNA SD, användas för pipettering av upp till 4 portioner under 60 dagar, dock längst till angivet utgångsdatum. F. KRAS 12/13 OM, KRAS 61 OM och Working MMX (preparerad genom tillsats av KRAS 12/13 OM eller KRAS 61 OM och MGAC till KRAS MIX) ska skyddas mot långvarig exponering för ljus. G. Efter preparation måste Working MMX förvaras mörkt i 2 8 C. De preparerade proverna och kontrollerna måste tillsättas inom 1 timme efter preparation av Working MMX. H. Bearbetade prover (extraherat DNA) är hållbara i upp till 24 timmar i 15 C till 30 C eller upp till 14 dagar i 2 C till 8 C eller upp till 60 dagar i 15 C till 25 C eller när de har genomgått 3 frys-tiningscykler vid förvaring i 15 C till 25 C. Extraherat DNA ska amplifieras inom den rekommenderade förvaringstiden, dock före utgångsdatum för det cobas DNA Sample Preparation Kit som användes för att extrahera DNA. I. Amplifieringen ska startas inom 1 timme efter att de bearbetade proverna och kontrollerna har tillsatts i Working MMX (preparerad genom tillsats av KRAS 12/13 OM eller KRAS 61 OM och MGAC till KRAS MIX). MATERIAL SOM MEDFÖLJER A. cobas DNA Sample Preparation Kit 24 test cobas DNA SP DNA-provpreparationskit (P/N: ) DNA TLB (DNA-vävnadslyseringsbuffert) PK (proteinas K) DNA PBB (DNA-paraffinbindningsbuffert) WB I (DNA-tvättbuffert I) WB II (DNA-tvättbuffert II) DNA EB (DNA-elueringsbuffert) FT (filterrör med kork) CT (uppsamlingsrör) B. cobas KRAS Mutation Test KRAS 24 test (P/N: ) KRAS MIX (reaktionsmix) (transparent lock) MGAC (magnesiumacetat) (gult lock) SV 6 Doc Rev. 5.0

7 KRAS 12/13 OM (KRAS Codon 12/13 Oligo Mix) (vitt lock) KRAS 61 OM (KRAS Codon 61 Oligo Mix) (guldfärgat lock) KRAS MC (KRAS-mutationskontroll) (rött lock) KRAS CAL (KRAS-kalibrator) (lila lock) DNA SD (DNA-spädningsbuffert) MATERIAL SOM BEHÖVS MEN INTE MEDFÖLJER Xylen (Sigma, katalognr eller Fisher Scientific, katalognr X5-4) Absolut etanol (Sigma, katalognr E7023 eller Fisher Scientific, katalognr BP ) Isopropanol (Sigma, katalognr eller Fisher Scientific, katalognr A451-1) Sterilt vatten, nukleasfritt (Applied Biosystems PCR Grade Water, katalognr AM9937 eller Thermo Scientific Molecular Biology Grade Water, katalognr SH ) Sterila serologiska engångspipetter: 5 och 25 ml Mikrotiterplatta (AD-platta) och skyddsfilm till cobas 4800-systemet (Roche P/N ) Skyddsfilmapplikator för cobas 4800 (Roche P/N ) Justerbara pipetter* (kapacitet 10 μl, 20 μl, 200 μl och μl) med DNase-fria spetsar och aerosolbarriär eller positiv förskjutning Pipette Aid (Drummond, P/N eller motsvarande) Bänkmikrocentrifug med kapacitet för x g och till x g (Eppendorf 5417C eller motsvarande)** Två (2) värmeblock med kapacitet att värma mikrocentrifugrör till 56 C och 90 C** 1,5 ml Safe-Lock-mikrocentrifugrör, sterila, RNase/DNase-fria, PCR-grad (Eppendorf, katalognr ) Nanodrop UV-Vis spektrofotometer (Thermo Scientific ND-1000 eller ND-2000)** Vortexmixer** Mikrocentrifug-rörrack Engångshandskar, puderfria Kalibrerade termometrar för värmeblock** Vattenbad** som kan hålla en temperatur på 37 C Enkeleggat skalpellblad eller liknande Frys som kan hantera förvaring i 15 C till 25 C * Pipetter ska hanteras enligt tillverkarens instruktioner och ha en noggrannhet inom 3 % av angiven volym. DNase-fria spetsar med aerosolbarriär eller positiv förskjutning ska användas när så anges för att hindra nedbrytning av prov och korskontamination. ** All utrustning ska hanteras enligt tillverkarens instruktioner Instrument och programvara Analysinstrumentet cobas z 480 Kontrollenhet till cobas 4800 SR2-systemet med Windows XP image cobas 4800 SR2 systemprogram version 2.0 eller högre Programmet KRAS Analysis Package version 1.0 eller högre Streckkodsläsare ext. USB-anslutning Skrivare SV 7 Doc Rev. 5.0

8 PROVTAGNING, TRANSPORT OCH FÖRVARING AV PROVER Hantera alla prover som potentiellt smittbärande. A. Provtagning FFPET-prover från kolorektal cancer och icke småcellig lungcancer har validerats för användning med cobas KRAS Mutation Test. B. Transport av prover FFPET-prover kan transporteras i C. Vid transport av FFPET-prover ska gällande bestämmelser för transport av etiologiska agens följas. 28 C. Förvaring av prover FFPET-prover kan förvaras i C i upp till 12 månader efter vävnadsprovtagning. Snitt på 5 μm som placeras på objektglas kan förvaras i C i upp till 60 dagar. BRUKSANVISNING Endast FFPET-snitt med 5 μm tjocklek som innehåller minst 10 % tumörandel får användas i cobas KRAS Mutation Test. Alla prover som innehåller färre än 10 % tumörandel ska makrodissekeras före avparaffinering. I instrumentmanualen till analysinstrumentet cobas z 480 finns detaljerad information om användning av analysinstrumentet z 480. Värmeblock med kapacitet att värma mikrocentrifugrör ska slås på och ställas in på 56 C och 90 C. Körningsstorlek En och samma körning kan innehålla från 1 till 45 prover (plus kontroller och kalibrator) per mikrotiterplatta med 96 brunnar. Vid körning av mer än 24 prover måste flera cobas KRAS Mutation Test-kit från samma lot användas. cobas KRAS Mutation Test innehåller reagens som räcker till totalt 8 körningar med 3 prover (plus kontroller och kalibrator), vilket ger maximalt 24 prover per kit. Arbetsgång Testprocessen med cobas KRAS Mutation Test består av manuell provpreparation med hjälp av cobas DNA Sample Preparation Kit följt av amplifiering/detektion på analysinstrumentet cobas z 480 med kitet cobas KRAS Mutation Test. Reagenspreparation 1. Lös upp proteinas K (PK) genom att tillsätta 4,5 ml sterilt, nukleasfritt (PCR-grad) vatten i flaskan med hjälp av en steril, serologisk 5 ml engångspipett. Blanda genom att vända flaskan 5 till 10 gånger. Fördela 450 μl upplöst PK i 1,5 ml Safe-Lockmikrocentrifugrör och förvara i 20 C. Om proteinas K redan har lösts upp och frusits, tina ett tillräckligt antal portioner för att bearbeta det antal prover som ska köras före avparaffinering (70 μl upplöst PK behövs till varje prov). 2. Alla lösningar som förvaras i C ska vara klara. Om det finns fällning i något reagens, värm lösningen i ett 37-gradigt vattenbad tills fällningen löses upp. Använd inte lösningen förrän all fällning har lösts upp. 3. Preparera Working DNA Wash Buffer I (WB I) genom att tillsätta 15 ml absolut etanol i flaskan med WB I. Blanda genom att vända flaskan 5 till 10 gånger. Gör en anteckning på flaskan om att etanol har tillsatts och vilket datum det gjordes. Förvara Working WB I i C. 4. Preparera Working DNA Wash Buffer II (WB II) genom att tillsätta 50 ml absolut etanol i flaskan med WB II. Blanda genom att vända flaskan 5 till 10 gånger. Gör en anteckning på flaskan om att etanol har tillsatts och vilket datum det gjordes. Förvara Working WB II i C SV 8 Doc Rev. 5.0

9 Avparaffinering av FFPET-snitt på objektglas Xylen är en farlig kemikalie. Alla steg i avparaffineringen ska utföras i ett dragskåp. Se "Varningar och försiktighetsåtgärder". A. Placera ett objektglas med ett 5 μm FFPET-snitt i en behållare med så mycket xylen att det täcker vävnaden och låt stå i 5 minuter. B. Överför objektglaset till en behållare med så mycket absolut etanol att det täcker vävnaden och låt stå i 5 minuter. C. Ta ut objektglaset från etanolen och låt snittet lufttorka så att det är helt torrt (5 till 10 minuter). D. Utför makrodissektion om provet innehåller < 10 % tumörandel. E. Märk ett 1,5 ml Safe-Lock-mikrocentrifugrör för varje prov med id-information för provet. F. Tillsätt 180 μl DNA TLB i 1,5-ml Safe-Lock-mikrocentrifugröret. G. Tillsätt 70 μl upplöst PK i Safe-Lock-röret som innehåller DNA TLB. H. Skrapa bort vävnaden från objektglaset och ned i Safe-Lock-röret. Sänk ned vävnaden i DNA TLB/PK-blandningen. I. Fortsätt med steg A i DNA-isoleringsproceduren. Avparaffinering av FFPET-snitt som inte är på objektglas Xylen är en farlig kemikalie. Alla steg i avparaffineringen ska utföras i ett dragskåp. Se "Varningar och försiktighetsåtgärder". Om mindre än 10 % av provet utgörs av tumör måste snittet läggas på objektglas och makrodissekeras och proceduren som beskrivs i "Avparaffinering av FFPET-snitt på objektglas" måste följas. A. Placera ett FFPET-snitt med 5 μm tjocklek i ett 1,5 ml Safe-Lock-mikrocentrifugrör märkt med id-information för provet. B. Tillsätt 500 μl xylen i Safe-Lock-röret med FFPET-snittet. C. Blanda väl genom att vortexa i 10 sekunder. D. Låt röret stå i 5 minuter i C. E. Tilllsätt 500 μl absolut etanol och blanda genom att vortexa i 10 sekunder. F. Låt röret stå i 5 minuter i C. G. Centrifugera vid x g till x g i 2 minuter. Ta bort supernatanten utan att röra pelleten. Kassera supernatanten som kemiskt avfall. H. Tillsätt 1 ml absolut etanol och vortexa i 10 sekunder. I. Centrifugera vid x g till x g i 2 minuter. Ta bort supernatanten utan att röra pelleten. Kassera supernatanten som kemiskt avfall. Om pelleten flyter i den återstående supernatanten, centrifugera igen i 1 minut vid x g till x g. Ta bort all återstående supernatant. J. Torka vävnadspelleten i 10 minuter i 56 C i ett värmeblock med röret öppet. Kontrollera att etanolen har avdunstat fullständigt och att pelleten är torr innan du fortsätter med nästa steg. Om det behövs kan torra pelletar förvaras upp till 24 timmar i 2 8 C. K. Resuspendera vävnadspelleten i 180 μl DNA-vävnadslyseringsbuffert (DNA TLB). L. Tillsätt 70 μl upplöst PK. M. Fortsätt med steg A i DNA-isoleringsproceduren SV 9 Doc Rev. 5.0

10 PROVPREPARATION Procedur för DNA-isolering Bearbeta en negativ kontroll samtidigt med provet/proverna. Preparera den negativa kontrollen genom att kombinera 180 μl DNA-vävnadslyseringsbuffert (DNA TLB) och 70 μl PK-lösning i ett 1,5 ml Safe-Lockmikrocentrifugrör märkt med NEG CT. Den negativa kontrollen ska bearbetas enligt samma procedur som proverna. A. Vortexa rören med provet/dna TLB/PK-blandningen och den negativa kontrollblandningen (NEG CT) i 30 sekunder. Vävnaden måste vara helt nedsänkt i DNA TLB/PK-blandningen. B. Placera rören i värmeblocket med 56 C och inkubera i 60 minuter. C. Vortexa rören i 10 sekunder. Vävnaden måste vara helt nedsänkt i DNA TLB/PK-blandningen. D. Placera rören i värmeblocket med 90 C och inkubera i 60 minuter. Under inkubering förbereds tillräckligt antal filterrör (FT) med gångjärnsförsedda lock genom att placera filterrör i ett uppsamlingsrör (CT) och märka varje FT-lock med aktuell prov- eller kontrollidentifiering. För varje prov behövs 1 FT-rör, 3 CT-rör och 1 elueringsrör (1,5 ml mikrocentrifugrör). Under inkubering ska tillräckligt antal elueringsrör (1,5 ml mikrocentrifugrör) märkas med aktuell prov- eller kontrollidentifiering. E. Låt rören svalna till C. När de har svalnat, pulscentrifugera rören för att samla upp vätska från locken. F. Tillsätt 200 μl DNA PBB i varje rör och blanda genom att pipettera upp och ned 3 gånger. G. Inkubera rören i C i 10 minuter. H. Tillsätt 100 μl isopropanol i varje rör och blanda lysatet genom att pipettera upp och ned 3 gånger. I. Överför alla lysat till respektive märkt FT/CT-enhet. J. Centrifugera FT/CT-enheterna vid x g i 1 minut. K. Placera varje FT-enhet på en ny CT-enhet. Kassera kvarvarande vätska i den gamla CT-enheten som kemiskt avfall och avfallshantera den använda CT-enheten enligt gällande föreskrifter. L. Tillsätt 500 μl Working WB I i varje FT-enhet. Preparation av Working WB I beskrivs i avsnittet "Reagenspreparation". M. Centrifugera FT/CT-enheterna vid x g i 1 minut. N. Kassera kvarvarande vätska i varje CT-enhet som kemiskt avfall. Sätt tillbaka FT-enheten i samma CT-enhet. O. Tillsätt 500 μl Working WB II i varje FT-enhet. Preparation av Working WB II beskrivs i avsnittet "Reagenspreparation". P. Centrifugera FT/CT-enheterna vid x g i 1 minut. Q. Placera varje FT-enhet på en ny CT-enhet. Kassera kvarvarande vätska i den gamla CT-enheten som kemiskt avfall och avfallshantera den använda CT-enheten enligt gällande föreskrifter. R. Centrifugera FT/CT-enheterna vid till x g i 1 minut för att torka filtermembranen. S. Placera varje FT-enhet i ett elueringsrör (1,5 ml mikrocentrifugrör) märkt med prov- eller kontrollidentifiering. Kassera kvarvarande vätska i den gamla CT-enheten som kemiskt avfall och avfallshantera den använda CT-enheten enligt gällande föreskrifter. T. Tillsätt 100 μl DNA EB i mitten av varje FT-membran utan att vidröra FT-membranet. U. Inkubera FT-enheten med elueringsröret i C i 5 minuter SV 10 Doc Rev. 5.0

11 V. Centrifugera FT-enheten med elueringsröret vid x g i 1 minut för att samla eluat i elueringsröret. Avfallshantera den använda FT-enheten enligt gällande föreskrifter. W. Stäng locket på elueringsröret. Elueringsröret innehåller DNA-stamlösningen. Fortsätt med steg A i avsnittet DNA-kvantifiering. Mätning av DNA-koncentration ska utföras omedelbart efter DNA-isoleringsproceduren och innan förvaring. DNA-kvantifiering: A. Blanda varje DNA-stamlösning genom att vortexa i 5 sekunder. B. Kvantifiera DNA med en Nanodrop UV-Vis spektrofotometer (ND-1000 eller ND-2000) enligt tillverkarens instruktioner. Använd DNA EB som blankprov för instrumentet. Ett genomsnitt av två konsekventa avläsningar behövs. De två mätningarna ska ligga inom ±10 % av varandra när avläsningarna av DNA-koncentrationen är 20,0 ng/μl. Vid DNA-koncentrationsavläsningar < 20,0 ng/μl ska de två mätningarna ligga inom ± 2 ng/μl. Om de två mätningarna inte ligger inom ± 10 % av varandra när den avlästa DNA-koncentrationen är 20,0 ng/μl eller inom ± 2 ng/μl när avläsningarna av DNA-koncentrationen är < 20,0 ng/μl måste två ytterligare avläsningar utföras tills kraven har uppfyllts. Medelvärdet av de två nya mätningarna ska sedan beräknas. DNA-stamlösningen från den bearbetade negativa kontrollen (NEG CT) behöver inte mätas. C. Koncentrationen på DNA-stamlösningen från proverna måste vara 4 ng/μl för att kunna utföra cobas KRAS Mutation Test. Två amplifieringar/detektioner körs per prov, där 25 μl av en spädning av DNA-stamlösning till 2 ng/μl (totalt 50 ng DNA) används för varje amplifiering/detektion. Varje DNA-stamlösning måste ha en minimikoncentration på 4 ng/μl för att kunna utföra cobas KRAS Mutation Test. Om koncentrationen av en DNA-stamlösning är < 4 ng/μl ska avparaffinering, DNA-isolering och DNAkvantifiering upprepas för det provet med två FFPET-snitt på 5 μm. För prover på objektglas: Avparaffinera och lägg vävnad från båda snitten tillsammans i ett rör, sänk ned vävnaden i DNA TLB + PK och utför sedan DNA-isolering och -kvantifiering enligt beskrivningen ovan. För prover som inte är på objektglas: Lägg båda snitten tillsammans i ett rör och sänk ned vävnaden i DNA TLB + PK. Utför sedan DNA-isolering och -kvantifiering enligt beskrivningen ovan. Om DNA-stamlösningen fortfarande är < 4 ng/μl måste ett nytt FFPET-prov beställas. Bearbetade prover (extraherat DNA) är hållbara i upp till 24 timmar i 15 C till 30 C eller upp till 14 dagar i 2 C till 8 C eller upp till 60 dagar i 15 C till 25 C eller när de har genomgått 3 frys-tiningscykler vid förvaring i 15 C till 25 C. Extraherat DNA ska amplifieras inom den rekommenderade förvaringstiden, dock före utgångsdatum för det cobas DNA Sample Preparation Kit som användes för att extrahera DNA. AMPLIFIERING OCH DETEKTION För att undvika kontamination av Working MMX med DNA-prover ska amplifiering och detektion utföras i ett område som är separerat från DNA-isolering. Arbetsområdet för amplifiering och detektion ska rengöras ordentligt innan preparation av Working MMX. En korrekt rengöring innebär att alla rack och pipetter torkas av ordentligt med en lösning med 0,5 % natriumhypoklorit och därefter torkas av med en lösning med 70 % etanol. Vanliga hushållsblekmedel innehåller normalt 5,25 % natriumhypoklorit. En utspädning 1:10 med hushållsblekmedel ger en lösning med 0,5 % natriumhypoklorit. Förberedelse av instrumentet: Detaljerad information om förberedelse av cobas z 480 finns i instrumenthandboken till analysinstrumentet cobas z 480. Förberedelse av testprocedur: Detaljerad information om stegen i KRAS-arbetsflödet finns i användarhandboken till cobas 4800-systemet för cobas KRAS Mutation Test (användarhandboken till cobas KRAS). Beräkning av spädning av DNA-stamlösning från prov: Beräkning av spädning av DNA-stamlösningar vid koncentrationer från 4 ng/μl till 28 ng/μl DNA-stamlösningar från prover ska spädas omedelbart innan amplifiering och detektion. Två (2) amplifieringar/detektioner körs för varje prov, vilket kräver en total volym av 50 μl (25 μl vardera för kodon 12/13 och kodon 61) av en spädning av DNA-stamlösningen till 2 ng/μl (totalt 100 ng DNA). A. För varje prov, beräkna volymen (μl) DNA-stamlösning som behövs: μl DNA-stam = (70 μl x 2 ng/μl) DNA-stamlösningens koncentration [ng/μl] B. Beräkna volymen (μl) DNA-spädningsbuffert (DNA SD) som behövs: μl DNA SD = 70 μl μl DNA-stamlösning SV 11 Doc Rev. 5.0

12 Exempel: DNA-stamlösningskoncentration = 6,5 ng/μl A. μl DNA-stamlösning = (70 μl x 2 ng/μl) 6,5 ng/μl = 21,5 μl B. μl DNA SD = (70 μl 21,5 μl) = 48,5 μl Beräkning av spädning av DNA-stamlösningar vid koncentrationer > 28 ng/μl DNA-stamlösningar från prover ska spädas omedelbart innan amplifiering och detektion. Två (2) amplifieringar/detektioner körs för varje prov, vilket kräver en total volym av 50 μl (25 μl vardera för kodon 12/13 och kodon 61) av en spädning av DNA-stamlösningen till 2 ng/μl (totalt 100 ng DNA). A. Vid DNA-stamlösningskoncentrationer > 28 ng/μl ska följande formel användas för att beräkna den mängd DNA-spädningsbuffert (DNA SD) som behövs för att preparera minst 70 μl spädd DNA-stamlösning. Det är för att säkerställa att minst 5 μl DNAstamlösning används i varje prov. B. För varje prov, beräkna volymen (μl) DNA SD som behövs för att späda 5 μl DNA-stamlösning till 2 ng/μl: Volymen DNA SD som behövs i μl = [(5 μl DNA-stamlösning x DNA-stamlösningskoncentration i ng/μl) / 2 ng/μl] 5 μl Exempel: DNA-stamlösningskoncentration = 31,7 ng/μl A. Volymen DNA SD som behövs i μl = [(5 μl x 31,7 ng/μl) / 2 ng/μl] 5 μl = 74,3 μl B. Använd den beräknade volymen DNA SD för att späda 5 μl DNA-stamlösning. Spädning av prov Ta ut spädningsbufferten (DNA SD) från förvaringen i 15 C till 25 C och låt tina i 15 C till 30 C i minst 1 timme innan DNA-spädning. Vortexa varje reagens i 5 sekunder och samla upp vätska i botten av röret innan användning. A. Förbered det antal 1,5 ml Safe-Lock-mikrocentrifugrör för DNA-spädningar som behövs genom att märka dem med aktuell providentifiering. B. Använd en pipett med aerosolresistent pipettspets och pipettera de beräknade volymerna DNA SD i rören med motsvarande märkning. Pipettera 35 μl DNA SD i ett Safe-Lock-rör märkt med NEG CT. C. Vortexa varje DNA-stamlösning och den negativa kontrollen i 5 till 10 sekunder. D. Använd en pipett med aerosolresistent pipettspets (ny spets för varje pipettering) och pipettera försiktigt den beräknade volymen av varje DNA-stamlösning i motsvarande rör med DNA SD. Pipettera 35 μl negativ kontroll (extraherat eluat) i NEG CT-röret. E. Förslut rören och vortexa varje rör i 5 till 10 sekunder. F. Byt handskar. Preparation av Working Master Mix (MMX 12/13 och MMX 61) KRAS 12/13 OM, KRAS 61 OM och Working MMX är ljuskänsliga och måste skyddas mot långvarig exponering för ljus. På grund av viskositeten hos KRAS MIX och Working MMX måste pipetteringen utföras långsamt för att säkerställa att all vätska trycks ut fullständigt från pipettspetsen. KRAS MIX, KRAS 12/13 OM och KRAS 61 OM kan ha ett klart till gulaktigt utseende. Detta påverkar inte övriga egenskaper hos reagenset. Blanda två Working MMX, en som innehåller KRAS 12/13 OM och en som innehåller KRAS 61 OM i separata 1,5 ml Safe- Lock-mikrocentrifugrör. A. Beräkna volymen KRAS MIX som behövs för varje Working MMX med hjälp av följande formel: Volymen KRAS MIX som behövs = (antal prover + 2 kontroller + 1 kalibrator + 1) x 10 μl B. Beräkna volymen KRAS 12/13 OM eller KRAS 61 OM som behövs för varje Working MMX med hjälp av följande formel: Volymen KRAS 12/13 OM eller KRAS 61 OM som behövs = (antal prover + 2 kontroller + 1 kalibrator + 1) x 10 μl SV 12 Doc Rev. 5.0

13 C. Beräkna volymen MGAC som behövs för varje Working MMX med hjälp av följande formel: Volymen MGAC som behövs = (antal prover + 2 kontroller + 1 kalibrator + 1) x 6 μl Använd tabell 1 för att bestämma volymen för varje reagens som behövs för preparation av Working MMX baserat på antalet prover som ingår i körningen. Tabell 1 Volym reagens som behövs för Working MMX 12/13 och Working MMX 61 Volym reagens som behövs för Working MMX Antal prover* KRAS MIX 10 µl KRAS 12/13 OM eller KRAS 61 OM 10 µl MGAC 6 µl Total volym (µl) *Inkluderar tillräckliga volymer för 1 rör per prov, 2 kontrollrör, 1 kalibratorrör samt 1 extra rör D. Ta fram det antal rör som behövs av KRAS MIX, KRAS 12/13 OM, KRAS 61 OM och MGAC från förvaringen i 15 C till 25 C. Låt alla reagens tina i 15 C till 30 C i minst 1 timme innan användning. Vortexa varje reagens i 5 sekunder och samla upp vätska i botten av röret innan användning. Märk ett sterilt mikrocentrifugrör för Working MMX 12/13 och ett för Working MMX 61. Working MMX måste prepareras inom 1 timme efter att reagensen har tinats. Efter att reagensen har tinats ska oanvända reagens återföras till förvaring i 15 C till 25 C inom 1 timme efter användning. E. Tillsätt den beräknade volymen KRAS MIX i Working MMX-rören. F. Tillsätt den beräknade volymen KRAS 12/13 OM eller KRAS 61 OM i respektive Working MMX-rör. G. Tillsätt den beräknade volymen MGAC i Working MMX-rören. H. Vortexa rören i 3 till 5 sekunder så att innehållet blandas ordentligt. Prover, kontroller och kalibrator ska tillsättas till mikrotiterplattan (AD-platta) inom 1 timme efter preparation av Working MMX. Använd endast mikrotiterplatta (AD-platta) och skyddsfilm till cobas 4800-systemet (Roche P/N Bild 1 Layout för provplatta Layout för provplatta A B C D E F G H KRAS MC 12/13 NEG CTL 12/13 KRAS CAL 12/13 KRAS MC Prov 6 Prov 6 Prov 14 Prov 14 Prov 22 Prov / / /13 61 NEG CTL Prov 7 Prov 7 Prov 15 Prov 15 Prov 23 Prov / / /13 61 KRAS CAL Prov 8 Prov 8 Prov 16 Prov 16 Prov 24 Prov / / /13 61 Prov 1 Prov 1 Prov 9 Prov 9 Prov 17 Prov 17 12/ / /13 61 Prov 2 Prov 2 Prov 10 Prov 10 Prov 18 Prov 18 12/ / /13 61 Prov 3 Prov 3 Prov 11 Prov 11 Prov 19 Prov 19 12/ / /13 61 Prov 4 Prov 4 Prov 12 Prov 12 Prov 20 Prov 20 12/ / /13 61 Prov 5 Prov 5 Prov 13 Prov 13 Prov 21 Prov 21 12/ / / SV 13 Doc Rev. 5.0

14 A. Pipettera 25 μl Working-MMX i varje reaktionsbrunn på mikrotiterplattan (AD-platta) som behövs för körningen. Se till att pipettspetsen inte vidrör plattan utanför brunnen. Tillsätt Working MMX 12/13 (som innehåller KRAS 12/13 OM) i brunnarna på mikrotiterplattan (AD-platta) i kolumnerna med udda nummer (1, 3, 5 etc.) Tillsätt Working MMX 61 (som innehåller KRAS 61 OM) i brunnarna på mikrotiterplattan (AD-platta) i kolumnerna med jämna nummer (2, 4, 6 etc.) B. Pipettera 25 μl KRAS MC i brunnarna A1 och A2 på mikrotiterplattan (AD-platta). Blanda innehållet i brunnen noga genom att pipettera upp och ned minst två gånger. C. Använd en ny pipettspets och pipettera 25 μl NEG CT i brunnarna B1 och B2 på mikrotiterplattan (AD-platta). Blanda innehållet i brunnen noga genom att pipettera upp och ned minst två gånger. D. Använd en ny pipettspets och pipettera 25 μl KRAS CAL i brunnarna C1 och C2 på mikrotiterplattan (AD-platta). Blanda innehållet i brunnen noga genom att pipettera upp och ned minst två gånger. Varje körning måste innehålla positiv kontroll (KRAS MC) i brunnarna A1 och A2, negativ kontroll (NEG CT) i brunnarna B1 och B2 samt kalibrator (KRAS CAL) i brunnarna C1 och C2, annars ogiltigförklaras körningen. Byt handskar för att motverka kontamination mellan prover och utvändig kontamination av PCR-plattan. E. Använd nya pipettspetsar för varje spätt prov-dna, tillsätt 25 μl av det första provet i brunnarna D1 och D2 på mikrotiterplattan (AD-platta). Blanda innehållet i brunnen noga genom att pipettera upp och ned minst två gånger. Upprepa proceduren för det spädda DNA:t från det andra provet (brunnarna E1 och E2). Följ mallen i bild 1 tills alla provers DNA-spädningar är laddade på mikrotiterplattan (AD-platta). Kontrollera att all vätska är samlad i botten av varje brunn. F. Täck mikrotiterplattan (AD-platta) med skyddsfilm (medföljer plattorna). Använd skyddsfilmapplikatorn för att försluta filmen noga mot mikrotiterplattan (AD-platta). G. Bekräfta att all vätska är uppsamlad i botten av varje brunn innan PCR-körningen. Amplifiering och detektion ska påbörjas inom 1 timme efter tillsats av den första prov-dna-spädningen i Working MMX. Starta PCR-körning Detaljerad information om stegen i KRAS-arbetsflödet finns i användarhandboken till cobas KRAS. TOLKNING AV RESULTAT All körnings- och provvalidering utförs av programmet cobas En giltig testkörning kan innehålla både giltiga och ogiltiga provresultat. Om körningen är giltig tolkas provresultaten enligt tabell 2. Tabell 2 Tolkning av resultat med cobas KRAS Mutation Test Testresultat Mutationsresultat Betydelse Mutation Detected Kodon 12/13 eller kodon 61 (båda kan förekomma) Mutation Not Detected eller No Mutation Detected* Mutation detekterad i KRAS kodon 12/13 eller 61 eller båda. N/A Mutation inte detekterad i KRAS kodon 12/13 eller 61. Invalid N/A Provresultatet är ogiltigt. Upprepa testning av prover med ogiltiga resultat enligt instruktionerna i avsnittet Omtestning av prover med ogiltiga resultat nedan. Failed N/A Misslyckad körning på grund av fel på maskin- eller programvara. Kontakta din Roche-representant och begär teknisk hjälp. * Resultatet "Mutation Not Detected" eller "No Mutation Detected" utesluter inte förekomst av en mutation i KRAS kodon 12/13 eller 61 eftersom resultaten beror på procentandelen mutantsekvenser, provets renhet, avsaknad av hämmare och tillräckligt med DNA SV 14 Doc Rev. 5.0

15 Omtestning av prover med ogiltiga resultat A. Upprepa spädningen av den ogiltiga prov-dna-stamlösningen med början från procedurerna Beräkning av spädning av DNAstamlösning från prov och Spädning av prov i avsnittet AMPLIFIERING OCH DETEKTION. B. Efter spädning av DNA-stamlösning till 2 ng/μl som beskrivs i Spädning av prov, fortsätt med Preparation av Working Master Mix (MMX 12/13 och MMX 61) och resten av amplifierings- och detektionsproceduren. Om provet är ogiltigt efter omtestning eller om det inte fanns tillräckligt med DNA-stamlösning för att preparera en annan spädning i steg A, "Omtestning av prover med ogiltiga resultat", upprepa hela testproceduren för det provet och börja med avparaffinering och DNA-isolering med ett nytt FFPET-snitt på 5 μm. KVALITETSKONTROLL Ett set cobas KRAS Test mutationskontroll (KRAS MC), negativ kontroll (NEG CT) och KRAS-kalibrator (KRAS CAL) för Working MMX 12/13 och Working MMX 61 ingår i varje körning. En körning är giltig om KRAS-mutationskontrollbrunnarna (KRAS MC) (A1 och A2), de negativa kontrollbrunnarna (NEG CT) (B1 och B2) och KRAS-kalibratorbrunnarna (KRAS CAL) (C1 och C2) är giltiga. Om KRAS-mutationskontrollen (KRAS MC), den negativa kontrollen (NEG CT) eller KRAS-kalibratorn (KRAS CAL) för Working MMX 12/13 eller Working MMX 61 är ogiltiga är hela körningen ogiltig och måste upprepas. Preparera en ny spädning av den tidigare isolerade DNA-stamlösningen från prov för att förbereda en ny mikrotiterplatta (AD-platta) med kontroller för amplifiering och detektion. Positiv kontroll Resultatet för KRAS-mutationskontrollen (KRAS MC) måste vara "Valid" för både Working MMX 12/13 och Working MMX 61. Om resultaten för KRAS MC är konsekvent ogiltiga, kontakta din Roche-representant och begär teknisk hjälp. Negativ kontroll Resultatet för den negativa kontrollen (NEG CT) måste vara "Valid" för både Working MMX 12/13 och Working MMX 61. Om resultaten för NEG CT är konsekvent ogiltiga, kontakta din Roche-representant och begär teknisk hjälp. Kalibrator Resultatet för KRAS-kalibratorn (KRAS CAL) måste vara "Valid" för både Working MMX 12/13 och Working MMX 61. Om resultaten för KRAS CAL är konsekvent ogiltiga, kontakta din Roche-representant och begär teknisk hjälp. FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER Liksom för alla testmetoder är det mycket viktigt att använda god laboratorieteknik för att denna analys ska fungera korrekt. Med hänsyn till testets höga analytiska känslighet är det viktigt att arbeta på ett sådant sätt att reagens- och amplifieringsblandningarna hålls fria från kontamination. TESTETS BEGRÄNSNINGAR 1. Testa endast de angivna provtyperna. cobas KRAS Mutation Test har endast validerats för att användas med FFPET-prover från kolorektal cancer och icke småcellig lungcancer. 2. cobas KRAS Mutation Test har endast validerats med användning av cobas DNA Sample Preparation Kit (Roche P/N: ). 3. Detektion av en mutation är beroende av antalet kopior i provet och kan påverkas av provets renhet, mängden isolerat DNA och förekomst av interfererande substanser. 4. Resultatens tillförlitlighet förutsätter rätt fixering, transport, förvaring och bearbetning av prover. Följ beskrivningarna i denna bipacksedel och i användarhandboken till cobas KRAS. 5. Tillsats av AmpErase-enzym i cobas KRAS Mutation Test Master Mix möjliggör selektiv amplifiering av målsekvensen. Kontamination av reagens kan dock endast undvikas om goda laboratorierutiner tillämpas och de förfaranden som beskrivs i den här bipacksedeln noga följs. 6. Endast personal med erfarenhet av PCR-teknik ska använda produkten och cobas 4800-systemet. 7. Endast analysinstrumentet cobas z 480 har validerats för användning med denna produkt. Ingen annan termocykler med optisk realtidsdetektion kan användas med den här produkten SV 15 Doc Rev. 5.0

16 8. På grund av inneboende skillnader mellan metoder rekommenderas användaren, innan en metod byts ut mot en annan, att genomföra metodkorrelationsanalyser i laboratoriet för att bestämma skillnaderna mellan metoderna. 9. Effekterna av andra möjliga variabler, t.ex. vid fixering av prover, har inte utvärderats. 10. Mutationer i området i KRAS-genen som täcks av cobas KRAS Mutation Tests primers och/eller prober är visserligen sällsynta, men kan göra att det inte går att detektera förekomst av en mutation. 11. Närvaron av PCR-hämmare kan orsaka falskt negativa eller ogiltiga resultat. 12. I sällsynta fall (< 0,2 % 29 ) visar cobas KRAS Mutation Test resultatet "Mutation Not Detected" för vissa komplexa och multipla mutationer i kodon 12/13 och kodon 61, och begränsad korsreaktivitet (resultat för "Mutation Detected") för mutationer som omger kodon 12/13 i exon 2 och kodon 61 i exon cobas KRAS Mutation Test har verifierats för användning med 50 ng DNA per reaktionsbrunn. DNA-inputmängder lägre än 50 ng per reaktionsbrunn rekommenderas inte. 14. Proceduren som beskrivs ovan måste följas för att kunna detektera 5-procentiga mutantsekvenser i en bakgrund av vildtyp-dna för KRAS-mutationerna 29 i tabell 3. Tabell 3 Mutationer som detekteras av cobas KRAS Mutation Test Mutation AS-förändring COSMIC-id c.34g>t 12C 516 c.34g>a 12S 517 c.34g>c 12R* 518 c.35g>t 12V 520 c.35g>a 12D 521 c.35g>c 12A 522 c.37g>t 13C 527 c.37g>a 13S 528 c.37g>c 13R* 529 c.38g>a 13D 532 c.38g>c 13A 533 c.38g>t 13V 534 c.181c>a 61K* 549 c.181c>g 61E 550 c.182a>c 61P 551 c.182a>g 61R 552 c.182a>t 61L 553 c.183a>c 61H (CAC) 554 c.183a>t 61H (CAT) 555 *Inte testad för NSCLC FFPET-prover Fetstil = testad för plasmider SV 16 Doc Rev. 5.0

17 ICKE-KLINISK PRESTANDAUTVÄRDERING Icke-klinisk egenskapsutvärdering för vävnad från kolorektal cancer Analytisk känslighet Den analytiska känsligheten hos cobas KRAS Mutation Test bedömdes med spädningspaneler som preparerats från fyra typer av prover: Cellinjeblandning som preparerats genom att blanda DNA-stamlösningar som erhållits från en KRAS-mutant-cellinje och en KRAS-vildtyp-cellinje. Plasmidblandningar som preparerats genom att blanda en plasmid innehållande KRAS-mutationen och DNA-stamlösningar som erhållits från en KRAS-vildtyp-cellinje. Provblandningar som preparerats genom att blanda DNA-stamlösningar som erhållits från KRAS-mutant-FFPET-prover och KRAS-vildtyp-FFPET-prover. DNA-stamlösning som extraherats från ett enskilt FFPET-prov. Alla prover som användes i den här studien sekvenserades med 454-sekvensering (454 Genome Sequencer FLX Titanium) för att bestämma procentandelen mutation i varje prov. Analytisk känslighet för cobas KRAS Mutation Test med cellinje eller plasmidblandningar DNA från kolorektala cellinjer innehållande KRAS-mutation i exon 2 kodon 12 eller 13 extraherades och blandades med DNA-extrakt från en KRAS-vildtyp-cellinje för att få ett prov med ~5 % mutation, verifierat med 454-sekvensering. Tre separata spädningspaneler innehöll följande spädningar (50,0, 25,0, 12,5, 6,3, 3,1, 1,6, 0,8 och 0,4 ng/25 μl). 24 replikat av varje panelprov testades med vardera 3 cobas KRAS Mutation Test-kitloter (72 replikat totalt). Känsligheten bestämdes till den lägsta mängd DNA som gav ett KRAS "Mutation Detected"-värde på minst 95 %, vilket visas i tabell 4. KRAS-mutation Kodon 12 (exon 2) Kodon 13 (exon 2) Kodon 61 (exon 3) Tabell 4 Känslighet för cobas KRAS Mutation Test med CSC-cellinje eller plasmidblandningar Provtyp Procentandel mutation* Mängden DNA i panelprovet (ng/25 μl) för att uppnå en sannolikhet för "Mutation Detected" på 95 % (N=72 replikat) Cellinjeblandning 5,3 % 0,8 Cellinjeblandning 4,9 % 1,6 Plasmidblandning 5,8 % 6,3 * Genomsnittlig procentandel mutation med 454-sekvensering Testet gav ett "Mutation Detected"-värde på 95 % vid 0,8 ng/25 μl, 1,6 ng/25 μl och 6,3 ng/25 μl (spädningar på 1:64, 1:32 och 1:8 av rekommenderad DNA-input på 50 ng/25 μl) för respektive KRAS-mutation i kodon 12, 13 och 61. Detta indikerar att testet detekterar KRAS-mutationer när ~87 % av DNA:t är degraderat eller icke amplifierbart på grund av fixeringsprocessen, om man antar att cellinjeoch plasmid-dna-blandningarna innehöll 100 % intakt och amplifierbart DNA. Analytisk känslighet med FFPET-prov och -provblandningar KRAS-muterade FFPET-prov-DNA-extrakt i kodon 12, 13 och 61 blandades med KRAS-vildtyp-FFPET-provextrakt för att få prover med mutationsnivå på ~5 %. Ett naturligt förekommande prov användes för att testa KRAS-mutationen i kodon 12. De slutliga mutationsnivåerna för alla prover verifierades med 454-sekvensering. Alla prover/provblandningar späddes för att producera panelproverna (50,0, 25,0, 12,5, 6,3, 3,1, 1,6, 0,8 och 0,4 ng/25 μl). Panelprovet 50 ng/25 μl testades inte för blandning #2 för exon 3, kodon 61. Åtta (8) replikat av varje panelprov kördes med vardera 3 cobas KRAS Mutation Test-kitloter (n=24/panelprov). Känsligheten för varje prov bestämdes av den lägsta mängd DNA som gav ett KRAS "Mutation Detected"-värde på minst 95 %, vilket visas i tabell SV 17 Doc Rev. 5.0

18 KRAS-mutation Kodon 12 (exon 2) Kodon 13 (exon 2) Kodon 61 (exon 3) Tabell 5 Känslighet för cobas KRAS Mutation Test med CRC-prov och provblandningar Provtyp Procentandel mutation Mängden DNA i panelprovet (ng/25 μl) för att uppnå en sannolikhet för "Mutation Detected" på 95 % (N=24 replikat) FFPET-prov 4,3 % 3,1 FFPET-blandning 4,2 % 3,1 FFPET-blandning 4,7 % 3,1 FFPET-blandning 5,0 % 3,1 FFPET-blandning 4,6 % 1,6 FFPET-blandning 7,2 % 1,6 FFPET-blandning 4,4 % 3,1 FFPET-blandning 5,5 % 3,1 FFPET-blandning 3,8 % 6,3 Denna studie visar att cobas KRAS Mutation Test kan detektera KRAS-mutationer i kodon 12, 13 och 61 med en mutationsnivå på ~5 % med standard-input på 50 ng/25 μl. Testets förmåga att detektera mutation vid lägre DNA-input-nivåer visar att proverna kan innehålla degraderat eller icke amplifierbart DNA från fixeringsprocessen och mutationen ändå detekteras. Korrelation till referensmetod 188 FFPET-prover från kolorektal cancer testades med de 2 cobas KRAS Mutation Test-kitloterna. Jämförelsetester med 2X bidirektionell Sanger-sekvensering utfördes på alla prover. Avvikande resultat mellan cobas KRAS Mutation Test och 2X bidirektionell Sanger-sekvensering kontrollerades med hjälp av 454-sekvensering. Resultat för cobas KRAS Mutation Test och 2X bidirektionell Sanger-sekvensering Provinformation och -resultat för 2X bidirektionell Sanger-sekvensering för de 188 proverna sammanfattas i tabell av de 188 proverna hade KRAS-mutation i kodon 12/13 och 7 hade KRAS-mutation i kodon 61, medan 107 av proverna var antingen KRASvildtyp eller hade KRAS-mutation i annat kodon än 12/13 med Sanger-sekvensering och 181 prover var antingen KRAS-vildtyp eller hade KRAS-mutation i annat kodon än 61. Tabell 6 Tumörstadium jämfört med Sanger-sekvensering Resultat från 2X bidirektionell Sanger-sekvensering Tumörstadium kodon 12 kodon 13 kodon 61 vildtyp Totalt % av totalt Stadium I ,8 % Stadium II ,4 % Stadium III ,0 % Stadium IV 17* 3* ,8 % Okänt stadium ,1 % Totalt ,0 % * Ett av de 81 muterade proverna i kodon 12/13 innehöll mutationer i både kodon 12 och kodon SV 18 Doc Rev. 5.0

19 Resultat som erhölls vid testning av 188 tumörprover från kolorektal cancer med två loter av cobas KRAS Mutation Test jämfört med resultat som erhölls med 2X bidirektionell Sanger-sekvensering för KRAS-mutationer i exon 2, kodon 12/13 och mutationer i exon 3, kodon 61 visas i tabell 7 och 8. Tabell 7 cobas KRAS Mutation Test, lot 1 jämfört med 2X bidirektionell Sanger-sekvensering 2X bidirektionell Sanger-sekvensering cobas KRAS lot 1 MT kodon 12/13 MT kodon 61 WT Totalt MT kodon 12/ MT kodon Positiv överensstämmelse = 96,6% (95 % CI = 90,3 till 98,8%) Negativ överensstämmelse = 93,0 % (95 % CI = 86,3 till 96,6 %) Total överensstämmelse = 94,7 % (95 % CI = 90,4 till 97,1 %) MT: mutant WT: vildtyp *Ett prov testades inte med lot 1. WT Totalt * Tabell 8 cobas KRAS Mutation Test, lot 2 jämfört med 2X bidirektionell Sanger-sekvensering 2X bidirektionell Sanger-sekvensering cobas KRAS lot 2 MT kodon 12/13 MT kodon 61 WT Totalt MT kodon 12/ MT kodon Positiv överensstämmelse = 96,6% (95 % CI = 90,5 till 98,8%) Negativ överensstämmelse = 93,0 % (95 % CI = 86,3 till 96,6 %) Total överensstämmelse = 94,7 % (95 % CI = 90,5 till 97,1 %) MT: mutant WT: vildtyp WT Totalt Total överensstämmelse för cobas KRAS Mutation Test jämfört med 2X bidirektionell Sanger-sekvensering för KRAS-mutationer i kodon 12/13 och kodon 61 var 94,7 % (totalt 10 avvikande resultat för varje lot) för båda loterna cobas KRAS Mutation Test-reagenser SV 19 Doc Rev. 5.0

20 Testning av avvikande resultat med 454-sekvensering Avvikande resultat mellan cobas KRAS Mutation Test jämfört med 2X bidirektionell Sanger-sekvensering för lot 1 och lot 2 åtgärdades med hjälp av 454-sekvensering och visas i tabell 9 respektive 10. Tabell 9 cobas KRAS Mutation Test, lot 1 jämfört med 2X bidirektionell Sanger-sekvensering åtgärdad med 454-sekvensering 2X bidirektionell Sanger-sekvensering, åtgärdad med 454-sekvensering MT kodon 12/13 MT kodon 61 WT Totalt MT kodon 12/ cobas KRAS lot 1 MT kodon Positiv överensstämmelse = 100,0 % (95 % CI = 95,9 till 100,0 %) Negativ överensstämmelse = 99,0 % (95 % CI = 94,4 till 99,8 %) Total överensstämmelse = 99,5 % (95 % CI = 97,0 till 99,9 %) MT: mutant WT: vildtyp *Ett prov testades inte med lot 1. WT Totalt * Tabell 10 cobas KRAS Mutation Test, lot 2 jämfört med 2X bidirektionell Sanger-sekvensering 2X bidirektionell Sanger-sekvensering, åtgärdad med 454-sekvensering MT kodon 12/13 MT kodon 61 WT Totalt MT kodon 12/ cobas KRAS lot 2 MT kodon Positiv överensstämmelse = 100,0 % (95 % CI = 95,9 till 100,0 %) Negativ överensstämmelse = 99,0 % (95 % CI = 94,4 till 99,8 %) Total överensstämmelse = 99,5 % (95 % CI = 97,0 till 99,9 %) MT: mutant WT: vildtyp WT Totalt Efter att avvikande resultat mellan cobas KRAS Mutation Test och 2X bidirektionell Sanger-sekvensering hade åtgärdats med 454- sekvensering hade den totala överensstämmelsen förbättrats till 99,5 % för både den första och den andra loten cobas KRAS Mutation Test-reagenser. Specificitet Specificiteten för cobas KRAS Mutation Test bestämdes genom testning av 188 FFPET-prover från kolorektal cancer i samband med en referensmetodkorrelationsstudie. Sanger-sekvensering Specificiteten för cobas KRAS Mutation Test beräknades genom bestämning av procentandelen FFPET-prover som identifierats som KRAS-vildtyp med 2X bidirektionell Sanger-sekvensering och korrekt identifierats som KRAS-vildtyp med cobas KRAS Mutation Test (procentandel negativ överensstämmelse). Specificiteten (procentandel negativ överensstämmelse) som erhölls när de 188 tumörproverna testades för KRAS-mutationer i kodon 12/13 och kodon 61 med cobas KRAS Mutation Test jämfört med resultat som erhölls med 2X bidirektionell Sanger-sekvensering var 93,0 % (tabell 6 och 7) för både den första och den andra loten cobas KRAS Mutation Test-reagenser. Testning av avvikande resultat med 454-sekvensering Specificiteten förbättrades till 99,0 % för både den första och den andra loten (tabell 8 och 9) cobas KRAS Mutation Test-reagenser när 454-sekvensering använts för att åtgärda avvikande resultat mellan cobas KRAS Mutation Test och 2X bidirektionell DNA-Sangersekvensering vid testning för KRAS-mutationer i kodon 12/13 och kodon 61. Den förbättrade specificiteten hos cobas KRAS Mutation Test efter bestämning med 454-sekvensering beror främst på förmågan hos 454-sekvensering att detektera KRAS-mutationer som undgåtts vid Sanger-sekvenseringen, på grund av den lägre känsligheten hos Sanger-sekvensering jämfört med 454-sekvensering SV 20 Doc Rev. 5.0