Epidemisk variation av patogena Clostridium difficile i Örebro län

Örebro Universitet Institutionen för hälsovetenskap och medicin Biomedicinsk analytiker programmet, inriktning laboratoriemedicin BMLV C, Biomedicinsk laboratorievetenskap C, Examensarbete, 15 hp Första inlämning: 2014-05-12 Andra inlämning: 2014-05-26 Epidemisk variation av patogena Clostridium difficile i Örebro län Författare: Hanna Karlsson Handledare: Torbjörn Norén, Hygienläkare, Med. Dr Karin Johansson, Molekylärbiolog, Med. Dr Laboratoriemedicinska Länskliniken Universitetssjukhuset Örebro

Sammanfattning Clostridium difficile är en tarmpatogen bakterie som orsakar infektion (CDI) på grund av dess förmåga att producera cytotoxin. Bakterien är även sporbildande vilket gör den svår att eliminera och kräver speciella rutiner av hygien och omvårdnad av drabbade individer. Studiens syfte var att jämföra PCR ribotyper från år 2013 och år 2000 och undersöka skillnader i frekvens. Jämförelse gjordes även av ålder hos de drabbade. PCR ribotypning utfördes på isolat från år 2013 (januari till juni) i Örebro län och en jämförelse gjordes med en tidigare ribotypning av isolat från år 2000. Resultaten visade att antalet sjukdomsfall ökat sedan år 2000, däremot har ribotypen s17 minskat kraftigt. Tjugotvå nya stammar har tillkommit, däribland s29b/078 vilken var den mest förekommande år 2013 (20 %). Åldersförändringar hos de drabbade ses då medianåldern sjunkit fem år och populationen under 30 år drabbas i högre grad (4 % jmf 14 %). Studien uppmuntrar till vidare utredning av s29b/078 och orsaken till dess höga incidens och även förhållandet av samhällsinducerad jämfört med vårdinducerad CDI. Nyckelord: Clostridium difficile, Clostridium difficile infektion, PCR ribotypning, ribotyp 078, epidemiologi, Örebro län

Innehållsförteckning Bakgrund... 1 Clostridium difficile... 1 Clostridium difficile infektion... 2 Behandling... 4 Typning av Clostridium difficile... 4 PCR ribotypning... 5 Syfte... 6 Material och metod... 6 Material... 6 Odling... 7 DNA-preparation... 7 PCR... 7 Gelelektrofores... 7 MALDI-TOF... 8 Bearbetning av resultat... 8 Resultat... 8 Diskussion... 10 Omnämnande... 14 Referenser... 14

Bakgrund Clostridium difficile Clostridium difficile är en sporbildande bakterie som växer anaerobt (Figur 1) [1, 2]. Den är den vanligaste vårdrelaterade tarmpatogenen inom svensk sjukvård och den är även vanlig internationellt [3]. Vissa stammar har egenskapen att bilda toxin vilket gör att dessa stammar ger infektion [3]. Bakterien kan orsaka alltifrån mild diarré till livshotande infektioner, som inflammation i tjocktarmen (pseudomembranös kolit) [2, 3]. Figur 1. Clostridium difficile är den vanligaste vårdrelaterade tarmpatogenen inom svensk sjukvård. I mikroskopi ses de som grampositiva stavar (Skala 100:1). Fotograf: Författaren. C. difficiles viktigaste virulensfaktorer är att den bildar toxin och sporer. Sporer bildas när omgivningen blir ogynnsam, exempelvis vid brist på näring. Det finns olika typer av sporer som kan bildas av olika bakterier men C. difficile bildar främst endosporer som kan förvaras i bakteriecellen [4]. Uttrycket av sporbildning i cellen kontrolleras av många faktorer då det är en komplicerad process. Dels regleras det av Spo0A som är en transkriptionsfaktor och det har även visat sig att Spo0A ger en indirekt genreglering av toxinbildandet [5]. Sporer bildas genom att det sker en assymetrisk celldelning där den mindre cellen sedan blir uppslukad av modercellen (Figur 2). Den uppslukade cellen kallas förspor och bildar sedan ett lager kring sig vilket kan liknas vid en cellvägg. När modercellen lyserar kan sporen spridas vidare då den blir frisläppt. När omgivningen blir gynnsam för sporen utvecklas den till att bli en bakteriecell som kan föröka sig. Sporer är väldigt motståndskraftiga och vanliga alkoholbaserade desinfektionsmedel kan inte förstöra dem [4]. 1

Figur 2. Sporbildning i bakterier består av assymetrisk celldelning och att modercellen uppslukar den mindre cellen. Försporen utvecklar sedan lager omkring sig. När sedan modercellen lyserar kan sporen spridas vidare. Bild hämtad från http://www.nature.com/nrmicro/journal/v11/n1/fig_tab/nrmicro2921_f1.html Clostridium difficile infektion En C. difficile infektion (CDI) utlöses vanligen av antibiotikabehandling eftersom bakterien drar nytta av att antibiotika slår ut normalfloran i tarmen medan C. difficile sporerna överlever. Det ger den utrymme att prolifiera och eventuellt börja producera toxin. Är bakterien toxinproducerarande leder det till att patienten får diarré i varierande grad, medan de toxinnegativa stammarna anses vara ickepatogena [2, 6]. Clostridium difficile kan producera två toxiner med cytotoxisk effekt: toxin A och toxin B. Det är förekomsten av dessa toxin som undersöks vid misstanke om CDI. Tidig forskning visade ett samband mellan halten toxin, utvecklingen av pseudomembranös colit och durationen på diarré, vilket ledde till mer forskning om toxinen [7]. Både toxin A och toxin B inaktiverar generna Rho, Rac och Cdc42 i de utsatta cellerna. Detta leder till att ett antal fysiska händelser i cellen ändras vilket bidrar till att de utsatta cellerna får en annan form vilket kan leda till apoptos och även att det intestinala epitelet blir förstört. Toxinerna bidrar även till att mediatorer frisätts som bidrar till inflammation i det intestinala epitelet (Figur 3) [7]. Genen där toxinen kodas börjar uttryckas när bakterien utsätts för stimuli från omgivningen. Vilka stimuli som initierar genuttrycket är inte helt förstått men stressfaktorer som antibiotika antas påverka uttrycket [7]. Toxin A verkar primärt i det intestinala epitelet medan toxin B dels verkar där men även på andra områden [7]. 2

Figur 3. C. difficile producerar toxin A (TcdA) och toxin B (TcdB) som har en cytotoxisk effekt vilket gör att cellerna ändrar form och det intestinala epitelet påverkas. TcdA verkar lokalt bland annat på bindningarna mellan cellerna i epitelet medan tcdb kan verka på fler ställen. Båda toxinerna inducerar frisättningen av mediatorer som bidrar till inflammation. Hämtad från http://www.nature.com/nrmicro/journal/v7/n7/fig_tab/nrmicro2164_f5.html De som drabbas av CDI är framförallt äldre eller kroniskt sjuka individer som har fått antibiotikabehandling. På senare år förekommer allt mer samhällsförvärvad CDI då yngre och gravida drabbas som inte haft antibiotika behandling [3, 8]. Assymtomatisk bärarskap av bakterien förekommer, vilket främst ses hos barn. Skulle de individerna antibiotikabehandlas kan symtom uppkomma när bakterien får utrymme att kolonisera tarmen [3]. CDI kan utlösas av alla antibiotika men bredspektrumantibiotika som cefalosporiner, klindamycin och fluorokinoloner ses framförallt som större riskfaktorer [8]. I övrigt ökar risken för CDI med underliggande sjukdomar och lång sjukhusvistelse [8]. Recidiv förekommer med 20-30 % [8] och räknas som ett när en patient insjuknar efter avslutad behandling. Bakterien sprids via kontaktsmitta och eftersom bakterien är sporbildande sprider den sig lätt mellan patienter eller till att ge recidiv hos samma patient. God vårdhygien är därför väldigt viktigt. Sporocida medel måste användas och speciella rutiner krävs för att ta hand om CDI patienter för att minimera spridning och recidiv, exempelvis att CDI patienter vårdas i ensamrum [3, 8, 9]. År 2012 var majoriteten av fallen med C. difficile i Sverige kvinnor (54 %). Medianåldern låg på 74 år för kvinnor och 73 år för män enligt en årsrapport från folkhälsomyndigheten. Alla åldersgrupper drabbas av CDI men patienter över 60 år drabbas i högre utsträckning [10]. 3

Behandling När en patient drabbas av CDI orsakat av antibiotika är den främsta åtgärden att sätta ut antibiotikat i de fall det är möjligt [8]. Beroende på hur allvarligt fallet är kan annan antibiotikabehandling vara aktuell. Flagyl och vancomyocin är två av de antibiotika som används inom svensk sjukvård för behandling av CDI. Den förra används till mindre allvarliga fall, den senare till mer allvarliga eller CDI med mer komplicerat förlopp. I utlandet används fidaxomicin som ger färre recidiv efter behandling jämfört med vancomycin (15 % jmf 25 %) [8, 11]. Fidaxomicin är ett dyrt läkemedel och ingår därför inte i högkostnadsskyddet. På grund av det används det inte till behandling i Sverige [8]. Resistens hos bakterier mot vissa antibiotika blir ett allt större problem och förekommer även hos C. difficile. Vissa stammar visar resistens mot moxifloxacin och rifampicin. Det är inga antibiotika som används till behandling vid CDI men på Universitetssjukhuset i Örebro (USÖ) undersöks resistensen vid varje frågeställning om C. difficile för att följa utvecklingen och spridningen av de resistenta stammarna. Faecestransplantation är en relativt ny behandling som kan fungera för de patienter som får många recidiv av CDI och inte får tillbaka sin normala tarmflora. Behandlingen innebär transplantation av faeces från en frisk donator till den drabbade patienten och därav får patienten en normalflora i tarmen som kan hindra tillväxten av C. difficile. Det är en effektiv och billig behandling med få komplikationer [12, 13]. Typning av Clostridium difficile De olika undergrupperna och stammarna av C. difficile varierar i hur allvarliga infektioner de ger och skiljer sig i hur väl de sprider sig till andra individer. Därför finns ett visst intresse av att bestämma stam av bakterien. Det kan ske med olika metoder vilket även ger olika sätt att namnge stammarna. I Sverige är det folkhälsomyndigheten som namnger olika stammar och år 2010 fanns det 218 kända stammar i Sverige. Polymeras kedjereaktion (PCR) ribotypning är den metod som främst har använts i Sverige och Europa och används fortfarande på USÖ även om de börjar övergå till fragmentanalys genom kapillärgelelektrofores. Det finns en svensk och en Europeisk nomenklatur på de olika PCR ribotyperna där den svenska föregås av SE eller s följt av numreringen på bakteriestammen. I Nordamerika och Kanada används däremot Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE) vilket ger ett annat namnsystem på bakterien med bokstäverna NAP i början [14]. Som tidigare nämnt finns det olika typer av C. difficile vilka kan grupperas som mer eller mindre infektiösa. PCR ribotyp 027/SE10 (NAP1) som är moxifloxacinresistent anses vara en av de mer aggressiva då den har visat sig orsaka utbrott och dödsfall [15]. Stammen uppkom först i Kanada år 4

2003 [16] men har sedan spridit sig till Europa. Första utbrottet i Sverige uppkom år 2014 i Växjö och orsakade dödsfall men stammen har sedan dess inte orsakat några kända utbrott [15]. PCR ribotypning PCR ribotypning av C. difficile föregår av de preanalytiska stegen att odla upp bakterien och extrahera DNA. Vid behov konfirmeras bakterien genom MALDI-TOF som är en metod för att artidentifiera bakterier. I C. difficile DNA finns ett operon som kodar för rrna och den innehåller en intergenetisk spacer region mellan 16S och 23S. Sekvensen 16S finns hos de flesta bakterier och har visat sig vara användbar vid identifiering av bakterier. Olika stammar av C. difficile har olika många kopior av operonet och spacersekvensen i operonet skiljer sig även i längd stammar emellan. Det gör att stammarna kan skiljas åt genom PCR med primrar riktade mot 16S och 23S [17-19]. Polymeras kedjereaktion (PCR) är en metod för att amplifiera en liten mängd DNA genom olika steg med skiftande värme och ett antal cykler till att få en detekterbar mängd DNA som går att undersöka (Figur 4) [20]. Figur 4. De olika stegen i en polymeras kedjereaktion med denaturering, annealing och förlängning och respektive temperatur (bild A). DNA ökar exponentiellt vid varje cykel i en PCR (bild B). Bild hämtad från https://www.neb.com/sitecore/content/nebsg/home/applications/dna-amplification-and-pcr/pcr/routine-pcr Efter PCR utförs gelelektrofores som detektionsmetod av amplikonen genom att DNA fragment separeras efter längd. DNA fragmenten vandrar i en matrix i ett elektrisktfält där DNA vandrar mot den positiva poolen eftersom det är negativt laddat. De korta fragmenten vandrar snabbare än de långa vilket ger en separation. Genom att ha med en eller fler basparsstegar kan banden i gelen avläsas. Antingen utförs en visuell bedömning av hur stora banden är eller så utförs bedömningen med hjälp av datorprogram, vilket är att föredra [20, 21]. 5

När gelelektrofores utförs vid PCR ribotypning av C. difficile uppkommer flera band per bakterie vars mönster är specifikt för en stam (Figur 5). Bandmönstret som blir av gelelektroforesen jämförs med andra mönster från C. difficile stammar i ett dataprogram som innehåller ett bibliotek. På så sätt kan olika stammar av C. difficile grupperas [19]. Figur 5. Silverfärgad akrylamidgel efter elektrofores av PCR produkt vid ribotypning av Clostridium difficile. Varje brunn representerar en stam av C. difficile, det syns även fem 100 baspars stegar. Fotograf: Författaren. Syfte Studiens syfte var att utföra PCR ribotypning av Clostridium difficile stammar från perioden januari till juni år 2013 och göra en jämförelse med en tidigare studie på material från år 2000. Detta gjordes för att undersöka om det skett någon förändring i frekvens av förekommande ribotyper men också för att jämföra fördelningen mellan kön och ålder hos CDI patienter mellan de båda årtalen. Material och metod Material PCR ribotypning utfördes på Clostridium difficile isolat ifrån patienter inom Örebro läns landsting inom perioden januari-juni år 2013 som haft C. difficile infektion. Totalt analyserades 168 isolat från 126 patienter varav 55 % utgjorde kvinnor. Under PCR ribotypningen skedde bortfall av isolaten då prov saknades (2st), var orent nedfrysta (2st) eller inte gav någon växt vid odling (7st). Det blev även bortfall (1st) där det visade sig vara fel bakterie nedfryst, analys med MALDI-TOF gav resultatet Clostridium butyricum. Fyra isolat var av okänd ribotyp men de analyserades på MALDI-TOF som C. difficile. Bortfallen gjorde att antalet isolat från år 2013 minskade från 184st till 168st. Etik I studien användes renodlade bakterieisolat och därför ansågs inte en etisk prövning nödvändig. De personnummer som användes i studien var endast för åldersberäkning och recidivundersökning och alla resultat i studien är avkodade. Det har inte funnits någon tillgång till patientjournaler under studien. 6

Odling Innan PCR ribotypning, utfördes en odling av renodlade isolat från patienter med CDI som förvarats i -70⁰ C. Isolaten odlades upp anaerobt (0,2 % syre, 5 % koldioxid, 9,9 % vätgas, 84,9 % kvävgas) i 36⁰ C i 48 timmar på anaerob agarplatta (5 % Hästblod, defibrinerat (SVA, Sverige), 4,6 % Fastidious Anaerob Agar [ 50 % Pepton mix, 11 % Natrium-klorid, 2 % löslig stärkelse, 0,8 % Natriumbikarbonat, 2 % Glukos, 2 % Natrium-pyruvat, 1 % L-Cystein, 0,5 % Natrium-pyrofosfat, 2 % L- Arginin, 1 % Natrium-succinat, 0,02 % Hemin, 0,002 % Vitamin K, 26 % Agar] (Acumedia)). Orena isolat odlades upp på en selektiv Clostridium difficile agarplatta (4,57 % Fastidious Anaerob Agar (Acumedia), 5 % Hästblod, defibrinerat (SVA, Sverige), Clostridium difficile Supplement (250 mg/l D-cicloserina, 8 mg/l Cefoxitina, Bergman Labora AB, Danderyd, Sverige)). DNA-preparation De renodlade isolaten odlades i buljongkultur inför DNA preparering. Buljongkulturen innehöll en koloni av bakterien och petponjästextrakt medium (Pepton, Jästextrakt, Ultrarent vatten, Saltlösning, Kalciumkloridlösning, Vitamin K, Heminlösning, Resazurin; Karolinska Sjukhuset substratavdelning, Stockholm, Sverige) med cystein (0,5g/ml medium, Sigma-Aldrich, Stockholm, Sverige). Suspensionen inkuberades anaerobt i 36⁰ C i 24 timmar. Buljongkulturen preparerades vidare med centrifugering 5 min i 14170 x g. Pelleten förvarades sedan i -70⁰ C fram till analys. Vid analys extraherades DNA genom att bakterien blandades med 200 ml chelex lösning (5 %, Bio-Rad Laboratories, Solna, Sverige) och inkuberades 10 min i 96⁰ C. PCR PCR utfördes med Pure Taq Ready To-Go PCR rör (BSA, nukelotider, PureTaq DNA polymeras, reaktions buffert; GE Healthcare, Uppsala, Sweden) där 0,5 µl DNA, 1 µl av vardera primer tillsattes till en slutvolym på 25 µl. De två primer som användes var 5 -CTGGGGTGAAGTCGTAACAAGG- 3 och 5 -GCGCCCTTTGTAGCTTGACC-3 (2 µm slutkoncentration, SGS DNA, Köping, Sverige). PCR programmet utfördes på PTC-100 (MJ Reasearch, Inc., Watertown, Mass) enligt följande: initial denaturering 94 C i 5 min följt av 1 min 94 C, 1 min 55 C, 1 min 72 C. De tre sista stegen repeterades i 29 cykler följt av 7 min 72 C och slutligen 4 C. Gelelektrofores Gelelektrofores utfördes enligt kitbeskrivning för GeneGel Excel 12.5/24 Kit (GE Healthcare) med användning av spänningsaggregat (EPS 600, GE Healthcare) och elektrofores Genophor Electrophoresis Unit (GE Healthcare). Mineralolja (Immobiline Dry Strip Cover fluid PlusOne, GE Healthcare) användes under gelen för att få fäste till spänningsytan. Varje brunn på den färdiggjutna polyakrylamidgelen laddades med 5,5 µl PCR produkt blandat med loading buffert (10 mmol/l Tris 7

lösning, 1 mmol/l EDTA, xylene cyanol lösning, bromfenolblått, MilliQ vatten). Elektroforesen kördes i 90 min med inställningarna 600 V, 25 ma och 15 W. Som storleksmarkör användes 100 Base-pair Ladder (GE Healthcare) Gelen silverfärgades med PlusOne DNA staining kit ifrån GE Healthcare enligt kitbeskrivning. Därefter utfördes dataanalys av gelen med BioNumerics (Applied Maths, Saint-Martems, Belgien). MALDI-TOF Stammar som inte matchade en C. difficile stam i BioNumerics vid gelanalysen eller som vid odling inte liknade en C. difficile analyserades med hjälp av MALDI-TOF (MALDI Biotyper RTC, Bruker Daltonics, Bremen, Tyskland) enligt tillverkarens instruktioner [22]. Vid matchningen användes databasen Orebro 20131210 som referensbibliotek vilken består av Biotyper 3.1 och Security Relevant Reference library v 1.0. Bearbetning av resultat Data berörande perioden januari-juni år 2000 användes ifrån en tidigare studie av Norén m.fl. där ribotypning av stammarna skett [23]. Medianålder och åldersfördelning beräknades och även frekvens av stammarna för vartdera år. Resultat År 2000 analyserades i en studie av Norén m.fl. [23] totalt 96 isolat av 88 patienter under perioden januari-juni. Av dem utgjordes 57 % av sjukdomsfallen kvinnor och 82 % var i en ålder över 60 år med en medianålder på 74 år (2-96 år). De som var under 30 år utgjorde 4 %. Det förekom 22 olika ribotyper varav den vanligaste var s17 (30 %). Därefter var s21 (13 %) och s12 (10 %) de vanligaste förekommande (Figur 6). Frekvens (%) 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% s1 s2 s3 s7 s11 s12 s14 s16 s17 s19 s20 s21 s21a s21b s21d s22 s22c s25 s26 s28b s39 s42 PCR ribotyp 8

Figur 6. Frekvens av de PCR ribotyper (svensk numrering) av C. difficile som orsakade CDI år 2000 januari-juni i Örebro län. S17 och s21 är de stammar som förekommer i störst antal. I studien analyserades totalt 168 isolat ifrån 126 patienter av isolat från år 2013, januari till juni. Av patienterna utgjorde 55 % kvinnor och 70 % hade en ålder över 60 år varav medianåldern var 69 år (1-97 år). De som var under 30 år utgjorde 14 %. Det återfanns 36 ribotyper varav s29b (20 %) var den vanligaste följt av s21 (9 %) och s21a (8 %) (Figur 7). Frekvens (%) 20% 18% 16% 14% 12% 10% 8% 6% 4% 2% 0% s1 s2 s3 s4a s4b s5 s7 s7b s10 s12 s14 s16 s16e s17 s19 s19c s19m s20 s20c s20e s20f s21 s21a s21b s21d s22 s25 s28 s29a s29b s30 s30b s32 s37 s41c s63 PCR ribotyp Figur 7. Frekvens av de PCR ribotyper (svensk numrering) av C. difficile som orsakade CDI år 2013 januari till juni i Örebro län. Stammen s29b är vanligast förekommande följt av s21, s21a och s21b. De ribotyper som fanns både år 2000 och 2013 var 16st, där minskningen av s17 och är den tydligaste skillnaden (Figur 8). Sex ribotyper som fanns år 2000 återfanns inte bland stammarna från år 2013; s11, s22c, s26, s28b, s39 och s42. Däremot har 22 nya ribotyper tillkommit som inte fanns i omlopp år 2000, där 29b ger den största skillnaden med 33 fall medan resterande inte var mer än 3 fall (Figur 9). 30% 25% Frekvens (%) 20% 15% 10% 5% 0% 2013 2000 PCR ribotyp 9

Figur 8. Skillnaden i frekvensen av de PCR ribotyper som förekom av C. difficile både år 2000 (röd) och år 2013 (blå). Den största skillnaden syns hos s17 som minskat i antal från år 2000. Frekvens (%) 20% 18% 16% 14% 12% 10% 8% 6% 4% 2% 0% s2 s4a s4b s5 s7b s10 s16e s19c s19m s20c s20e s20f s28 s29a s29b s30 s30b s32 s37 s41c s63 PCR ribotyp Figur 9. Frekvens av de PCR ribotyper som fanns år 2013 men inte år 2000 från gällande period. Recidiv förekom båda perioderna med en frekvens av 7 % år 2000 och 8 % år 2013. År 2000 var det totalt sju recidiv av fyra ribotyper; s20 (29 %), s21 (29 %), s17 (29 %), och s12 (14 %). År 2013 var det 13 olika ribotyper där 29b stod för 31 % och 21b 23 %. Av isolaten utfördes MALDI-TOF på fem preparat på grund av icke tolkningsbara resultat i gelanalysen. En av bakterierna var C. butyricum (score värde 2,117) och resterande C. difficile (score >2,2). Diskussion Clostridium difficile är en vanlig tarmpatogen i den svenska sjukvården som orsakar CDI. Eftersom olika stammar har olika virulens finns intresset av att typa dessa och även att undersöka hur frekvensen stammarna emellan förändrar sig över tid. Den epidemiologiska informationen kan vara användbar i hur sjukvården vidare ska ställa sig för att bemöta de patogena stammarna av C. difficile. I studien PCR ribotypades bakterieisolat ifrån år 2013 och jämfördes med tidigare typade isolat ifrån år 2000. Isolaten som ribotypades var från samma period av sex månader under båda åren och år 2013 återfanns det fler detekterade fall än år 2000 (167st jmf 96st). Antalet sjukdomsfall av C. difficile i Örebro län har alltså ökat genom åren och en ökning av CDI märks även i studier från andra länder 10

[16, 17, 24, 25]. År 2013 var det även en vinter med många sjukdomsfall av vinterkräksjuka orsakad av norovirus i Örebro län. Det finns teorier om att norovirus utbrott och CDI kan påverka varandra [26]. Orsaken till det höga antalet CDI skulle kunna ligga i att perioden med mycket norovirus gett att fler prov blev undersökta med frågeställning om C. difficile som i vanliga fall inte skulle blivit utredda [27]. Det ger därav en större mängd positiva prover av C. difficile. I den här studien syns det en förändring i åldersfördelningen av de som drabbas av CDI, medianåldern har sjunkit med 3 år. De drabbade över 60 år har även minskat med 12 procentenheter och de drabbade under 30 år har ökat med 10 procentenheter. Alltså drabbades fler yngre människor år 2013 än vad som gjordes år 2000. Ökningen av de samhällsinducerade fallen av CDI som visats genom andra studier [6, 25] kan vara kopplat till att det är fler yngre som drabbas. Tyvärr sker ingen jämförelse i studien mellan samhällsinducerad och vårdinducerad CDI då tiden och åtkomsten till data var begränsad. Fördelningen mellan män och kvinnor ligger relativt lika och den lilla skillnaden som fanns år 2000 har minskat med 2 procentenheter. År 2013 var 55 % av sjukdomsfallen från kvinnor och 45 % från män. Skillnaden som fanns och fortfarande kan ses är inte tillräckligt stor för att kunna dra några slutsatser om att det föreligger skillnad mellan hur män och kvinnor drabbas. Istället kan det konstateras att män och kvinnor i stort drabbas till lika del av CDI. När frekvensen av antal stammar undersöktes syntes den största skillnaden mellan åren hos s17 och s29b. PCR ribotypen s17 har minskat kraftigt från att ha orsakat 30 % av fallen år 2000 till endast 4 % år 2013, en minskning på 26 procentenheter. S17 var ett problem år 2000 på USÖ då den verkade vara en omgivningssmitta men eftersom den har minskat så kraftigt i antal sjukdomsfall verkar man ha fått bort den genom hygienstädning och minskad användningen av klindamycin. Studier har visat att en restriktiv användning av antibiotika är en del i att minska fallen av CDI [28] och städningen en annan [29]. Däremot blir det säkerligen bäst effekt av att kombinera fler åtgärder för att minska spridning och sjukdom [30]. Eventuellt skulle s29b övertagit s17 plats som omgivningssmitta med tanke på mängden fall av den stammen (20 %) men för att konfirmera det behövs en grundligare undersökning av vilka avdelningar sjukdomsfallen kommer ifrån, ifall det är samma avdelningar eller ej. Av s29b/078 har det skett en stor ökning då den inte fanns i länet år 2000 men under de sex månaderna år 2013 orsakade den 20 % av CDI och var den vanligast förekommande. Den stora ökningen av s29b kan antingen förklaras genom att vara en omgivningssmitta vilket nämnts ovan. Andra förklaringar kan ligga i att spridningen skett via köttvaror. I studier dels från Spanien, Iran och Nederländerna har det nämligen visat sig att stammen 078 kan spridas på det sättet [31-33]. Kommer inte fallen i den här studien från sjukhuset utan de visar sig vara samhällsinducerade skulle detta styrka teorin om att det kan vara smittspridning via maten. Det skulle även kunna ge en förklaring till varför antalet samhällsinducerade CDI ökar [6, 25]. För att vidare undersöka teorin kan köttprover från 11

matvarubutiker behöva undersökas. När det uppkommer en stor mängd av samma ribotyp kan även frågor väckas om förklaringen ligger i att det skett ett utbrott vilket i sig kan förklara den stora mängden. Under den perioden som isolaten var ifrån har det inte skett något utbrott och den förklaringen anses alltså mindre trolig. I en studie för att kartlägga vanliga PCR ribotyper i Europa utförd av Bauer m.fl. var s21/014 bland den vanligaste med 16 % [34]. I den här studien förekom 014 med 9 % år 2013 och är den andra mest förekommande ribotypen i den här studien följt av s21a och s21b. Skillnaden av 014 i den här studien jämfört med Bauer m.fl. är alltså inte stor och därifrån kan slutsatsen dras att det förekommer en normal fördelning av antalet 014. Bauers studie visade även att s29b/078 var bland de tre mest förekommande (8 %) [34] jämfört med 20 % i vår studie vilket visar en högre förekomst vilket redan diskuterats. Under ribotypningen av isolaten från år 2013 hittades en s10/027 som var moxifloxacin känslig. De 027 som har orsakat utbrott på senare år har varit moxifloxacin resistenta och toxinproducerande [16]. PCR ribotyp 027 fanns redan innan de första utbrotten i Kanada men utan att vara toxinproducerande. Det var när det uppkom en resistent stam som den började orsaka problem. Vissa av de gamla stammarna lever kvar men upptäcks inte i samma grad eftersom de inte orsakar lika stor skada. Det fynd av 027 som gjorts i studien är alltså en utav de gamla stammarna som inte är utbrottsbenägen. Resultatet visar tydligt att fler och nya stammar som orsakat CDI uppkommit i länet sedan år 2000. En av förklaringarna kan ligga i att vi reser allt mer och flyttar mellan länder vilket ökar risken för att sprida olika typer av bakterier, speciellt med tanke på assymptomatiskt bärarskap som förekommer med C. difficile. Den förklaringen kan vara en anledning till att PCR ribotyp 027 har spridit sig till Europa och Sverige ifrån där den först upptäcktes i Kanada [16] och även att de stammar som inte ens fanns i Örebro län år 2000 har ökat. I materialet förekommer isolat från patienter som insjuknat flera gånger så kallat recidiv. De allra flesta recidiv i studien orsakades av samma stam som orsakat CDI hos patienten vid första insjuknandet, med undantag för ett fåtal gånger då en patient insjuknat i en annan C. difficile stam. Recidiv syntes både år 2000 och 2013 med liknande frekvens av 7 respektive 8 %. C. difficile är som tidigare nämnt sporbildande och därefter svår att avlägsna från omgivningen och risken finns att patienten blir smittad av sin omgivning igen. Brister det därav i hygienrutinerna blir denna frekvens av recidiv högre. En annan aspekt kan vara att den eventuella behandlingen inte varit effektiv på bakterien och att följa utvecklingen av resistens är därför av vikt. Den allmänna recidivfrekvensen ligger mellan 20-30 % [8, 11, 35] och frekvensen i den här studien är lägre, 8 %. Att frekvensen är lägre än normalt bekräftar att det finns en god vårdhygien och behandling i länet när det gäller fall av CDI. 12

I studien användes PCR ribotypning men det finns som tidigare nämnt olika typningssätt. Nackdelen med att använda flera olika är att det blir olika klassificeringssätt och benämning på bakterien vilket gör att det är svårare att jämföra mellan laboratorier och länder och därigenom följa epidemiologin och spridningen av bakterien. PCR ribotypning har nackdelen av att det är svårt att jämföra resultat som bandmönster mellan laboratorier. Dels därför kommer det mikrobiologiska laboratoriet på USÖ övergå till fragmentanalys av C. difficile i form av kapillärgelelektrofores (CGE). CGE är som vanlig gelelektrofores men istället för att utföras på gel utförs den i kapillärer, vanligen av glas [36]. Kapillärerna är tunna och en högre spänning kan användas vilket ger en effektivare separation av fragmenten som analyseras. Fördelarna med CGE är även att det blir mer standardiserat jämfört med PCR ribotypning och analystiderna blir snabbare [36]. PCR ribotypning ger säkra resultat och resultaten i studien är väl tillförlitliga, den största nackdelen är dock tidsåtgången när det gäller att klassificera stammar i rutinanalyser. Att övergå till en annan metod kan eventuellt ge en ökning av antal detekterade fall eller att nya stammar eller varianter upptäcks eftersom känsligheten mellan de olika metoderna tenderar att vara olika. Det bör vara med i tolkningen om en liknande studie utförs efter att en metod har ändrats eller bytts ut. År 2000 användes samma metod som i studien som presenteras här och det kan därför inte bortförklara den ökning av mängden detekterade fall som fanns år 2013. Studien har gett många intressanta resultat dels i mängden s17 och s29b som förändrat sig dramatiskt och dels att antalet CDI ökat under de 13 år som gått. Fler frågor har väckts och studien uppmanar till fortsatt undersökning främst av förklaring till den stora mängden s29b/078 i relation till spridning via mat men även undersökning hur förhållandet mellan samhällsinducerad jämfört vårdinducerad CDI skiljer sig. Studien kan även utvecklas och användas som grund till fortsatt ribotypning av resterande årsmaterial från år 2013 då de flesta epidemiologiska studier använder sig av helårsmaterial vilket skulle ge en mer korrekt jämförelse med andra studier. Trots det är resultatet tillförlitligt och relevant då C. difficile är en vanlig tarmpatogen som allt mer drabbar alla åldrar och genom epidemiologiska studier kan bemötandet av denna patogen hela tiden utvärderas och förbättras. 13

Omnämnande Stort tack till mina handledare Torbjörn Norén och Karin Johansson som har stöttat, uppmuntrat och hjälpt genom hela processen. Även ett hjärtligt tack till personalen på rutin på mikrobiologilaboratoriet, USÖ, som gav ett gott bemötande och som även utförde MALDI-TOF. Referenser 1. Norén T. Clostridium difficile epidemiology and antibiotic resistance [Avhandling]. Frölunda: DocuSys; 2006. 2. Wells CL, Wilkins TD. Clostridia: Sporeforming Anaerobic Bacilli. In: Baron S, författare. Medical Microbiology [Internet]. 4 th ed. Galveston (TX): University of Texas Medical Branch at Galveston; 1996 [citerad 2014-05-07]. Tillgänglig från: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/nbk8219/ 3. Sjukdomsinformation om clostridium difficile-infektion [Internet]. Solna: Folkhälsomyndigheten; - [uppdaterad 2013-10-17; citerad 2014-04-04]. Tillgänglig från http://www.folkhalsomyndigheten.se/amnesomraden/smittskydd-och-sjukdomar/smittsammasjukdomar/clostridium-difficileinfektion/ 4. Cassimeris L, R. Lingappa V, Plopper G. Lewin s Cells. 2nd ed. Sudbury: Jones and Bartlett Publishers, LLC; 2011. 5. Pettit LJ, Browne HP, Yu L, Smits WK, Fagan RP, Barquist L, et al. Functional genomics reveals that Clostridium difficile Spo0A coordinates sporulation, virulence and metabolism. BMC Genomics. 2014 Feb 25;15(1):160. 6. Lessa FC, Gould CV, McDonald LC. Current Status of Clostridium difficile Infection Epidemiology. Clin Infect Dis. 2012 Aug 1;55(suppl 2):S65 S70. 7. Voth DE, Ballard JD. Clostridium difficile Toxins: Mechanism of Action and Role in Disease. Clin Microbiol Rev. 2005 Apr 1;18(2):247 63. 8. Clostridium difficile [Internet]. Göteborg: internetmedicin; - [uppdaterad 2014-01-13; citerad 2014-04-04] Tillgänglig från http://www.internetmedicin.se/page.aspx?id=223 9. AB I. Clostridium difficile [Internet]. [citerad 2014-05-02]. Tillgänglig från: http://www.vardhandboken.se/texter/infektioner-imagtarmkanalen/clostridiumdifficile/ 10. Clostridium difficile-infektion [Internet]. Solna: Folkhälsomyndigheten. Tillgänglig från http://www.folkhalsomyndigheten.se/amnesomraden/statistik-ochundersokningar/sjukdomsstatistik/clostridium-difficile-infektion/ 14

11. Louie TJ, Miller MA, Mullane KM, Weiss K, Lentnek A, Golan Y, et al. Fidaxomicin versus vancomycin for Clostridium difficile infection. N Engl J Med. 2011 Feb 3;364(5):422 31. 12. Mattila E, Uusitalo-Seppälä R, Wuorela M, Lehtola L, Nurmi H, Ristikankare M, et al. Fecal transplantation, through colonoscopy, is effective therapy for recurrent Clostridium difficile infection. Gastroenterology. 2012 Mar;142(3):490 6. 13. Brandt LJ, Aroniadis OC, Mellow M, Kanatzar A, Kelly C, Park T, et al. Long-term follow-up of colonoscopic fecal microbiota transplant for recurrent Clostridium difficile infection. Am J Gastroenterol. 2012 Jul;107(7):1079 87. 14. Huber CA, Foster NF, Riley TV, Paterson DL. Challenges for Standardization of Clostridium difficile Typing Methods. Journal of Clinical Microbiology. 2013;51(9):2810. 15. Utbrott av Clostridium difficile i Växjö [Internet]. Solna: Folkhälsomyndigheten; 2014-01-08 [uppdaterad: 2014-01-23; citerad: 2014-04-28] Tillgänglig från http://www.folkhalsomyndigheten.se/nyheter-och-press/nyhetsarkiv/2014/januari/utbrott-avclostridium-difficile-i-vaxjo/ 16. Loo VG, Poirier L, Miller MA, Oughton M, Libman MD, Michaud S, et al. A Predominantly Clonal Multi-Institutional Outbreak of Clostridium difficile Associated Diarrhea with High Morbidity and Mortality. New England Journal of Medicine. 2005;353(23):2442 9. 17. Indra A, Blaschitz M, Kernbichler S, Reischl U, Wewalka G, Allerberger F. Mechanisms behind variation in the Clostridium difficile 16S-23S rrna intergenic spacer region. J Med Microbiol. 2010 Nov;59(Pt 11):1317 23. 18. Indra A, Huhulescu S, Schneeweis M, Hasenberger P, Kernbichler S, Fiedler A, et al. Characterization of Clostridium difficile isolates using capillary gel electrophoresisbased PCR ribotyping. J Med Microbiol. 2008 Nov 1;57(11):1377 82. 19. Stubbs SLJ, Brazier JS, O Neil GL, Duerden BI. PCR Targeted to the 16S-23S rrna Gene Intergenic Spacer Region of Clostridium difficile and Construction of a Library Consisting of 116 Different PCR Ribotypes. Journal of Clinical Microbiology. 1999;37(2):461. 20. Bruns DE, Ashwood ER, Burtis CA. Fundamentals of Molecular Diagnostics. St. Louis: Saunders, Elsevier; 2007. 21. InRyan K.J., Ray C. Chapter 4. Principles of Laboratory Diagnosis of Infectious Diseases., Sherris Medical Microbiology 5e. New York, NY: McGraw-Hill; 2010 [citerad 2014-04-21] Tillgänglig 15

från http://accessmedicine.mhmedical.com.db.ub.oru.se/content.aspx?bookid=375&sectionid=402 99130 22. Protokoll: Manual för rutinkörning av microflex MALDI-TOF med Biotyper RTC. Dokumentnummer 183595 version R2, tillgängligt på Laboratoriemedicinska länskliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro. 23. Noren T, Akerlund T, Back E, Sjoberg L, Persson I, Alriksson I, et al. Molecular Epidemiology of Hospital-Associated and Community-Acquired Clostridium difficile Infection in a Swedish County. J Clin Microbiol. 2004 Aug;42(8):3635 43. 24. Goorhuis A, Bakker D, Corver J, Debast SB, Harmanus C, Notermans DW, et al. Emergence of Clostridium difficile Infection Due to a New Hypervirulent Strain, Polymerase Chain Reaction Ribotype 078. Clin Infect Dis. 2008 Nov 1;47(9):1162 70. 25. Slimings C, Armstrong P, Beckingham WD, Bull AL, Hall L, Kennedy KJ, et al. Increasing incidence of Clostridium difficile infection, Australia, 2011-2012. Med J Aust. 2014 Mar 17;200(5):272 6. 26. A Ludwig KS. Concurrent outbreaks with co-infection of norovirus and Clostridium difficile in a long-term-care facility. Epidemiology and infection. 2013;1 6. 27. Dewar S, Bignardi GE, Settle C. Increase in reported Clostridium difficile cases as unintended consequence of enhanced norovirus testing. Journal of Hospital Infection. 2013 Nov;85(3):240 1. 28. McNulty C, Logan M, Donald IP, Ennis D, Taylor D, Baldwin RN, et al. Successful control of Clostridium difficile infection in an elderly care unit through use of a restrictive antibiotic policy. J Antimicrob Chemother. 1997 Nov;40(5):707 11. 29. Mayfield JL, Leet T, Miller J, Mundy LM. Environmental control to reduce transmission of Clostridium difficile. Clin Infect Dis. 2000 Oct;31(4):995 1000. 30. Mermel LA, Jefferson J, Blanchard K, Parenteau S, Mathis B, Chapin K, et al. Reducing Clostridium difficile incidence, colectomies, and mortality in the hospital setting: a successful multidisciplinary approach. Jt Comm J Qual Patient Saf. 2013 Jul;39(7):298 305. 31. Álvarez-Pérez S, Blanco JL, Peláez T, Astorga RJ, Harmanus C, Kuijper E, et al. High prevalence of the epidemic Clostridium difficile PCR ribotype 078 in Iberian free-range pigs. Research in Veterinary Science. 2013 Oct;95(2):358 61. 32. Rahimi E, Jalali M, Weese J. Prevalence of Clostridium difficile in raw beef, cow, sheep, goat, camel and buffalo meat in Iran. BMC Public Health. 2014;14(1):119. 16

33. De Boer E, Zwartkruis-Nahuis A, Heuvelink AE, Harmanus C, Kuijper EJ. Prevalence of Clostridium difficile in retailed meat in The Netherlands. International Journal of Food Microbiology. 2011 Jan;144(3):561 4. 34. Bauer MP, Notermans DW, van Benthem BH, Brazier JS, Wilcox MH, Rupnik M, et al. Clostridium difficile infection in Europe: a hospital-based survey. The Lancet. 2011 Jan 7;377(9759):63 73. 35. Cornely OA, Miller MA, Louie TJ, Crook DW, Gorbach SL. Treatment of First Recurrence of Clostridium difficile Infection: Fidaxomicin Versus Vancomycin. Clin Infect Dis. 2012 Aug 1;55(Suppl 2):S154 S161. 36. Engwall M. Kapillärelektrofores - CE - Örebro universitet [Internet]. [citerad 2014-05- 12]. Tillgänglig från: http://www.oru.se/forskning/forskningsmiljoer/miljo/ent/mtm/forskningslaborator ier-vid-mtm/kapillarelektrofores---ce/ 17