Identifiering av Candida, Cryptococcus och andra medicinskt viktiga jästsvampar

Identifiering av Candida, Cryptococcus och andra medicinskt viktiga jästsvampar Erja Chryssanthou, 061003 Karolinska Universitetssjukhuset ALLMÄNT Jästkarakteristika Jästsvampar är encelliga, eukaryota knoppande celler. De är vanligen runda, ovala eller mer sällan avlånga. Jästsvampar förökar sig genom knoppning och bildar så kallade blastosporer. När en jästsvamp förlängs genom knoppning, utan att blastosporer separeras, bildas en pseudohyf som saknar septa. Under särskilda växtförhållanden såsom vid växt i brist på syrgas t.ex. i vävnad, i en koloni under agarytan eller i botten på buljongrör, kan vissa jästsvampar inkl. Candida albicans bilda äkta septerade hyfer. Vissa jästsvampar, framförallt C. albicans och C. dubliniensis, kan bilda klamydosporer, vilka uppträder i änden av en pseudohyf som stora, runda, strakt ljusbrytande celler (Tabell 1). Till konsistensen är jäskolonier antingen krämiga, glänsande, släta, skrynkliga eller membranösa. Kryptokocker bildar kapsel som gör kolonierna mukoida. Kolonierna kan vara vita, krämfärgade, hyalina eller rosa-orange-röda (t.ex. Rhodotorula-arter). SMITTÄMNET Taxonomi Medicinskt viktiga jästsvampar tillhör tre klasser: Endomycetes, Heterobasidiomycetes och Blastomycetes (syn. Deuteromycota, tidigare Fungi imperfecti). Den mykologiska taxonomin orsakar ibland en viss förvirring för laboratoriepersonal eftersom många jästsvampar, som ursprungligen klassificerats som asexuella (imperfect) jästsvampar, har senare visats kunna genomgå sexuell förökning. Den asexuella (anamorf) och sexuella formen (teleomorf) har ofta olika släkt- och artnamn. Enligt dagens taxonomiska uppfattning ska namnet på den sexuella formen användas. Namnbyte kan dock medföra problem för kliniker och därför bör i förekommande fall det gamla namnet (av den asexuella formen) läggas till t.ex. Issatchenkia orientalis (syn. Candida krusei). 1

RAM Identifiering av medicinskt viktiga jästsvampar Artrospor = Artrokonidium Klamydospor Kantiga sporer som har fallit från en hyf Svullen, tjockväggig, vilande cell Pseudohyf Hyf En kedja av sammanhängande knoppande jästceller Septerad, trådliknande svampstruktur Blastospor = Blastokonidium Knoppande jästcell Tabell 1. Olika svampstrukturer 2

SMITTÄMNET Taxonomi Medicinskt viktiga jästsvampar tillhör tre klasser: Endomycetes, Heterobasidiomycetes och Blastomycetes (syn. Deuteromycota, tidigare Fungi imperfecti). Den mykologiska taxonomin orsakar ibland en viss förvirring för laboratoriepersonal eftersom många jästsvampar, som ursprungligen klassificerats som asexuella (imperfect) jästsvampar, har senare visats kunna genomgå sexuell förökning. Den asexuella (anamorf) och sexuella formen (teleomorf) har ofta olika släkt- och artnamn. Enligt dagens taxonomiska uppfattning ska namnet på den sexuella formen användas. Namnbyte kan dock medföra problem för kliniker och därför bör i förekommande fall det gamla namnet (av den asexuella formen) läggas till t.ex. Issatchenkia orientalis (syn. Candida krusei). Medicinskt viktiga jästsvampar Candida Släktet Candida tillhör familjen Cryptococcaceae inom Deuteromycota och omfattar ca 200 arter varav minst 17 betraktas som patogena idag. Candida är asexuella stadier (anamorf) av askomyceter (teleomorf) representerande flera olika släkten såsom Clavispora, Debaryomyces, Issatchenkia, Kluyveromyces, Pichia och Yarrowia (tabell 2). Dessa teleomorfa släktskap tyder på att Candida är en blandning av obesläktade arter. Cellerna varierar i form och storlek. Förökning sker vanligen genom multilateral knoppning. Pseudohyfer och/eller äkta hyfer kan förekomma. De flesta arter jäser olika sockerarter samt är ureas och nitrat (KNO 3 ) negativa. Åtta Candida-arter (C. albicans, C. dubliniensis, C. glabrata, C. guilliermondii, C. krusei, C. lusitaniae, C. parapsilosis, C. tropicalis) är väl kända som opportunistiska human patogener och flera andra mer sällsynta arter har beskrivits från olika infektioner. Flertal Candida-arter ingår i normalfloran i mag-tarmkanal, vagina, uretra, hud och under fingernaglar. De vanligaste formerna av Candida-infektion är vaginit, orofaryngit samt hud-och nagelcandidos. Candida orsakar dessutom djupa infektioner via hematogen spridning från tarmen. Dessa allvarliga infektioner drabbar framförallt immunsupprimerade patienter samt kirurgi- och IVA-patienter (särskilt bukkirurgi). 3

Tabell 2. Anamorfa och teleomorfa stadier av olika jästsvamparter Anamorf Teleomorf C. guilliermondii Pichia guilliermondii C. famata Debaryomyces hansenii C. kefyr Kluyveromyces marxianus C. krusei Issatchenkia orientalis C. lipolytica Yarrowia lipolytica C. lusitaniae Clavispora lusitaniae C. norvegensis Pichia norvegensis C. pelliculosa Pichia anomala syn. Hansenula anomala Cryptococcus Cryptococcus neoformans har 5 serotyper (A, B, C, D och AD hybrid), vilka är kopplade till sexuella formen Filobasidiella inom basidiomyceterna. C. neoformans finns i 2 varianter: C. neoformans var. neoformans (serotyp A och D) och C. neoformans var gattii (serotyp B och C), de respektive sexuella formerna är F. neoformans var. neoformans och F. neoformans var. bacillispora. De 2 varianterna kan differentieras med kanavaninagar. Cryptococcus celler har en mucopolysacharidkapsel vars tjocklek beror på odlingsmedium och variation mellan enskilda stammar. Kolonierna är ofta slemmiga pga. kapseln. Alla kryptokocker är ureas-positiva och assimilerar inositol, men jäsning förekommer inte. Olika Cryptococcus-arter kan skiljas åt med hjälp av assimilation av olika kolhydrater och KNO 3. C. neoformans bildar bruna kolonier på fågelfrö- eller DOPA- (dihydroxyfenylalanin) agar indikerande fenoloxidas aktivitet. C. neoformans var. neoformans förekommer ofta i gammal fågelspillning och kontaminerad jord. Förekomst av C. neoformans var. gattii i naturen sammanfaller med blomningen av eukalyptus träd (Eucalyptus camaldulensis). Infektionen med kryptokocker börjar primärt med inhalation av svampen in i lungan, följd av hematogen spridning till hjärnan och meningerna. Symtomatisk lunginfektion är sällsynt. C. albidus, C. laurentii och C. curvatus har beskrivits i fåtal kliniska fall. 4

Dipodascus Dipodascus capitatus är den sexuella formen av Geotrichum capitatum (tidigare Blastoschizomyces capitatus, Trichosporon capitatum). Dipodascus är en ascomycet. Kolonierna är släta, vita eller krämfärgade och glänsande. Kolonierna har konfluerande strålformad kant. Vid mikroskopisk undersökning ses äkta hyfer, pseudohyfer och annellokonidier som liknar artrokonidier. D. capitatus jäser inte, är ureas-negativ och växer inte med D-xylos. Den växer på Sabouraud agar vid 45 C och på agar med cycloheximid vid rumstemperatur. D. capitatus ingår i normalfloran på hud. Den förekommer i odlingar från sputum och mag-tarmkanalen hos friska individer. D. capitatus är en opportunist och har orsakat ökande antal infektioner hos immunsupprimerade patienter under senare tid. Malassezia Malassezia är nära besläktad med basidiomyceter pga. cellväggsstruktur och ureasproduktion. Sju arter (M. furfur, M. globosa, M. obtusa, M. pachydermatis, M. restricta, M. slooffiae och M. sympodialis) är beskrivna. Alla arter, förutom M. pachydermatis, är beroende av lipider för att kunna växa och därför behövs speciella odlingsmedier (Leeming & Notman agar (LNA) eller Dixonagar) för isolering. Tillsats av olivolja på t.ex. Sabouraud- eller blod-dextrosagar är inte tillräckligt för isolering av de mer svårodlade arterna. Odlingsplattorna ska inkuberas upp till 2 veckor vid 32-35 C. Kolonierna är kräm- eller beigefärgade och släta eller veckade. Malassezia jäst skiljer sig mikroskopiskt från andra jästsvampar genom att den bildar tydligt ärr eller collarette vid knoppningsstället som är resultat av upprepade nya dotterceller från samma ställe. Malassezia-arternas cellstorlek varierar och de kan vara runda, rundovala eller avlånga (som en toffel). Artidentifiering är sällan befogad men kan fås med lipid- (Tween 20, Tween 40 och Tween 80), esculin- och katalastest. Lipidberoende Malassezia arter ingår i hudens normalflora. M. pachydermatis förekommer framförallt på huden i hund- och kattöron. Malassezia-arter orsakar pityriasis versicolor och förekomst av Malassezia liknande jästceller tillsammans med korta vinkelformade filament i direktmikroskopisk undersökning är diagnostiskt. M. furfur och M. pachydermatis kan orsaka kateterrelaterade fungemier hos prematura barn vid intensivvårdsavdelningar. 5

Pichia Pichia anomala är den sexuella formen av C. pelliculosa syn. Hansenula anomala. Pichia är en ascomycet och cellerna bildar multilaterala knoppar. Pichia är nitratpositiv och bildar hattformade askosporer. Kolonier kan vara vita, krämiga eller beige med slät eller skrynklig yta. P. anomala förekommer i miljön och kan isoleras från t. ex grönsaker, frukt och jord. P. anomala är en opportunist och har beskrivits från kateterrelaterade fungemier hos immunsupprimerade patienter. Rhodotorula Rhodotorula-släktet karakteriseras av röda eller gula karotenoida pigment. Rhodotorula är ureas-positiv, saknar pseudomycel och cellerna bildar multilaterala knoppar. Rhodotorula-arter assimilerar inte inositol och jäsning förekommer inte. Svampen är vanlig i miljön, framförallt i vatten. Patienter kan vara koloniserade men infektioner är ovanliga. Kateterrelaterade fungemier kan förekomma hos immunsupprimerade patienter. De vanligaste arterna i kliniska prov är R. rubra, R. minuta och R. glutinis. Saccharomyces Saccharomyces är en ascomycet som bildar multilaterala knoppar. Korta pseudohyfer eller kedjor av knoppande celler kan förekomma. Asci och runda och släta ascosporer kan ses hos ca 60 % av stammarna. Saccharomyces jäser snabbt många olika sockerarter. S. cerevisiae är den vanligaste arten i kliniska prov. Slemhinnekolonisering med S. cerevisiae är vanligt och vaginit förekommer. Även fungemier och andra infektioner kan förekomma hos immunsupprimerade patienter. S. cerevisiae används som bak-, vin- och öljäst och den finns naturligt i grönsaker, frukt och andra matvaror. Trichosporon Trichosporon är en basidiomycet som saknar känd sexuell form. Trichosporon är ureas positiv men jäsning förekommer inte. Kolonier är släta och krämfärgade med tiden kan de bli torra och veckade. Släktet Trichosporon karakteriseras av att bilda artrokonidier, blastokonidier och äkta/pseudohyfer. Vissa stammar bildar bara ett fåtal blastokonidier och kan då vara svåra att skilja från Geotrichum. Det kan vara till 6

hjälp att odla sådana stammar i maltbuljong i rumstemperatur vilket främjar bildning av blastokonidier. Artidentifiering fås med assimilationstester eller t.ex. ID 32C identifikationspanel. Trichosporon jäst isoleras vanligen från jord men förekommer också som sällsynt kolonisatör på hud och munhåla. Olika Trichosporon arter kan orsaka ytliga hudinfektioner t.ex. så kallad white piedra. Systeminfektioner har beskrivits i huvudsak hos neutropena patienter. Jästliknande Geotrichum Geotrichum candidum är den asexuella formen av Galactomyces geotrichum. Geotrichum-arter kan likna jästsvampar i kultur pga. de vita eller krämfärgade kolonierna. Ibland kan även luftmycel förekomma. Vid mikroskopisk undersökning ses ofärgade septerade hyfer och artrokonidier men inga blastokonidier. Biokemiska tester (kolhydratassimilation) skiljer Geotrichum från Trichosporon-arter. Geotrichum är ureas-negativ och växer dåligt eller inte alls vid 37 C. Geotrichum kan ibland isoleras framförallt från mag-tarmkanalen men är sällan patogen. PROVTAGNING, TRANSPORT OCH FÖRVARING Standardmetodik för bakteriologisk provtagning bör tillämpas på patienter med misstänkt jästsvampinfektion. Transporttiden bör inte överstiga 2 timmar (bland annat Cryptococcus och Histoplasma är känsliga). Vid längre transport bör prov från normalt sterila lokaler förvaras vid rumstemperatur. Prov från lokaler som är kontaminerade med normalflora bör kyltransporteras och vid ankomsten till laboratoriet förvaras i kyl för att undvika överväxt av bakterier. Jästsvampar tål normal kylskåpstemperatur. LABORATORIEDIAGNOSTIK Direktmikroskopisk undersökning Mikroskopi är en enkel och billig metod för påvisning av jästsvamp i olika provmaterial. Negativ mikroskopi utesluter dock inte att provet kan innehålla jästsvamp utan odling ska alltid utföras parallellt. Mikroskopi med fluorescerande Blankophor (Bayer) eller Calcofluor (Becton Dickinson) rekommenderas för påvisning av jästsvamp (referensmetod). Gramfärgning (jästsvamp är gram-positiva) och 20 % KOH är alternativa metoder. Tuschpreparat rekommenderas för påvisning av 7

kapselförsedda jästceller i spinalvätska eller urin vid misstänkt Cryptococcusinfektion. Vid mikroskopering kan olika jästsvamp- strukturer ses som är till hjälp vid identifieringen såsom 1) cellstorlek (t.ex. C. glabrata små celler), 2) smal/bred knoppning (t.ex. Malassezia bred knoppning), 3) förekomst av kapsel (t.ex. C. neoformans), 4) förekomst av pseudohyfer (t.ex. alla viktiga Candida arter förutom C. glabrata), 5) förekomst av artrosporer (t.ex. Trichosporon arter). Odling och isolering Förbehandling. Före odling bör vissa provmaterial såsom spinalvätska, bronksköljvätska, aspirat/punktat och urin koncentreras genom centrifugering (1500 g, 10 min). Sega luftvägsprover behöver lösas upp med hjälp av 0,5 % N-acetyl-Lcystein eller sputolysin (obs kort hållbarhet) och koncentreras som ovan. Odling. De medicinskt viktiga Candida-arterna växer bra i 35-37 C, C. neoformans och Malassezia-arter växer däremot bättre i 30-35 C. Valet av odlingssubstrat styrs av behovet av att begränsa bakterieväxt och att optimera växten av jästsvampar. Antibiotikatillsats rekommenderas för odling av prov från icke-sterila lokaler. Sabouraud agar med dextros (ph 5,6) med eller utan tillsats av antibiotika (t.ex. kloramfenikol och gentamicin) är den mest använda odlingssubstratet för primärisolering av jästsvamp. Tillsats av cycloheximid rekommenderas inte i substrat för primärisolering eftersom det hämmar växten av många jästsvampar. Odling på Sabouraud agar kan med fördel kompletteras med odlingssubstrat som tillåter differentiering av vissa Candida arter med hjälp av färgen på kolonierna (t. ex CHROMagar Candida) vilket förkortar artbestämningstiden. Den andra viktiga fördelen med CHROMagar är att detektionen av blandkulturer blir bättre än på traditionella substrat. Jästsvampar växer även bra på vanliga bakteriologiska odlingsmedier såsom blodagar och BHI (brain-heart infusion) agar. Blododling Blododling är fortfarande första linjens test för diagnos av invasiv svampinfektion. Blododlingsrutinerna för svamp följer dem för bakterier. Fem dagars odlingstid som rekommenderas vid vanlig blododling bör förlängas vid svampmisstanke eftersom t.ex. Histoplasma capsulatum och C. neoformans växer långsammare (upp till 2 veckor) än Candida-jäst. Det är viktigt att man tar en stor blodvolym enligt 8

tillverkarens anvisningar. Känsligheten för att detektera svamp har förbättras och detektionstiden har minskat i takt med införandet av nya automatiserade blododlingssystem (t. ex BACTEC 9240 och BacT/ALERT 3D) och nya typer av odlingsflaskor (Mycosis IC/F och BacT FA). Chromagar rekommenderas för utodling av positiva flaskor för snabbare artidentifiering. Artidentifiering De flesta jästsvampar växer ut inom 48-72 timmar. Jästsvampens förmåga att växa vid 37 C är en mycket viktig egenskap. De flesta patogena arter växer bra både vid 25 C och 37 C medan saprofyter inte växer vid den högre temperaturen. Vissa arter som C. albicans växer i närvaro av cycloheximid som används i t. ex Mycosel, Mycobiotic och Dermatofyt-test-medium men många andra jästsvampar (t. ex C. neoformans) hämmas. Det vanligaste sättet att artidentifiera jäst från kliniska prov är att först använda ett enkelt test (CHROMagar eller serumtest) för att identifiera C. albicans. Eftersom denna art utgör oftast minst hälften av alla jästisolat begränsas därmed användningen av mer omfattande tester till non-albicans Candida-arter och andra mer sällsynta jästarter. Snabbmetoder för artidentifiering RAT-test (Rapid assimilation of trehalose) möjliggör identifiering av C. glabrata inom 1 timme. Nackdelen med metoden är att den kräver ett stort inokulat och att alla C. glabrata-isolat inte ger positivt testresultat. Känsligheten på testet är högre om C. glabrata kulturen är minst 48 timmar gammal. Specificiteten ökar om det utförs på presumtiva C. glabrata kolonier från CHROMagar och att förekomst av små jästceller konfirmeras med mikroskopi. Serumtest är en snabb metod för identifiering av C. albicans och kan utföras på primärisolat eller renkultur. De flesta C. albicans- men också C. dubliniensis-isolat bildar groddslangar i serum (t.ex. kalv) efter 1,5-3 timmars inkubering vid 37 C. C. tropicalis kan ge groddslangliknande strukturer, men har en tydlig insnörning mellan jästcellen och hyfen. 9

Morfologisk mikroskopiundersökning Morfologisk mikroskopiundersökning av blastokonidier och pseudohyfer/hyfer på majs- eller ris-tweenagar är fortfarande en grundsten i artidentifiering. Mikromorfologiskt utseende av jästsvampen används för att komplettera och konfirmera resultaten på biokemiska tester. Mikromorfologin är speciellt viktig och rekommenderas starkt om kommersiella och/eller automatiserade jäst identifieringssystem nyttjas, eftersom vissa arter inte kan eller är svåra att skiljas åt med enbart dessa biokemiska tester. Som exempel kan nämnas C. guilliermondii och C. famata varav den senare inte bildar pseudohyfer på majsagar. Kapselbildning Tuschpreparat (India Ink) kan användas för att synliggöra kapseln hos kryptokocker, särskilt i likvor men också på framodlade kolonier. Kapseln framträder som en ljus halo mot tuschens mörka kolpartiklar. Leukocyter kan ge liknande fenomen som dock försvinner inom 5-10 min och framförallt har kryptokocker en klar ljusbrytande cellvägg och knoppande celler. Kapselantigen kan också påvisas med latexagglutinationstest, som är specifikt för C. neoformans. Kolhydratassimilation Av de biokemiska testerna för artidentifiering av jästsvamp är assimilationen den viktigaste. Med assimilation menas svampens förmåga att använda ett specifikt kolhydrat (sockerart) som en enda kolkälla vid aerob växt. Assimilationsreaktionerna i mykologiska referensböcker är vanligtvis utförda enligt den klassiska Wicherman & Burton metoden (J Bacteriol 1948, 56:363-371). Det finns flera bra kommersiella kit på marknaden som baserar sig på assimilation. Testerna liknar, men är inte identiska med Wicherman metoden, vilket gör att 100 % överensstämmelse mellan metoderna sällan nås. Kommersiella biokemiska och enzymatiska paneler Av manuella tester var API 20 C AUX (biomeriéux, Frankrike) system länge ledande men nyare system som Auxacolor (Sanofi Diagnostics Pasteur, Frankrike)) och Fungichrom I (International Microbio, Frankrike) är lika exakta men snabbare och mer användarvänliga. Både Auxacolor och Fungichrom nyttjar ph-indikatorer för 10

detektion av kolhydratassimilation och/eller chromogena substrater för enzymdetektion. ID 32 C panel (biomeriéux, Frankrike) som kan användas både manuellt och automatiserat med ATB eller mini-api instrument och fullt automatiserat Vitek 2 ID- YST system identifierar >93 % av de vanligaste förekommande jästarterna. ID-YST har visat sig vara pålitlig för identifiering av sällsynta arter som C. dubliniensis. Systemet kan identifiera 51 arter med hjälp av 47 biokemiska tester och fluorescerande avläsning efter 15 timmar. ID 32 C är dock för närvarande den mest använda metoden i Sverige och betraktas som referensmetod pga. dess omfattande databas (63 arter) och exakthet. Jäsning Jästsvampens förmåga att jäsa vissa sockerarter påvisas med gasbildning. Gasen fångas upp i små upp-och-nervända Durhamrör i jäsningsröret. Olika arter har skilda jäsningsmönster och visar också skillnad på hur starkt och snabbt sockerarten jäses, se referensböcker. Rekommenderade sockerarter är D-glukos, D-galaktos, sackaros, maltos och laktos. REFERENSER Dignani MC. et al. Candida. I Anaissie EJ, McGinnis MR. & Pfaller MA. Clinical Mycology. Elsevier Science, 2003. Viviani MA. et al. Cryptococcus. I Anaissie EJ, McGinnis MR. & Pfaller MA. Clinical Mycology. Elsevier Science, 2003. Maenza JR. & Merz WG. Infections caused by non-candida, non-cryptococcus yeasts. I Anaissie EJ, McGinnis MR. & Pfaller MA. Clinical Mycology. Elsevier Science, 2003. Hazen KC. & Howell SA. Candida, Cryptococcus, and other yeasts of medical importance. I Murray PR. et al. Manual of Clinical Microbiology 8 th ed. ASM Press, 2003. Horvath LL. et al. Direct isolation of Candida spp. from blood cultures on the chromogenic medium CHROMagar Candida. J Clin Microbiol 2003, 41: 2629-32. Buchaille L. et al. Evaluation of six commercial systems for identification of medically important yeasts. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1998, 17: 479-488. 11