blood model Elias Heed

Institutionen för kvinnors och barns hälsa Biomedicinska analytikerprogrammet Examensarbete 15 hp Investigation of the effects of nanoparticle size on blood activation using a human whole blood model Elias Heed Handledare: Karin Fromell och Jaan Hong Institutionen för klinisk immunologi och transfusionsmedicin 1

Abstract Nanoparticles are used more and more extensively in today's society, especially in the industry sector. Humans get exposed to nanoparticles daily but the effect is a topic that has not been fully explored yet and its effect on humans is still unknown. The purpose of this project was to investigate whether the size of nanoparticles is a factor that influences their effect on humans, mainly the effect on blood activation. In order to study this, nanopaticles of polystyrene with three different sizes (75, 120 and 260 nm) were selected and incubated in a human whole blood model, the Chandler loop. The samples from the Chandler loop experiments were analysed with three different ELISA's: C3a, terminal complement complex (TCC, sc5b-9) and thrombin-antithrombincomplexes (TAT). The results in this study indicate that the smallest nanoparticle has a higher potential for activating the coagulation system than the larger ones. The complement system did not seem to be significantly activated from the nanoparticles. More experiments needs to be done in order to get a better statistic value but just as it is the results look promising and there is a tendency for a higher activation of the coagulation system with the 75 nm nanoparticles. Key words: Polystyrene, coagulation, Chandler loop, TAT, CTI 2

Introduktion Nanopartiklar används mer och mer i dagens samhälle, särskilt inom industrin, och vi människor exponeras dagligen för nanopartiklar. Forskning om nanopartiklar och dess inverkan på människokroppen är fortfarande ett område som inte utforskats fullt ut. Tidigare forskning har visat att nanopartiklar kan påverka människokroppen på ett negativt sätt men vilka faktorer som påverkar detta är fortfarande oklart. Nanopartiklar finns till exempel i luftföroreningar, kosmetika och i läkemedel i utvecklingsstadiet. Epidemiologiska studier visar att exponering för luftföroreningar är associerat med ökad mortalitet och morbiditet, både i lungsjukdomar och kardiovaskulära sjukdomar [1]. En frågeställning var att ta reda på om nanopartiklar från luftföroreningar kan ta sig från lungorna in till blodcirkulationen vilket gav ett intressant resultat. I försök på människor visar det sig att nanopartiklar lätt tar sig genom barriären i lungorna till blodomloppet [2]. Det är bekräftat att nanopartiklar kan ta sig igenom luft/blodbarriären i lungorna men även absorberas av mag/tarmkanalen och sedan vidare ut i blodsystemet [3]. När nanopartiklar kommer i kontakt med blod adsorberas proteiner till dess yta och bildar en korona runt partikeln. Hur många och vilka slags proteiner som adsorberas beror på storleken hos nanopartiklarna samt deras kemiska och fysiologiska egenskaper. När proteinerna runt vissa nanopartiklar analyseras finns det proteiner som tillhör koagulations- och komplementsystemet, delar av det ospecifika immunförsvaret. Detta beror på att det ospecifika immunförsvaret är kroppens första tillvägagångssätt för att detektera material som inte är en del av kroppen, till exempel nanopartiklar. I en studie undersöktes vilken påverkan nanopartiklars storlek kan ha främst på vilka proteiner som adsorberas och bildar en korona runt partiklarna. Resultaten visar att vilka proteiner som adsorberas till nanopartiklar inte beror på nanopartiklars storlek utan påverkas mest av vilket ämne det är och vilka kemiska 3

egenskaper det har. Exempel på proteiner som påvisas på ytan av nanopartiklar av polystyren är kininogen och fibrinogen [7]. Koagulationssystemet är en del av hemostasen, kroppens system för att förhindra eller stoppa blodförlust vid skada. Koagulationssystemet består av en rad olika proteiner, som kallas koagulationsfaktorer, och trombocyter. När koagulationssystemet aktiveras inleds kaskadreaktioner, där fler och fler faktorer aktiveras för varje steg. Det finns tre sätt som koagulationssystemet kan starta på men de leder alla till samma resultat: fibrinogen omvandlas till fibrin och bildar ett koagel tillsammans med trombocyter. Hemostasen kan delas in i två sektioner, den primära och sekundära. Det primära systemet startas av trombocyter som aktiveras genom att de binder till proteiner i det skadade området, främst kollagen. När de aktiveras utsöndrar de ämnen från granula som startar och förstärker koagulationssystemets kaskadreaktion och drar till sig fler trombocyter. Koagulationssystemet aktiveras även av kontaktsystemet (intrinsicsystemet) genom att faktor XII binder till en yta och aktiveras till faktor XIIa eller genom att faktor VII kommer i kontakt med tissue factor och aktiveras till VIIa. När koagulationsfaktor XII kommer i kontakt med främst negativt laddade okända ytor aktiveras den till faktor XIIa som sedan aktiverar faktor XI. Detta leder i sin tur till att kaskadreaktionerna i koagulationssystemet startar, vilket till slut till gör att fibrin bildar ett koagel. Faktor XII kan även initiera ett annat system, kalikreinsystemet. När kininogen med hög molekylvikt och prekalikrein aktiveras av faktor XII bildas en peptid som heter bradykinin. Bradykinin kan starta inflammation, öka cellproliferation och migration samt öka den vaskulära permeabiliteten. Bradykinin har sedan tidigare kopplats till autoimmunitet, kardiovaskulära sjukdomar och cancer [18]. I en annan studie undersöktes det om nanopartiklars storlek och krökning, graden böjning hos partiklarnas yta, kan påverka koagulationssystemet i humant blod. De har två hypoteser om vilken effekt storlek och krökning hos nanopartiklar har. Den första är att små nanopartiklars krökning kan förhindra komplexet som aktiverar kontaktsystemet att bildas korrekt. Den andra är att funktionerna hos de proteiner som adsorberas till nanopartiklarna modifieras av 4

konformationsförändringar eller att den aktiva ytan blir steriskt störd, det vill säga elektronmoln som repellerar varandra. De resultat de fick fram är att nanopartiklar både kan ha positiv och negativ påverkan av koagulationssystemet. Små nanopartiklar som har mindre krökning (26 och 60 nm) ger liten eller till och med minskad aktivitet av koagulationssystemet. De större nanopartiklarna (90 och 220 nm) ger ökad aktivering av koagulationssystemet [5]. I ytterligare en studie som också undersöktes hur krökning och storlek hos nanopartiklar kan påverka koagulationssystemet hos människor gav liknande resultat. Man kom fram till att små nanopartiklar med hög krökning inte gav någon aktivering av koagulationssystemet medan stora nanopartiklar med låg krökning aktiverade koagulationssystemet. Detta berodde på att faktor XII genomgick en konformationsförändring på de större nanopartiklarnas yta men inte på de små vilket förmodligen berodde på att proteinerna inte kunde adsorberas ordentligt till ytan [6]. Komplementsystemet är en del av det ospecifika immunförsvaret, kroppens första försvarslinje mot okända ämnen. Komplementsystemet består av över 30 olika proteiner som finns lösta i blodplasman eller på cellmembran. De funktioner som komplementsystemet har är att försöka lysera bakterier, märka in (opsonera) ämnen för fagocytos, eliminera cirkulerande immunkomplex i blodet, vara stöd för det specifika immunförsvaret samt underlätta kemotaxi. När komplementsystemet aktiveras sker det genom kaskadreaktioner. Systemet kan starta via tre sätt, den klassiska vägen, den alternativa vägen och lektinvägen. Den klassiska vägen aktiveras via immunkomplex, till exempel att det sitter flera IgG på en främmande mikroorganism. Lektinvägen aktiveras när lektin binder till mannos, glukos eller andra sockermolekyler som kan finnas på ytan hos mikroorganismer. Den alternativa vägen aktiveras när C3 (komplementfaktor) kommer i kontakt med okända ytor. Komplementsystemet kan aktiveras när plasmaproteiner adsorberas till okända ytor vilket i sin tur startar den klassiska vägen för komplementaktivering. Det kan ske antingen genom IgG eller adsorberat C1q eller C3. Både koagulations- och komplementsystemet kan påskynda 5

upptaget av nanopartiklar i kroppen, orsaka kronisk inflammation efter längre perioder av exponering av nanopartiklar samt underlätta transport av nanopartiklar in i celler. Nanopartiklar kan ha en rad negativa konsekvenser för den mänskliga kroppen och de främsta är kronisk inflammation och cancer [4,16]. Om nanopartiklarna har en avlång form kan de ge skador på lungorna som liknar de som uppkommer vid exponering av asbest. Detta uppkommer då till exempel makrofager försöker fagocytera de främmande partiklarna men istället för att omsluta partiklarna blir makrofagerna perforerade av partiklarnas form och en inflammation startar [17]. För att undersöka om storleken hos nanopartiklar har någon inverkan på kaskadsystem i humant blod bör en relativt inert nanopartikel väljas så att inte själva ämnet kan påverka resultat. De nanopartiklar som valdes till denna studie var av polystyren eftersom de anses vara relativt inerta. Den metod som utgör själva grunden i denna studie för att undersöka nanopartiklars inverkan på människor är helblodsmodellen Chandler loop [8,9]. I tidigare studier har Chandler loop till exempel använts till att testa hur humant helblod reagerar mot olika material som stentar för kärlvidgning i hjärtats kranskärl. Anledningen till att denna metod valdes är att principen bakom gör den lämplig till detta experiment. Principen bakom Chandler loop är att i så stor mån som möjligt simulera samma förhållanden som råder i människokroppen. För att få samma temperatur som i människokroppen används en inkubator som är inställd på 37 C och för att hålla blodet i rörelse så används en rotor som roterar looparna i 30 rpm. Att tillsätta antikoagulant för att blodet inte ska reagera mot looparna går inte eftersom detta kan skapa interferens hos ett av systemen som undersöktes, koagulationssystemet. Detta problem löses med en annan metod där allt material som kommer i kontakt med blod prepareras genom heparinisering. Principen bakom denna metod är att belägga olika material med ett lager av immobiliserat heparin. Heparin är väldigt likt ett ämne som finns i våra blodkärl som heter heparansulfat vars funktion är att kontrollera koagulationssystemet. Det kan göra detta genom att binda till antitrombin vilket ökar dess 6

förmåga att binda till trombin flerfaldigt. Genom att applicera denna metod till Chandler loop så behöver det inte tillsättas antikoagulant till blodet. Chandler loop är metoden som används vid själva experimentet men för att få ut resultat från experimenten så används tre olika ELISAs: C3a, TCC (Terminal Complement Complex) och TAT (Trombin Antitrombin). I detta projekt fokuserades det främst på att undersöka om nanopartiklars storlek och krökning hade någon betydelse för deras interaktion med humant helblod. 7

Material och metod Heparinisering Allt material som kom i kontakt med blod hepariniserades innan användning, till exempel falconrör, pipettspetsar och provtagningsslang. Det första steget i heparinisering var att rengöra materialet genom att låta det ligga i en 5 % w/v lösning av amoniumperoxidsulfat i 60 minuter i 60 C för att sedan sköljas minst 5 gånger i MQ-vatten (Millipore quality). Detta steg utfördes inte om materialet var sterilt innan. Därefter placerades materialet i en lösning av PAV (Polyamine, Corline, 0,25 mg/ml i borat buffert) i 15 minuter i rumstemperatur för att därefter sköljas med MQ-vatten minst 5 gånger. Sedan placerades materialet i en lösning med heparinkonjugat (Corline, 0,05 mg/ml i 0,1 M acetat buffert/0,5 M NaCl, ph 4) i minst 60 minuter i rumstemperatur följt av sköljning i MQ-vatten minst 5 gånger. Sedan upprepades momenten med PAV och heparinkonjugat med sköljning av MQ-vatten minst 5 gånger emellan och efteråt. PAV och heparinkonjugat återanvändes upp till 5 gånger. Därefter inkuberades materialet med boratbuffert (9,5 g di-sodiumtetraborat Decahydrate/L, ph 9) i 15 minuter i rumstemperatur. Efteråt hälldes lösningen bort och materialet inkuberades med en blandning av boratbuffert och acetatanhydrid (ph 10,5, 1 µl anhydrid/ml boratbuffert) i 10 minuter i rumstemperatur. Sedan sköljdes materialet med MQvatten minst 5 gånger och lufttorkades. Sist kontrollerades det om hepariniseringen var lyckad genom att låta en liten bit material inkubera med ToulidineBlue (2 mg/ml späddes 1:10 med MQ-vatten) i 2-3 minuter och sedan sköljas med MQ-vatten. Karaktärisering av nanopartiklar Nanopartiklar (Life technologies) av polystyren var i storlekarna 60, 100 samt 200 nm enligt de dokument företaget tillhandahöll. Storlekarna på nanopartiklarna och deras laddning kontrollerades med hjälp av photon correlation spectroscopy (Malven zeta sizer) vid Ångströmlaboratoriet, Uppsala universitet. När kontrollen utfördes späddes alla prover 1/1000 8

i plastkyvetter och en medföljande elektrod placerades i kyvetterna innan analys. Elektroden rengjordes med MQ-vatten mellan varje prov och efter avslutad analys. Helblodsmodell, Chandler loop Laboratoriet har sedan tidigare etikprövats och fått godkänt för blodtappning från friska frivilliga. Först och främst förbereddes allt material som behövdes innan blod togs från blodgivare. Eppendorfrör fylldes med 30 µl EDTA (0,2 M, ph 7,4). Heparinslangar (Corline) med 4 mm innerdiameter klipptes i 20 cm långa segment. Sedan sattes två stycken stödringar av metall per slang runt dem samt en konnektor per slang i dem. Blodgivare kom direkt till labbet varefter blod togs venöst. Blodet som användes för experimentet samlades i ett hepariniserat falconrör (45 ml) och provtagningsslangen som användes var hepariniserad. De första 2 ml blod som kom samlades i ett separat falconrör (15 ml) och kastades på grund av att nålen kan ha skapat en liten aktivering av koagulations- och komplementsystemet. Blodet användes i experimentet så snabbt som möjligt. Suspensioner med nanopartiklar (Life technologies) med olika storlek men samma area förbereddes. Därefter tillsattes 2 ml blod från en blodgivare i varje heparinslang tillsammans med ett fåtal µl nanopartiklar eller lika stor mängd MQ-vatten (blank) som partikelsuspension. Sedan slöts slangen till en loop och den inkuberades i ett värmeskåp samtidigt som det roterades av en motor (Masterflex) med tillhörande rotationsplatta (tillverkad på Biomedicinskt centrum). Inkubationstiden var 1 timme, temperaturen var 37 C och rotationshastigheten var 30 rpm. Det utfördes även ett experiment där CTI (Corn trypsin inhibitor) tillsattes till looparna med nanopartiklar. CTI inhiberar faktor XII och experimentet utfördes för att undersöka om det var faktor XII som initierade koagulationssystemet. Utöver det så fördes det över 1 ml blod per rör till två stycken eppendorfrör för att agera som nollprov. 9

Under inkubationen analyserades nollproven med en cellräknare, XP-300 (Sysmex), och alla värdena noterades (LPK, EPK och så vidare) men det var främst trombocytvärdena som var relevanta till denna studie. När inkubationstiden var över togs looparna ut och dess innehåll hälldes ned i medicinkoppar, varefter förekomst av synligt koagel undersöktes. Sedan fördes 1 ml blod från varje loop över till ett förberett eppendorfrör med EDTA som därefter analyserades med cellräknaren. Proverna centrifugerades därefter i 15 minuter i 4 C i 4500 x g. Därefter samlades plasman och placerades i separata eppendorfrör för infrysning i -70 C [8,9]. Kammarförsök I jämförande syfte utfördes det helblodsförsök med hjälp av kammare som liknade helblodsförsöken i Chandler loop. Allt material som kom i kontakt med blod hepariniserades enligt instruktionen ovan (kammare, lock, provtagningsslang och så vidare). När allt material var förberett så kom en blodgivare direkt till labbet för att ge blod. Varje kammare (specialtillverkad) har 2 stycken cirkulära brunnar som rymmer 1,75 ml vätska vardera, till varje kammare tillsattes 1,5 ml blod, till 3 kammare tillsattes även suspensioner av nanopartiklar, i en annan tillsattes ingenting för att agera som negativ kontroll och i den sista tillsattes ingenting heller men istället för ett vanligt lock användes en yta av polystyren. Därefter inkuberades kamrarna i 37 C, 30 rpm, i 60 minuter med hjälp av en vågmaskin (incubating waver, VWR). Sedan fördes 1 ml blod från varje brunn över till eppendorfrör med EDTA i för att sedan avläsas med cellräknare. Därefter centrifugerades proverna, plasman separerades och frystes in i -70 C. Därefter utfördes de tre ELISAs som nämns i denna del på plasman. 10

ELISA Spädningsbuffert (1 g BSA/100 ml tvättbuffert + 5 ml 0,2 M EDTA) och tvättbuffert (0,05 % Tween 20 i PBS) var samma i samtliga ELISAs. TMB (3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine, Surmodics), stopplösning (1M H 2 SO 4 ) och spektrofotometer (Multiskan EX, Thermo) var samma i samtliga ELISAs. Plattorna lästes av i våglängden 450 nm. C3a Det första steget var att varje brunn i en 96-hålsplatta coatades med 100 µl av den monoklonala antikroppen 17,3 (tillverkad på labb, 1/600 i PBS) och inkuberades sedan i 4 C över natt. Dagen efter tillsattes 200 µl spädningsbuffert till varje brunn för blockering. Därefter inkuberades plattan i rumstemperatur i 60 minuter på en skakmaskin. Därefter tillsattes alla prover, kontroller, standarder och blankprover till respektive plats i plattan, allting kördes med dubbelprover. I varje brunn tillsattes 100 µl prov. Proverna späddes 1/1000 med spädningsbuffert, den höga kontrollen var färdigspädd, den normala kontrollen späddes 1/1000 med spädningsbuffert och standarden var färdigspädd. Sedan inkuberades plattan på skak i rumstemperatur under 60 minuter. Därefter tillsattes 100 µl biotinylerad antic3a (tillverkad på labb, 1/800 i spädningsbuffert) till varje brunn. Sedan inkuberades plattan på skak i rumstemperatur i 60 minuter. Sedan tillsattes 100 µl streptavidin HRP (GE Healthcare, 1/500 i spädningsbuffert) till varje brunn varefter plattan inkuberades på skak i rumstemperatur i 15 minuter. De sista stegen var att 100 µl TMB tillsattes till varje brunn och inkuberades i rumstemperatur i 5 minuter. Sedan stoppades reaktionen med 100 µl stopplösning och plattan lästes av. 11

TCC Det första steget var att varje brunn i en 96-hålsplatta coatades med 100 µl av den monoklonala antikroppen Hu C5b-9 (Diatec, 1/1500 i PBS) och inkuberades sedan i 4 C över natt. Dagen efter tillsattes 200 µl spädningsbuffert till varje brunn för blockering. Därefter inkuberades plattan i rumstemperatur i 60 minuter på en skakmaskin. Därefter tillsattes alla prover, kontroller, standarder och blankprover till respektive plats i plattan, allting kördes med dubbelprover. I varje brunn tillsattes 100 µl prov. Proverna späddes 1:5 med spädningsbuffert, kontrollerna var färdigspädda och standarden späddes först 1:100 och sedan med den som bas i en seriespädning 1:2, 1:2, 1:2 och så vidare. Sedan inkuberades plattan på skak i rumstemperatur under 60 minuter. Därefter tillsattes 100 µl biotinylerad antic5 (Biosite, spädning varierar mellan olika batcher) till varje brunn. Sedan inkuberades plattan på skak i rumstemperatur i 60 minuter. Sedan tillsattes 100 µl streptavidin HRP (GE Healthcare, 1/500 i spädningsbuffert) till varje brunn varefter plattan inkuberades på skak i rumstemperatur i 15 minuter. De sista stegen var att 100 µl TMB tillsattes till varje brunn och inkuberades i rumstemperatur i 5 minuter. Sedan stoppades reaktionen med 100 µl stopplösning och plattan lästes av. TAT Det första steget var att varje brunn i en 96 hålsplatta coatades med 50 µl av den monoklonala antikroppen får antitrombin (Enzyme research laboratories, 1/125 i PBS) och inkuberades sedan i 4 C över natt. Dagen efter tillsattes 150 µl spädningsbuffert till varje brunn för blockering. Därefter inkuberades plattan i rumstemperatur i 60 minuter på en skakmaskin. Därefter tillsattes alla prover, kontroller, standarder och blankprover till respektive plats i plattan, allting kördes med dubbelprover. I varje brunn tillsattes 50 µl prov. Proverna späddes 12

beroende på trombocytvärdena med CPD-plasma (tillverkad på labb) och sedan spädningsbuffert, den höga kontrollen späddes 1:2 med spädningsbuffert, den låga kontrollen späddes 1:10 med spädningsbuffert, CPD kontrollen späddes 1:4 med spädningsbuffert och standarden späddes först 1:2 i en seriespädning med CPD-plasma, 150 µl spädningsbuffert tillsattes till varje standard. Sedan inkuberades plattan på skak i 37 C under 120 minuter. Därefter tillsattes 50 µl av antikroppen får antitrombinperoxidas (Enzyme research laboratories, 1/125 i spädningslösning för konjugat, Enzyme research laboratories) till varje brunn. Sedan inkuberades plattan på skak i 37 C i 60 minuter. De sista stegen var att 100 µl TMB tillsattes till varje brunn och inkuberades i rumstemperatur i 5 minuter. Sedan stoppades reaktionen med 100 µl stopplösning och plattan lästes av. Statistik Spektrofotometriprogrammet Ascent räknade ut medelvärde samt standardavvikelse. Figurerna skapades med hjälp av programmet GraphPad Prism 6. Oparade t-tester med signifikansnivån P <0,05 utfördes även med detta program. 13

Resultat Karaktärisering av nanopartiklar För att karaktärisera nanopartiklarna av polystyren i studien användes metoden photon correlation spectroscopy (dynamisk ljusspridning). Resultatet visade att nanopartiklarna som enligt tillverkaren hade den påstådda storleken 60, 100 och 200 nm egentligen hade storleken 75, 120 och 262 nm. Alla nanopartiklar hade samma laddning. Helblodsmodell Chandler loop och ELISA I det första experimentet som utfördes med Chandler loop användes suspensioner av de tre nanopartiklarna 262 nm, 120 nm och 60 nm med en total area på 100 cm 2 och MQ-vatten tillsattes till en loop för att agera som blank. Blod som inte användes i loopen användes för att få initiala värden på blodet. När experimentet var utfört separerades plasma och frystes in i - 70 C för vidare analys. Plasman analyserades för C3a, TCC och TAT. Resultatet från det första experimentet var att nanopartiklarna med 262 nm hade ett medelvärde på 963 µg/l C3a, 80 AU/L TCC och 74 µg/l TAT. Nanopartiklarna med 120 nm hade ett medelvärde på 797 µg/l C3a, 74 AU/L TCC och 80 µg/l TAT. Nanopartiklarna med 75 nm hade ett medelvärde på 793 µg/l C3a, 55 AU/L TCC och 154 µg/l TAT. Totalt startades 30 prover men ett fåtal gick förlorade. Det andra experimentet som utfördes var identiskt med experiment ett förutom att suspensionerna av nanopartiklar hade en total area på 500 cm 2. Även i detta experiment var det totalt 30 prover där ett fåtal gick förlorade. Samma tre ELISA som utfördes på experiment ett användes också i experiment två och resultatet var att nanopartiklarna med 262 nm hade ett medelvärde på 923 µg/l C3a, 24 AU/L TCC och 69 µg/l TAT. Nanopartiklarna med 120 nm hade ett medelvärde på 755 µg/l C3a, 11 AU/L TCC och 101 µg/l TAT. Nanopartiklarna med 75 nm hade ett medelvärde på 859 µg/l C3a, 11 AU/L TCC och 145 µg/l TAT. Resultaten kan ses i figur 1, 2 och 3. 14

g/l Oparade t-tester utfördes på resultaten från dessa experiment för att jämföra skillnaden mellan dem. Detta visade att det finns en signifikant skillnad mellan de initiala värdena och resterande värden men det finns ingen signifikant skillnad mellan nanopartiklarna 262 nm och 75 nm. Till exempel så var värdet mellan 262 nm och 75 nm i TAT med 100 cm 2 0,298 och i 500 cm 2 0,0833. 1500 1000 500 0 Initial Blank 262 nm 120 nm 75 nm Initial Blank 262 nm 120 nm 75 nm Figur 1: Resultat för C3a med Chandler loop. Y-axeln visar mängden i µg/l. Experiment med suspensioner av tre olika sorters nanopartiklar med den totala arean 100 cm 2 motsvaras av de svarta kolumnerna och lösningar med totala arean 500 cm 2 motsvaras av de grå kolumnerna. Koncentrationen är µg/l och linjerna ovanför kolumnerna visar standardavvikelsen. Det fanns ingen signifikant skillnad mellan nanopartikel 262 nm och 75 nm. 15

AU/L 150 100 50 0 Initial Blank 262 nm 120 nm 75 nm Initial Blank 262 nm 120 nm 75 nm Figur 2: Resultat för TCC med Chandler loop. Y-axeln visar mängden i AU/L. Experiment med suspensioner av tre olika sorters nanopartiklar med den totala arean 100 cm 2 motsvaras av de svarta kolumnerna och lösningar med totala arean 500 cm 2 motsvaras av de grå kolumnerna. Koncentrationen är AU/L och linjerna ovanför kolumnerna visar standardavvikelsen. Det fanns ingen signifikant skillnad mellan nanopartikel 262 nm och 75 nm. g/l 250 200 150 100 50 0 Initial Blank 262 nm 120 nm 75 nm Initial Blank 262 nm 120 nm 75 nm Figur 3: Resultat för TAT med Chandler loop. Y-axeln visar mängden i µg/l. Experiment med suspensioner av tre olika sorters nanopartiklar med den totala arean 100 cm 2 motsvaras av de svarta kolumnerna och lösningar med totala arean 500 cm 2 motsvaras av de grå kolumnerna. Koncentrationen är µg/l och linjerna ovanför kolumnerna visar standardavvikelsen. Ingen signifikant skillnad mellan nanopartikel 262 nm och 75 nm noterades. 16

g/l AU/L g/l Vid ett senare tillfälle utfördes ett tredje experiment med Chandler loop och ELISA. Arean hos suspensioner med nanopartiklar som användes var 500 cm 2 men CTI tillsattes även till samtliga loopar. Totalt användes tio prover i experimentet, av dessa hade nio tillräckligt hög kvalitet för analys. Efter experimentet analyserades plasman med de tre ELISAs som användes i tidgare experiment. Resultatet var att nanopartiklarna med 262 nm hade ett medelvärde på 2672 µg/l C3a, 110 AU/L TCC och 27 µg/l TAT. Nanopartiklarna med 120 nm hade ett medelvärde på 2141 µg/l C3a, 72 AU/L TCC och 60 µg/l TAT. Nanopartiklarna med 75 nm hade ett medelvärde på 1383 µg/l C3a, 48 AU/L TCC och 152 µg/l TAT. Resultaten visas i figur 4. A B C 3000 150 250 200 2000 100 150 1000 50 100 50 0 Initial Blank 262 nm 120 nm 75 nm 0 Initial Blank 262 nm 120 nm 75 nm 0 Initial Blank 262 nm 120 nm 75 nm Figur 4: C3a fig A, TCC fig B och TAT fig C. Koncentrationen på Y-axeln är µg/l i TAT och C3a. Koncentrationen är AU/L i TCC. Suspensioner av nanopartiklar med den totala arean 500 cm 2 användes. De grå kolumnerna representerar de loopar som innehöll CTI och de svarta är loopar utan CTI, de som tidigare analyserats. Linjerna ovanför kolumnerna visar standardavvikelsen. Kammarförsök och ELISA Med syftet att undersöka om det blir en starkare reaktion mot en solid yta polystyren än naopartiklar användes en helblodsmodell med flera kammare. Fem kammare användes med två brunnar i varje kammare. Suspensioner med nanopartiklar tillsattes till tre kammare, blank 17

g/l AU/L tillsattes till en och den sista fick kontakt med en solid yta av polystyren. Totalt var det 24 prover som användes men några få förlorades vid experimentet. Efter experimentet användes de tre ELISA som tidigare använts för att analysera nivåerna av TAT, TCC och C3a. Resultatet var att nanopartiklarna med 262 nm hade ett medelvärde på 577 µg/l C3a, 118 AU/L TCC och 304 µg/l TAT. Nanopartiklarna med 120 nm hade ett medelvärde på 500 µg/l C3a, 37 AU/L TCC och 153 µg/l TAT. Nanopartiklarna med 75 nm hade ett medelvärde på 512 µg/l C3a, 47 AU/L TCC och 488 µg/l TAT. Den solida ytan hade ett medelvärde på 410 µg/l C3a, 25 AU/L TCC och 87 µg/l TAT. Resultaten visas i figur 5. A B C 800 150 800 600 400 100 g/l 600 400 200 50 200 0 Initial Blank 262 nm 120 nm 75 nm Solid 0 Initial Blank 262 nm 120 nm 75 nm Solid 0 Initial Blank 262 nm 120 nm 75 nm Solid Figur 5: C3a fig A, TCC fig B, och TAT fig C. Koncentrationen på Y-axeln är µg/l i C3a och TAT, AU/L i TCC. Den totala arean på suspensionerna av nanopartiklar som användes är 3 cm 2, samma area som blodet med hel yta blir utsatt för. Medelvärde + standardavvikelsen. 18

Diskussion Syftet med denna studie var att med hjälp av metoderna Chandler loop, PCS/Zeta potential, kammare och ELISA undersöka om nanopartiklars storlek är en faktor som påverkar nanopartiklarnas förmåga att aktivera blodets kaskadsystem. Resultaten från Chandler loop experimenten med totalyta på 100 och 500 cm 2 pekar på att komplementsystemet inte reagerade så starkt mot nanopartiklarna då kontrollopar gav likvärdiga nivåer. Koagulationssystemet däremot verkade aktiveras mycket, starkare mot nanopartiklarna med storleken 75 nm än de större partikelstorlekarna. Den totala ytarean på partiklarna verkar inte ha påverkat resultatet så mycket vilket kan ses i resultatet från TAT. Resultaten från experimenten med CTI verkar peka på att när koagulationssystemet inhiberades så aktiverades komplementsystemet mer. Det syntes ingen markant skillnad mellan TAT-nivåerna vilket kan bero på att koagulationssystemet redan hade blivit aktiverat innan experimentet startade. En förklaring kan vara att alltför lång tid förflutit mellan blodtappning och experiment. En svaghet med denna del är att bara ett experiment utfördes vilket gör att man inte kan dra alltför starka slutsatser från resultaten. Resultaten som erhölls från kammarförsöken verkar peka mot ungefär samma resultat som från loopförsöken, intressant nog gav nanopartiklarna mer reaktion än när blodet utsattes för en solid yta av polystyren. Fördelen med att använda Chandler loop är att det ger en bra simulering av förhållandena som råder inne i våra blodkärl samt att man inte behöver tillsätta antikoagulant som kan skapa interferens i de system som undersöktes. En nackdel med Chandler loop är att även om den simulerar samma förhållanden som finns i kroppen så har den en faktor som kan påverka, det vill säga att blodet kommer i kontakt med luft vilket skapar en yta där protein kan denaturera. Detta gör att även blodtappningen är en kritisk del av experimentet. En annan nackdel är att heparinisering kan misslyckas om man inte kontrollerar lösningarna som används i det 19

momentet noga. För att komma över problemet med hepariniseringen så måste man noga kontrollera CHC och PAV innan användning, om fällning observeras i lösningarna måste de kastas och nya prepareras. Ett annat problem som dök upp med Chandler loop var vid tillsättning av blod till looparna. Blodet måste tillsättas med konstant hastighet och pipettspetsen måste vara i kontakt med en av insidorna av loopen och inte ta upp hela loopöppningen. Om detta inte görs så kan det bildas många små luftbubblor i loopen istället för en stor vilket kan resultera i att blodet inte roterar vid inkubation. Om blodet inte roterar så koagulerar det och loopen blir oanvändbar för vidare analys. Med övning, tid och erfarenhet så lär man sig att överkomma dessa problem. I en annan studie där nanopartiklar av en annan sort (kiseldioxid) studerades används en annan metod. De använder djurförsök med möss [10]. Fördelarna med att använda djurförsök istället för Chandler loop är att blodet inte exponeras för någonting annat än det som det är ämnat att exponeras för, vilket i detta fall är nanopartiklar. De nackdelar som finns är att de undersöker hur djur påverkas och inte människor, djurförsök är ett bra första steg men det betyder inte att resultaten man ser hos dem går att replikera i människor. En andra nackdel är att man potentiellt utsätter mössen för lidande. Chandler loop kan sägas vara en metod som används innan djurförsök. Det ger inblick i hur helblod reagerar mot det materialet. I en liknande studie där det används nanopartiklar av kisel gav det liknande resultat och konklusion som i denna studie. Små nanopartiklar mellan 30-70 nm kunde aktivera koagulationssystemet [11]. I en andra studie där de använde samma sorts nanopartiklar som denna studie, polystyren, får även de fram resultat som pekar mot detta. Nanopartiklar som är större än 60 nm är betydligt mindre reaktiva mot blodsystemen [12]. I en studie där nanopartiklar av silver med endast en storlek användes produceras det rätt så intressanta resultat. Silverpartikelns storlek är 24 nm och ger ingen aktivering av 20

koagulationssystemet och har potentiellt en inhibitorisk påverkan på intrinsicsystemet [13]. Detta kan relateras till vår och andra studiers resultat att det kanske finns ett optimum för storleken hos nanopartiklar med avseende på koagulationsaktivering. I två liknande studier undersöktes det hur ett poröst material av aluminium påverkar koagulations- och komplementsystemet. Resultatet de kom fram till är att små porer (20 nm) är mer koagulationsaktiverande och stora porer (200 nm) aktiverar komplementsystemet [14, 15]. Detta liknar resultatet som uppkom i denna studie. Betydelsen av de resultat som kommit fram i denna studie för framtida diagnostik är att storleken hos nanopartiklar påverkar graden aktivering hos koagulationssystemet och man bör då bestämma en storlek hos nanopartiklarna som passar syftet. Behöver du nanopartiklar som är inerta eller till och med kan ge inhibitorisk verkan på koagulationssystemet? Välj väldigt stora nanopartiklar >200 nm. Vill du ha en partikel som ger hög aktivering av koagulationssystemet? Välj en partikel runt 60-70 nm. De saker som fortfarande kan göras och förbättras med studien är att köra fler försök med CTI för att verkligen bekräfta att det är faktor XII som sätter igång koagulationssystemet. Att köra fler försök generellt bör göras och ha en större pool av blodgivare för att få bättre och bättre statistiska värden. En annan sak att göra är att testa andra storlekar på nanopartiklarna, kanske till exempel mindre storlek. De resultat som erhölls i vår studie var väldigt intressanta i relation till syftet av projektet. De visar att storleken hos nanopartiklar har betydelse för aktiveringen av koagulationssystemet men om koagulationssystemet påverkas i signifikant grad är fortfarande oklart. Sammanfattningsvis visar resultaten som kom fram i studien är trenden som syns i loopförsöken med TAT. Det verkar indikera på att det finns särskilda storleksintervall där nanopartiklar ger mer eller mindre aktivering av koagulationssystemet. 21

Referenser [1] Samet JM, et al. Fine particle air pollution and mortality in 20 U.S. cities, 1987-1994. N Engl J Med. 2000; 343; 1742-1749. [2] Nemmar A, et al. Passage of inhaled particles into the blood circulation in humans. Circulation. 2002;105:411-414. [3] Wang J, et al. Acute toxicity and biodistribution of different sized titanium dioxide particles in mice after oral administration. Toxicology letters. 2007; 168; 176-85. -passage till blod [4] Ekstrand-Hammarström B, et al.tio 2 nanoparticles tested in a novel screening whole human blood model of toxicity trigger adverse activation of the kallikrein system at low concentrations. Biomaterials. 2015 May;51:58-68. [5] Sanfins E, et al. Size-dependant effects of nanoparticles on enzymes in the blood coagulation cascade. Nano Letters. 2014 Aug 13;14(8):4736-44. [6] Kushida T, et al. Effect of nano-scale curvature on the intrinsic blood coagulation system. Nanoscale. 2014 Nov 6;6(23):14484-7. [7] Lundqvist M, et al. Nanoparticle size and surface properties determine the protein corona with possible implications for biological impacts. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Sep 23;105(38):14265-70. [8] Christensen K, et al. Improved blood compatibility of a stent graft by combining heparin coating and abciximab. Thrombosis Research. 2005:115: 245-253. 22

[9] Larsson R, Larm O, Olsson P. The search for thromboresistance using immobilized heparin. An Ne Yo Aca Of Sci. 1987 [10] Nemmar A, et al. Amorphous silica nanoparticles impair vascular homeostasis and induce systemic inflammation. Int J Nanomedicine. 2014; 9: 2779 2789. [11] Yoshida T, et al. Intranasal exposure to amorphous nanosilica particles could activate intrinsic coagulation cascade and platelets in mice. Part Fibre Toxicol. 2013; 10: 41. [12] Mayer A, et al. The role of nanoparticle size in hemocompatibility. Toxicology. 2009 April 28; 258; 139-147. [13] Martínez-Gutierrez F, et al. Antibacterial activity, inflammatory response, coagulation and cytotoxicity effects of silver nanoparticles. Nanomedicine. 2012; 8; 328-336. [14] Ferraz N, Hong J, Karlsson M. Procoagulant Behavior and Platelet Microparticle Generation on Nanoporous Alumina. Jour of biomat appli. 2010 May; 24; 675-692. [15] Ferraz N, et al. Nanoporesize affects complement activation. Jour of biom mat res. 2008 January; 87A; 575-581. [16] Eun-Jung P, et al. Induction of chronic inflammation in mice treated with titanium dioxide nanoparticles by intratracheal instillation. Toxicology. 2009 June; 260; 37-46. 23

[17] Ken-Ichiro I, et al. Effects of Pulmonary Exposure to Carbon Nanotubes on Lung and Systemic Inflammation with Coagulatory Disturbance Induced by Lipopolysaccharide in Mice. Exp Biol Med. 2008 December; 233; 1583-1590. [18] Yi Wu. Contact pathway of coagulation and inflammation. Thromb J. 2015; 13: 17. 24